徐纹静, 陈志, 陈磊, 林金萍, 魏东芝
华东理工大学 生物工程学院，上海 200237
收稿日期：2020-11-09；接收日期：2021-02-19
基金项目：上海市自然科学基金(No. 19ZR1412700) 资助

摘要：作为一类多功能生物催化剂，卤醇脱卤酶在手性β-取代醇和环氧化合物合成应用方面备受关注。目前催化功能较为清楚的卤醇脱卤酶不足40种，且绝大部分催化性能并不能满足科学研究和实际应用的要求，因此挖掘并鉴定更多的卤醇脱卤酶具有重要意义。本文克隆表达了来源于红螺菌科细菌Rhodospirillaceae bacterium中一个假定卤醇脱卤酶(HHDH-Ra) 并对其催化特性以及酶学性质进行研究。将HHDH-Ra基因克隆到表达宿主大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，结果显示目的蛋白为可溶性表达。底物特异性研究显示HHDH-Ra对1, 3-二氯-2-丙醇(1, 3-DCP)和4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE) 具有良好的特异性。以1, 3-DCP为反应底物获得HHDH-Ra的最适pH和最适温度分别为8.0和30 ℃。pH稳定性结果显示HHDH-Ra在pH 6.0–8.0具有较好的稳定性且经过100 h处理以后仍能保持70%左右的酶活。温度稳定性结果显示HHDH-Ra在30 ℃、40 ℃条件下的半衰期为60 h，且当温度提高到50 ℃时，该酶的半衰期仍有20 h，远高于已报道的酶。因此，来源于Rhodospirillaceae bacterium新型卤醇脱卤酶具有较好的温度、pH稳定性以及催化活性，在合成关键化学、医药中间体中具有一定的应用潜力。
关键词：卤醇脱卤酶β-取代醇1, 3-二氯-2-丙醇(S/R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯
Expression and characterization of a novel halohydrin dehalogenase from Rhodospirillaceae bacterium
Wenjing Xu, Zhi Chen, Lei Chen, Jinping Lin, Dongzhi Wei
School of Biotechnology, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China
Received: November 9, 2020; Accepted: February 19, 2021
Supported by: Natural Science Foundation of Shanghai, China (No. 19ZR1412700)
Corresponding author: Jinping Lin. E-mail: Jinping_l123@163.com.

Abstract: As a class of multifunctional biocatalysts, halohydrin dehalogenases are of great interest for the synthesis of chiral β-substituted alcohols and epoxides. There are less than 40 halohydrin dehalogenases with relatively clear catalytic functions, and most of them do not meet the requirements of scientific research and practical applications. Therefore, it is of great significance to excavate and identify more halohydrin dehalogenases. In the present study, a putative halohydrin dehalogenase (HHDH-Ra) from Rhodospirillaceae bacterium was expressed and its enzymatic properties were investigated. The HHDH-Ra gene was cloned into the expression host Escherichia coli BL21(DE3) and the target protein was shown to be soluble. Substrate specificity studies showed that HHDH-Ra possesses excellent specificity for 1, 3-dichloro-2-propanol (1, 3-DCP) and ethyl-4-chloro-3-hydroxybutyrate (CHBE). The optimum pH and temperature for HHDH-Ra with 1, 3-DCP as the reaction substrate were 8.0 and 30 ℃, respectively. HHDH-Ra was stable at pH 6.0–8.0 and maintained about 70% of its original activity after 100 h of treatment. The thermal stability results revealed that HHDH-Ra has a half-life of 60 h at 30 ℃ and 40 ℃. When the temperature is increased to 50 ℃, the enzyme still has a half-life of 20 h, which is much higher than that of the reported enzymes. To sum up, the novel halohydrin dehalogenase from Rhodospirillaceae bacterium possesses good temperature and pH stability as well as catalytic activity, and shows the potential to be used in the synthesis of chemical and pharmaceutical intermediates.
Keywords: halohydrin dehalogenasesβ-substitited alcohol1, 3-dichloro-2-propanol(R/S)-ethyl-4-chloro-3-hydroxybutyrate
卤醇脱卤酶(Halohydrin dehalogenase，HHDH)，也称卤醇-卤化氢裂解酶，可通过相邻羟基和卤素分子进行亲核取代，催化卤代醇底物的可逆反应，脱卤形成相应的环氧化物和卤化氢(图 1)。此外，卤醇脱卤酶还可以利用不同的带负电的亲核试剂，例如NO₂^–、N₃^–、CN^–、OCN^–，催化环氧化物的不可逆开环反应，形成新的C-C、C-N或C-O键(图 2)。因此，卤醇脱卤酶不仅广泛应用于环境中卤代醇类污染物的降解，而且还用于制备环氧化合物和β-取代醇等重要的手性药物、农药化学品及有机化学品合成中间体^[1-2]。

图 1 卤醇脱卤酶催化环氧化物成环反应[1] Fig. 1 Epoxide ring-closure by halohydrin dehalogenase[1].

图选项

图 2 卤醇脱卤酶催化环氧化物开环反应[1] Fig. 2 Catalytic scope of halohydrin dehalogenase in epoxide ring-opening[1].

图选项

由于来源于有机合成的卤代醇容易成为环境污染物^[3-4]，因此建立一个可靠有效的降解途径十分必要。卤醇脱卤酶可催化邻卤醇脱卤反应的特性使其在环境污染治理领域具有重要的应用前景。Bastos等利用卤醇脱卤酶实现对底物1, 3-DCP降解效果达到3.1 mg/(L·h)^[5]；Yonetani等利用微生物节杆菌Arthrobacter sp. strain PY1实现了对1, 3-DCP降解效果达到23.8 mg/(L·h)^[6]。早在1968年，Castro首次以2, 3-二溴丙醇作为唯一碳源筛选得到的黄杆菌Flavobaterium sp.菌株，并在该菌中发现了卤醇脱卤酶，该菌通过两步脱卤反应将2, 3-二溴丙醇分解为甘油^[7]，此后，研究者相继在多种微生物中筛选得到可以降解邻卤醇的卤醇脱卤酶^{[6, 8]}，并提出了卤醇脱卤酶相关的卤代醇降解路径。
目前研究最多的卤醇脱卤酶主要包括HheA、HheB、HheC三类，虽然它们之间的氨基酸序列一致性低于33%，但它们却具有高度相似的高级结构，并且都是以同源四聚体形式行使功能。每个单体显示为典型的β/α Rossman折叠^[9]，这也是短链脱氢酶/还原酶家族(SDR) 的保守特征。在系统进化关系上，卤醇脱卤酶属于短链脱氢酶/还原酶SDR超家族，与SDR家族成员具有一定的序列相似性，在结构上卤醇脱卤酶含有高度保守的催化三联体Ser-Tyr-Arg，而SDR家族具有保守的催化三联体Ser-Tyr-Lys^[10-15]。此外，卤醇脱卤酶缺失了SDR家族中富含Gly的辅因子结合区域，进而进化为一个空间较为广阔的卤素原子结合口袋。
在底物特异性方面，HheC类酶对短链邻卤醇(C2-C3) 具有较高的催化活性，对不同的芳香族或脂肪族化合物也具有较高的立体选择性，一般表现为R型偏好。HheA和HheB类酶偏好催化较长链的邻卤醇(C4-C6) 的反应，但具有较低的立体选择性，尤其是野生型的HheA卤醇脱卤酶对底物的立体选择性较差，在动力学拆分实例中，HheA表现出极低的对S型底物的立体选择性，晶体结构表明这可能与HheA的相对宽敞的底物结合口袋有关^[16]。目前，HheC类卤醇脱卤酶研究最为广泛，正是因其对大部分的卤代醇及环氧化物有较高的活性，且表现出良好的立体选择性，因此，HheC在一些化学合成及药物手性侧链的合成中发挥着重要的作用。
由于目前催化功能较为清楚的卤醇脱卤酶不足40种，且其中绝大部分酶的催化性能并不能满足科学研究和实际应用的要求，因此挖掘并鉴定更多的卤醇脱卤酶具有重要意义。本文通过对来源于红螺菌Rhodospirillaceae bacterium中的一个假定卤醇脱卤酶进行克隆表达，对其催化特性以及酶学性质进行研究，为卤醇脱卤酶的进一步工业化应用奠定了理论基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 质粒、菌株以及相关试剂本实验所用质粒pET28a来自本实验室保存，所用菌株大肠杆菌Escherichia coli DH5α和E. coli BL21(DE3) 均购于天根生化科技有限公司。限制性内切酶和T4 DNA连接酶购于赛默飞世尔科技(中国) 有限公司。所用催化底物1, 3-二氯-2-丙醇(1, 3-DCP)、(S/R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(S/R-CHBE) 等均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.1.2 主要仪器气相色谱仪7820A购自Agilent公司；气相色谱柱HP-5购自Agilent公司；超声破碎仪SB-5200D购自宁波新芝生物科技有限公司；高压匀浆机UH-06购自美国Union Biotech。
1.2 HHDH-Ra序列的生物信息学分析在对Rhodospirillaceae bacterium OCH5-H10基因组数据进行分析时，发现其中的一个假定蛋白(WP-082752032.1) 与SDR家族的氧化还原酶具有较高的氨基酸序列一致性，但又具有卤醇脱卤酶家族保守的催化三联体序列特征，将该蛋白命名为HHDH-Ra。采用ExPASy (https://www.expasy.org/) 在线软件对HHDH-Ra的碱基序列及对应的氨基酸序列、分子量大小以及等电点进行分析；通过从NCBI数据库中获得其他卤醇脱卤酶的氨基酸序列，运用ClustalX软件对这些序列进行比对分析；以系统进化树作为研究各物种间演化关系的有效手段，通过一种类似树状分支的图形，直观看出被研究对象之间的亲缘关系，通过MEGA软件对比序列分析结果，构建HHDH-Ra与目前已知的卤醇脱卤酶之间的系统进化树。
1.3 目的基因合成和目的蛋白表达纯化目的基因合成：对HHDH-Ra的原始基因序列进行了针对E. coli中表达的密码子的优化，在C端加上6×His标签，目的基因由上海桑尼生物有限公司合成。
目的蛋白的表达纯化：将目的基因构建至pET-28a载体上，重组质粒再转化至宿主E. coli BL21(DE3) 感受态细胞中，经过核酸电泳验证条带正确后，重组质粒则视为转化成功。将转化成功的单克隆接种于装有5 mL，含有卡那霉素抗生素(终浓度为50 μg/mL) 的LB液体培养基的试管中，并放置于37 ℃的恒温摇床中培养过夜。后以2.5%的接种量转接于200 mL摇瓶中，37 ℃振荡培养。当菌液OD₆₀₀达到0.6–0.8时，加入诱导剂IPTG (终浓度为0.2 mmol/L)，并将摇瓶置于25 ℃、175 r/min条件下诱导培养12–16 h。培养结束后，收集菌液于离心管中，8 000 r/min离心10 min，所获菌体沉淀用生理盐水洗涤重悬，离心后弃掉上清重复洗涤一次，收集菌体。
将诱导表达后收集的菌体0.8 g，用40 mL 20 mmol/L、pH 8.0的磷酸盐缓冲液(PBS) 重悬菌体，菌悬液置于冰浴中超声破碎细胞(200 W，超声5 s，间歇5 s，循环99次)，8 000 r/min离心30 min，收集上清，得到粗酶液。取诱导菌破碎后的上清和沉淀悬浮液各30 μL，加入6×上样缓冲液6 μL，煮沸10 min，SDS-PAGE电泳检测目的酶的表达情况。同时，利用HisTrapHP柱进行目的蛋白纯化，用25 mL平衡缓冲液和含50 mmol/L咪唑的洗脱缓冲液冲洗柱子，再用梯度为100 mmol/L、200 mmol/L、500 mmol/L咪唑进行梯度洗脱，收集500 mmol/L咪唑的洗脱峰。所得纯酶用超滤管(截留分子量：30 kDa) 浓缩，缓冲脱盐后，纯酶用SDS-PAGE验证纯度，并于–20 ℃保存用于后续的酶学性质检测。
1.4 酶学性质测定1.4.1 酶活测定方法的建立酶活单位(U) 定义为：在30 ℃、pH 8.0的条件下，在1 min内产生1 μmol产物所需要的酶量定义为1 U。
比色法的原理是基于卤醇脱卤酶在脱卤反应中，产生的H⁺会使反应体系中的pH降低，从而引起检测体系中酸碱指示剂产生颜色的变化。参考汤丽霞等发表的文献方法^[17]，对检测体系组成和检测方法进行修正，建立适合HHHD-Ra的酶活测定方法，即：在96孔板中加入150 μL含有0.001%苯酚红的HEPES (6 mmol/L，pH 8.0) 缓冲液，再加入50 μL催化反应液，在波长559 nm下，测定指示剂的吸光值。酶反应体系为：500 μL反应体积，加入10 mmol/L卤代醇底物以及纯化的酶200 μg，20 mmol/L、pH 8.0的PBS缓冲液补足至500 μL，30 ℃、200 r/min振荡反应30 min，加入2 mol/L盐酸终止反应，取样用比色法测定酶活。
1.4.2 HHDH-Ra底物特异性研究基于卤醇脱卤酶对卤代醇的催化特性，考察了纯化后的HHDH-Ra对6种卤代醇的催化活性。检测体系组成：在500 μL的反应体系中，加入10 mmol/L卤代醇底物以及纯化的酶200 μg，20 mmol/L pH 8.0的PBS缓冲液补足至500 μL。反应在2 mL EP管中进行，30 ℃、200 r/min振荡反应30 min，用比色法测定酶活。
1.4.3 最适pH的测定将酶活测定方法中的pH缓冲液改为不同pH的缓冲液，其中pH 5.0–6.5采用100 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制，pH 6.5–8.5采用100 mmol/L磷酸盐缓冲液配制，pH 8.5–10.0采用100 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制，其他条件不变，以1, 3-DCP为底物，测定纯化的酶HHDH-Ra在不同pH下反应30 min时的酶活，每组平行测3次。以所测的不同反应pH下最高酶活为100% (对照)，其他pH条件下所测酶活以对照酶活的百分比表示，绘制酶反应最适pH曲线。
1.4.4 最适温度的测定将酶活标准测定方法中的温度改为20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、50 ℃，其他条件不变，测定HHDH-Ra分别在上述温度下的酶活，每组平行测3次。以所测的不同温度下的最高酶活为100% (对照)，其他温度条件下所测酶活以对照酶活的百分比表示，制作酶的最适温度曲线。
1.4.5 pH稳定性测定将纯化后的目的蛋白置于4 ℃条件下保存，每隔一段时间取样，按标准检测方法检测酶活，以初始0 h测得的酶活为100% (对照)，计算不同时间点取样的残余酶活的相对百分比，制作pH稳定性曲线。
1.4.6 温度稳定性测定将纯化的目的蛋白与20 mmol/L pH 8.0的PBS缓冲液按体积比1︰1混匀，分别置于4 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃条件下孵育，每隔一段时间取样，按标准检测方法检测酶活。以不同温度下最初的酶活为100% (对照)，计算残余酶活的相对百分比，制作温度稳定性曲线。
1.4.7 不同底物浓度对HHDH-Ra催化反应影响催化反应体系：总体积为500 μL，分别加入10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、60 mmol/L的1, 3-DCP或R-CHBE，加入适量纯化好的酶，用20 mmol/LPBS缓冲液(pH 8.0) 补齐至500 μL，在30 ℃、200 r/min振荡反应，定时取样，用乙酸乙酯萃取，检测底物转化率。
气相检测条件为：采用Agilent GC-7820A系统，色谱柱为HP-5 (30 m×0.32 mm×0.25 μm)，分流比为20︰1，载气为氮气，进样口和检测器的温度分别为220 ℃和230 ℃，进样量1 μL。1, 3-二氯-2-丙醇(1 a) 的色谱条件：初始50 ℃保留1 min，10 ℃/min程序升温至100 ℃，保留3 min；R-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(2 a)：初始80 ℃，保留2 min，20 ℃/min，升温至160 ℃，保留3 min。
2 结果与分析2.1 卤醇脱卤酶序列比对及分析2.1.1 HHDH-Ra序列分析HHDH-Ra基因序列全长735 bp，共编码244个氨基酸，ExPASy (https://www.expasy.org/) 在线软件预测其蛋白分子质量为27 kDa，等电点(pI)为8.91。分析显示构成HHDH-Ra蛋白的氨基酸中丙氨酸数量最多，占16% (mol/mol)。目前研究较多的卤醇脱卤酶主要被分为HheA、HheB、HheC三类。同一类卤醇脱卤酶之间的蛋白序列同源性达到91%–98%，但不同类型的序列同源性则低于38%。HHDH-Ra与这3类卤醇脱卤酶的序列一致性在34%–36%之间。通过序列比对发现HHDH-Ra具有卤醇脱卤酶保守的催化三联体Ser136-Tyr149-Arg153 (图 3)。

图 3 HHDH-Ra与其他卤醇脱卤酶序列比对 Fig. 3 Sequence alignment of HHDH-Ra with known HHDHs. The conserved catalytic residues (Ser136, Tyr149 and Arg153) are marked with black triangle. Similar residues are framed in black area.

图选项

随着生物信息学技术的发展和越来越多基因组数据的公开，卤醇脱卤酶的数量不断增加，卤醇脱卤酶家族类型已由原来的A、B、C三大类，增加到G类^[18]。但是研究发现即使是同一类型的卤醇脱卤酶，它们之间的序列一致性也比较低。如表 1所示，将HHDH-Ra与不同类别的卤醇脱卤酶的序列进行比对，发现HHDH-Ra与上述A-G类的卤醇脱卤酶之间的序列一致性相对较低，与A类酶中的Hhe-A8 (Alphaproteobacterium strain) 具有最高的氨基酸序列一致性，为50%。HHDH-Ra与B类酶比较，与HheB (Corynebacterium sp.) 序列一致性最高，为36%；目前D类酶发现数量最多，有18个，而HHDH-Ra与所有D类酶序列一致性都较低，与D10 (Limnohabitans sp. strain Rim28) 序列一致性最高，仅为37%。HHDH-Ra与HheC、E、F、G类酶的序列一致性也低于36%。由此推测HHDH-Ra可能不属于已有的卤醇脱卤酶类型，而是一种新的卤醇脱卤酶。

Subtypes	Subtypes
	Catagory Ⅰ	HheA	A2	A3	A4	A5	A6	A7	A8	A9	HHDH-Ra
	HheA	100
	A2	97	100
	A3	33	34	100
	A4	99	98	33	100
	A5	40	38	39	39	100
	A6	34	33	49	33	40	100
	A7	39	37	54	72	41	51	100
	A8	36	32	63	32	34	51	49	100
	A9	34	32	71	32	39	51	48	58	100
	HHDH-Ra	34	35	45	34	39	43	45	50	44	100
	Category Ⅱ	HheB	HheB-GP1	B3	B4	B5	B6	B7	HHDH-Ra
	HheB	100
	HheB-GP1	98	100
	B3	49	49	100
	B4	55	54	73	100
	B5	58	58	62	67	100
	B6	58	58	58	63	68	100
	B7	54	58	69	74	68	58	100
	HHDH-Ra	36	35	32	34	33	29	30	100
	Category Ⅲ	HheD	D2	D3	D4	D5	D6	D7	D8	D9	D10	D11	D12	D13	D14	D15	D16	D17	D18	HHDH-Ra
	HheD	100
	D2	69	100
	D3	76	66	100
	D4	70	83	66	100
	D5	67	62	68	65	100
	D6	70	68	66	68	63	100
	D7	78	68	73	69	67	71	100
	D8	66	61	67	63	98	62	65	100
	D9	66	63	66	62	86	63	64	86	100
	D10	65	66	63	66	59	69	65	60	62	100
	D11	75	69	68	72	61	69	71	61	60	67	100
	D12	71	64	64	66	62	66	68	62	63	79	70	100
	D13	66	65	65	65	59	70	64	58	58	79	68	65	100
	D14	68	94	65	83	62	66	67	62	62	65	70	63	64	100
	D15	78	66	71	67	62	68	71	61	62	64	69	65	65	65	100
	D16	75	66	99	66	68	65	73	67	66	63	69	64	65	65	71	100
	D17	76	68	74	69	64	66	74	63	62	65	73	66	64	68	73	74	100
	D18	76	68	74	69	63	67	74	63	62	65	74	66	64	68	73	74	98	100
	HHDH-Ra	35	32	33	27	32	34	33	32	34	37	32	34	35	32	32	33	36	36	100
	Category Ⅳ	HheE	E2	E3	E4	E5	HHDH-Ra
	HheE	100	E2
	E3	E5	HHDH-Ra
	HheE	100
	E2	47	100
	E4	20	46	67	100
	E5	52	50	46	45	100
	HHDH-Ra	32	35	31	21	23	100
	Category V	HheC	HalB	HheF	HheG
	HHDH-Ra	36	35	34	24

表选项


2.1.2 进化树分析将HHDH-Ra与表 1中的卤醇脱卤酶进行系统进化分析，利用MEGA 5软件构建系统进化树(图 4)。结果显示，HHDH-Ra与A类卤醇脱卤酶进化关系比较近，其中与来源于Alphaproteobacterium strain Mf 1.05b.01的HheA-A8 (WP_029639308) 亲缘关系最近。

图 4 卤醇脱卤酶家族系统进化树分析 Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of the HHDHs family.

图选项

2.2 HHDH-Ra的表达与纯化将全基因合成的HHDH-Ra基因序列构建重组质粒pET-28a，再将阳性重组质粒转入E. coli BL21(DE3) 表达宿主中进行表达，Ni-NTA纯化得到高纯度的目的蛋白。HHDH-Ra的表达及纯化结果如图 5所示，目的蛋白大小为27 kDa，符合预期。HHDH-Ra在E. coli BL21(DE3) 中可溶性表达良好。纯化后的蛋白样品为单一条带，经灰度扫描可知其纯度大于95%。

图 5 HHDH-Ra蛋白在E. coli BL 21中表达及纯化蛋白电泳图 Fig. 5 SDS-PAGE analysis of the expression and purification of HHDH-Ra in E. coli BL 21. M: marker; Lane 1: whole-cell of E. coli expressing HHDH-Ra; Lane 2: crude extract of E. coli expressing HHDH-Ra; Lane 3: precipitate of E. coli expressing HHDH-Ra; Lane 4: purified enzyme.

图选项

2.3 HHDH-Ra酶的最适pH反应介质的pH是影响酶活性的一个关键因素，不同的pH可以影响肽链上氨基酸的解离状态，进而影响酶的结构、催化活性及稳定性。通过测定HHDH-Ra酶在不同pH缓冲溶液中的酶活，以30 ℃条件下测得的酶活为100%，计算相对活力。结果如图 6A所示，在pH 5.5–8.0范围内，相对活力随pH的增加不断提高，但在pH在8.0–10.0之间，相对活力随pH的增加不断降低，可见pH 8.0为HHDH-Ra最适反应pH。此外，过酸(pH 5.5) 及过碱(pH 10.0) 的反应条件不适合HHDH-Ra酶催化反应的进行。

图 6 pH (A) 和温度(B) 对HHDH-Ra酶活力的影响以及不同pH (C) 和温度(D) 酶的耐受性分析 Fig. 6 Effect of reaction pH (A) and temperature (B) on the activity of HHDH-Ra and determination of pH (C) and thermal (D) stability of the purified HHDH-Ra.

图选项

2.4 HHDH-Ra酶的反应最适温度温度同样是影响酶反应的一个关键因素，提高温度可提高酶促反应速率，但又会加速酶蛋白的变性。基于此，测定不同温度下HHDH-Ra催化1, 3-DCP的活性。结果如图 6B所示，其中30 ℃为HHDH-Ra酶反应最适温度，在20 ℃条件下，相对酶活较低，只有40%；而在25–50 ℃条件下，相对酶活都可以保持在80%以上，可见HHDH-Ra酶能在比较宽泛的温度范围内使用，特别是在较高温度下(40–50 ℃) 都可保持较高的酶活性。
2.5 HHDH-Ra酶的pH稳定性酶的pH稳定性是影响酶实际应用的一个重要指标，将HHDH-Ra酶分别置于pH 5.0–10.0的PBS缓冲液中，4 ℃放置，每隔一段时间取样，测定其残余酶活，以初始加入的酶活为100%，计算相对活力。由图 6C可知，HHDH-Ra在pH 6.0–8.0都具有较好的稳定性，100 h以后仍能保持70%左右的酶活，半衰期超出100 h，而HHDH-Ra在pH 5.0和pH 10.0中稳定性较差，但半衰期仍达到30 h。考虑到HHDH-Ra最适pH为8.0，而该酶在pH 8.0时也非常稳定，因此HHDH-Ra实际应用时建议将反应体系的pH设置为8.0。
2.6 HHDH-Ra酶的温度稳定性酶的温度稳定性是影响酶实际应用的另一个重要指标，按照1.4.1中酶活测定方法，将HHDH-Ra酶溶于pH 8.0的PBS缓冲液中，分别于4 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃静置保存，每隔一段时间取样，测定其残余酶活，以初始加入的酶活为100%，计算相对活力。如图 6D所示，温度越高，酶的稳定性越差。HHDH-Ra在4 ℃的环境中最稳定，100 h时仍具有60%以上的活力HHDH-Ra在30 ℃、40 ℃条件下的半衰期为60 h。当温度提高到50 ℃时，该酶的半衰期仍有20 h。在较高温度下HHDH-Ra比已报道的绝大多数卤醇脱卤酶具有更高的稳定性。目前，文献报道的卤醇脱卤酶在较高温度下大多不稳定，如卤醇脱卤酶HHDHSg (S. glossodoripedis) 和HHDHIs (I. salinarum)，其中HHDHIs在40 ℃下保温1 h，酶活就损失一半，HHDHSg虽在低于45 ℃时比较稳定，但高于45 ℃失活较快，50 ℃保温1 h，酶活损失一半^[19]。考虑到HHDH-Ra在30–50 ℃范围内都表现较高的活性(图 6A)，而且此范围内亦表现出良好的温度稳定性，说明该酶作为催化剂在实际应用时可适应比较宽的温度范围，且能耐受较高的反应温度，因而具有一定的应用潜能。
2.7 HHDH-Ra底物特异性研究基于文献报道，卤醇脱卤酶能够催化的底物通常为邻卤醇。本研究选择了6种卤醇脱卤酶的典型底物，采用1.4.1中建立的比色法测定了HHDH-Ra对这6种卤代醇的酶活，结果如表 2所示。HHDH-Ra酶对1, 3-二氯-2-丙醇(1 a)、(R/S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(2 a/2 b)具有催化活性，其中对底物(R)-CHBE (2 a)的活性最高，其次是(S)-CHBE (2 b)。HHDH-Ra对1-氯-2-甲基-2-丙醇(3 a)、2-氯-1-苯乙醇(4 a) 以及3-氯-1, 2-丙二醇(5 a) 检测不到脱卤活性。
表 2 HHDH-Ra底物特异性Table 2 Substrates specificity of HHDH-Ra

	Substrate	Enzyme activity (U/mg)
1 a	1, 3-dichloro-2-propanol	0.23
2 a	R-ethyl-4-chloro-3-hydroxybutyrate	0.41
2 b	S-ethyl-4-chloro-3-hydroxybutyrate	0.34
3 a	1-chloro-2-methylpropan-2-ol	n.d
4 a	Rac-2-chloro-1-phenylethanol	n.d
5 a	Rac-3-chloropropane-1, 2-diol	n.d
n.d: not detected.

表选项


2.8 HHDH-Ra催化1, 3-DCP的脱卤反应实验考察了HHDH-Ra催化不同浓度1, 3-DCP的反应过程，结果如图 7所示。尽管在反应的前2 h，底物浓度为10 mmol/L和20 mmol/L时的反应速率基本相同，但整体而言，底物转化率随着底物浓度的提高而下降，说明1, 3-DCP对HHDH-Ra具有显著的抑制效应。在底物浓度分别为10、20、40、60 mmol/L时，底物转化率在前2 h反应较快，此后底物转化率下降明显。对于底物浓度为10 mmol/L的反应，6 h以后底物转化率趋于平缓，此时底物转化率为80%；底物浓度高于10 mmol/L的反应，反应进行到4 h后基本停止，此时的转化率分别为55%、30%和10%。

图 7 不同1, 3-DCP浓度对HHDH-Ra催化反应的影响 Fig. 7 Effect of different 1, 3-DCP concentration on dehalogenation catalyzed by HHDH-Ra.

图选项

除了底物抑制以外，实验还考察了产物ECH是否会对HHDH-Ra产生抑制。将HHDH-Ra酶与不同浓度的产物ECH在30 ℃条件下共同孵育1 h和2 h后，测定残余酶活，结果如图 8所示。当反应体系中存在5 mmol/L的ECH时，就会对HHDH-Ra酶活产生抑制，且随着ECH浓度的提高抑制效应加强，当酶与10 mmol/L的ECH孵育1 h，HHDH-Ra的残余酶活只有50%左右，此外，产物抑制会随着时间延长而增强。此外，在考察HHDH-Ra催化1, 3-DCP的反应过程时发现，在反应进行2 h以后，反应液中有明显的白色絮状物出现，推测可能是随着时间延长，产物逐渐积累导致酶蛋白变性失活。产物抑制现象也发生在其他卤醇脱卤酶催化1, 3-DCP生成ECH的反应过程中。例如卤醇脱卤酶HHDHTm (T. mobilis ZJB1405) 和HHDHIs (I. salinarum) 催化1, 3-DCP合成ECH时，发现产物的收率随着底物浓度增加而下降，当底物由20 mmol/L增至100 mmol/L时，产物收率从70%降至30%，因此当酶活受到产物抑制时，较高浓度底物不能完全转化^[19]。

图 8 ECH对HHDH-Ra的影响 Fig. 8 Effect of ECH on activity of HHDH-Ra.

图选项

2.9 HHDH-Ra催化(R)-CHBE的脱卤反应以(R)-CHBE为底物时，实验考察了不同底物浓度对HHDH-Ra催化反应的影响，结果如图 9所示。与1, 3-DCP为底物时的催化过程不同的是，在所测定的底物浓度范围(10–60 mmol/L)内，底物转化率随着底物浓度的增加而不同程度地提高，说明(R)-CHBE对HHDH-Ra的抑制不如1, 3-DCP显著。但同样存在前2 h反应速率快、此后底物转化显著下降并趋于平缓的现象，由此推测生成的产物对HHDH-Ra的活性产生了抑制^[20]。在本实验中，同样观察到在反应2 h以后，反应液中出现明显的白色絮状物，这也再次说明HHDH-Ra在产物存在情况下，蛋白会变性失活。而蛋白的变性失活导致反应体系中的有活性的酶大幅度减少，这样导致催化反应基本在2 h以后无法进行。因而出现了图10所示的现象，即随着反应体系中产物的积累，抑制效应逐渐加剧，从而导致反应进行到一定时间后底物转化率基本不变(反应减缓或停止)。在后续实验中，考虑采用两相体系或者是在蛋白稳定性方面进行相关改造以降低底物(产物) 抑制效应。

图 9 不同R-CHBE浓度对HHDH-Ra催化反应的影响 Fig. 9 Effect of different R-CHBE concentration on dehalogenation catalyzed by HHDH-Ra.

图选项

3 结论通过氨基酸序列比对、进化树分析，推测来源于Rhodospirillaceae bacterium OCH5-H10的假定蛋白HHDH-Ra (WP-082752032.1) 是一个新型的卤醇脱卤酶。HHDH-Ra与目前已知的所有卤醇脱卤酶的氨基酸一致性都相对较低，在25%–40%之间，最高为50%。HHDH-Ra与其他卤醇脱卤酶亲缘性低。
HHDH-Ra的酶学性质研究表明该卤醇脱卤酶基因能够在E. coli中可溶表达。底物特异性研究表明HHDH-Ra能够催化1, 3-DCP和(R/S)-CHBE的脱卤反应。酶学性质研究显示HHDH-Ra反应最适pH为8.0，最适温度为30 ℃。HHDH-Ra在pH 6.0–8.0都具有较好的稳定性，100 h以后仍能保持70%左右的酶活。HHDH-Ra具有较高的温度稳定性，该酶在4 ℃的环境中最稳定，100 h时仍具有60%以上的活力，在30–40 ℃条件下半衰期仍达到60 h。本研究可能进一步丰富了卤醇脱卤酶的分类，同时良好的稳定性和催化活性显示其进一步的工业化应用前景。
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