, 咸静女, 陈刚, 彭海波中国海洋大学 海洋生命科学学院 生物工程系，山东 青岛 266003
收稿日期：2017-10-17;接收日期：2017-12-25; 网络出版时间：2018-03-20 基金项目：国家自然科学基金(Nos. 81072567, 31571369)，山东省自然科学基金(No. ZR2010HM056)资助
摘要：寡核苷酸是生物医学和生命科学研究中调节基因表达的基本工具，并被开发为基因靶向治疗药物，用于治疗病毒、肿瘤和遗传病。寡核苷酸药物主要包括反义寡核苷酸、小干扰RNA、核酶、脱氧核酶、反基因、CpG寡核苷酸、转录因子诱饵和核酸适配体等。天然的寡核苷酸在体内很容易被降解，特异性低，且有毒副作用。因此，药物寡核苷酸通常带有特定的修饰基团，如硫代磷酸二酯键、氟代、甲基以及锁核酸等，以增强寡核苷酸在体内的稳定性，提高特异性，并降低其毒副作用。目前，寡核苷酸主要采用化学方法合成，但化学合成的寡核苷酸初产物纯度低，而纯化十分困难。大规模核酸合成仪和纯化设备十分昂贵，因而大量合成和纯化寡核苷酸的成本高昂，大大限制了寡核苷酸药物的研究和应用。尽管已经涌现了多种多样的核酸扩增和检测方法，但用于扩增寡核苷酸的方法极少，且均不适合大量制备寡核苷酸。一种新的基于热循环的寡核苷酸扩增方法，称为“聚合酶-内切酶扩增反应” (Polymerase-endonuclease amplification reaction, PEAR)，能够使寡核苷酸等小分子核酸在双酶催化下，利用独特的“滑动-切割机制”进行自我复制，并实现指数扩增。PEAR反应简单、高效、稳定。该方法已成功制备硫代和氟代修饰的寡核苷酸，与化学合成法相比，该技术不依赖于大规模DNA合成仪，降低了生产成本，适合大量生产高纯度的寡核苷酸，将有助于推动寡核苷酸药物的研究和应用。
关键词：寡核苷酸药物 核酸治疗 聚合酶-内切酶扩增反应
Therapeutic oligonucleotides: a review
Xiaolong Wang
, Jingnü Xian, Gang Chen, Haibo Peng Department of Biotechnology, College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, Shandong, China
Received: October 17, 2017; Accepted: December 25, 2017; Published: March 20, 2018
Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 81072567, 31571369), Shandong Natural Science Foundation Project (No. ZR2010HM056)
Corresponding author:Xiaolong Wang. Tel/Fax: +86-532-82032809; E-mail: xiaolong@ouc.edu.cn
Abstract: Oligonucleotides are widely used as effective tools to regulate gene expression and drugs for targeted gene therapy. Therefore, they are potentially useful for the treatment of viral, tumor and hereditary diseases. Therapeutic oligonucleotides include antisense oligonucleotide, small interference RNA (siRNA), Ribozyme, DNAzyme, anti-gene, CpG, decoy and aptamer. Therapeutic oligonucleotides usually carry certain modifications, such as phosphorothioates, fluoro or locked nucleic acids, to enhance the stability and specificity, and reduce the side-effects, because natural oligonucleotides have poor stability in vivo, low specificity and side effects. Now oligonucleotides are usually manufactured by chemical synthesis, with low purity and high cost. Here, we review a novel thermocyclic reaction for the amplification of oligonucleotides, referred to as Polymerase-endonuclease Amplification Reaction (PEAR) catalyzed by two thermostable enzymes. PEAR is simple, efficient, and stable. Comparing with traditional chemical synthesis, PEAR-based enzymatic production of oligonucleotides could be a robust alternative method for the large-scale production of therapeutic or non-therapeutic oligonucleotides.
Key words: oligonucleotides drug nucleic acid therapeutics polymerase-endonuclease amplification reaction (PEAR)
对于癌症、病毒性感染等疾病，迄今临床上仍缺少理想的特效药物。随着人类及重要模式生物基因组测序的完成，以及功能基因组学及蛋白质组学研究的深入，与疾病相关的分子靶标不断被发现和认识，为基因治疗提供了前提。在过去的几十年里，人工合成的寡核苷酸已经广泛应用于靶向基因治疗的研究，主要包括反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotides, ASODN)、小干扰RNA (Small interference RNA, siRNA)、转录因子诱饵(Decoy)、核酶(Ribozyme)、脱氧核酶(DNAzyme)、反基因(Antigene)、CpG寡核苷酸和核酸适配体(Aptamer)等。其中ASODN和siRNA是最常用的基因调控工具，获得广泛应用，并已被开发为基因治疗药物。目前，寡核苷酸主要采用化学方法合成，其初产品纯度低，难以纯化，大量制备成本十分高昂，大大限制了寡核苷酸药物的研究和应用。本文综述了寡核苷酸药物的类别、作用原理及其特点，指出了寡核苷酸常规化学制备方法存在的问题，并介绍了新型核酸扩增及寡核苷酸制备方法的研究进展。
1 寡核苷酸药物的类别及其作用原理1.1 反义寡核苷酸反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotides, ASODNs)是指人工合成的、与特定基因互补的寡核苷酸(DNA或RNA)及其类似物，长度为13?25个碱基的核酸片段，它可以通过碱基互补配对原则结合于靶基因或靶RNA上，从而抑制基因的表达[1]。很多遗传性、代谢性和病毒性疾病都是由于基因表达异常引起的。反义寡核苷酸作为药品的原理是利用碱基互补配对原则与特定的信使RNA (Messenger RNA，mRNA)进行配对，抑制其表达，阻断遗传信息从DNA传递到蛋白质。根据核酸杂交原理，反义寡核苷酸能与特定的基因、病毒核酸或其转录产物结合，特异性抑制致病基因或病毒基因的表达。通过反义寡核苷酸抑制致癌基因或病毒的关键编码基因，可特异性抑制肿瘤细胞增殖生长并诱导细胞凋亡[2]。靶向mRNA或microRNA的反义寡核苷酸，已被广泛用作分子生物学的研究工具，以特异性和选择性地下调特定基因的表达。基因表达的产物是蛋白质，传统小分子药物主要作用于致病蛋白质，而反义寡核苷酸药物则直接作用于致病基因本身，因此比小分子化学药物更具选择性，而且具有高效、低毒、稳定有效、不易产生耐药性等优点，是理想的抗癌和抗病毒药物[3]。第一个通过美国食品及药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)咨询委员会认证并应用于临床的反义核酸药物是用于治疗艾滋(AIDS)病人巨细胞病毒感染的视网膜炎的福米韦生(Fomivirsen或Virtravene)[4]。然而，早先的实验室或临床研究中一些反义核酸稳定性、特异性和有效性不高，并且存在严重的毒副作用，因此学术界一度对反义核酸药物产生质疑，并导致上世纪末反义核酸药物的研发相对较为缓慢。
然而，近年来一些高效的新型反义核酸药物的出现，使反义核酸药物研究得以复兴。反义寡核苷酸作为用于抗肿瘤、抗病毒治疗的药物，是目前最有应用前景的基因靶向治疗药物。目前有数十种反义寡核苷酸药物正在进行临床试验或动物实验，针对包括癌症、肥胖、心血管疾病、精神病、代谢性疾病和病毒感染等。靶向作用于miRNA或mRNA的反义寡核苷酸预计能用于治疗多种人类疾病。2013年1月美国ISIS公司和Genzyme公司合作的一大成果——反义寡核苷酸药物Mipomersen (商品名KYNAMROTM)通过美国FDA认证[5-6]。Mipomersen是合成的烷基修饰反义寡核苷酸辅助降脂药物，通过抑制载脂蛋白ApoB-100的mRNA，以降低家族性高胆固醇血症(HoFH)患者的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白B (Apo B)、总胆固醇(TC)和非高密度脂蛋白胆固醇(非高密度脂蛋白C)[7-9]。
如图 1所示，针对成熟mRNA，既可以设计反义寡核苷酸，使其与mRNA结合形成杂合体，利用RNase H识别并酶解DNA:RNA杂合体的作用，使mRNA降解，从而抑制基因表达；也可以针对mRNA 5′-非翻译区设计反义寡核苷酸，使其翻译受阻。另外，针对前体mRNA，还可以在内含子与外显子剪切位点处设计反义寡核苷酸，使其不能正常剪切，称为剪切捕获(Splicing arrest)，此方法已经成功应用于杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)的基因治疗[10-14]。DMD是抗肌萎缩蛋白(肌营养蛋白)外显子跳读(Exon skipping)引起的。2016年9月19日，FDA批准Sarepta Therapeutics公司的反义RNA药物Eteplirsen (Exondys 51)，用于治疗外显子51跳读型杜氏肌营养不良。Eteplirsen通过静脉注射给药，可帮助51号外显子跳读DMD患者合成一些抗肌萎缩蛋白，延缓疾病进程，是FDA批准的首个DMD药物。
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| 图 1 反义寡核苷酸设计原理示意图 Figure 1 Schematic diagram of antisense oligonucleotide. |
| 图选项 |
1.2 小分子干扰RNA小分子干扰RNA (Small interfering RNA, siRNA)是一类长度在20?25 bp的双链RNA片段。siRNA通过与特定的核酸序列互补而影响特定基因的表达，在生物体内许多代谢过程中扮演重要角色。RNA干扰的原理如图 2所示，siRNA通过结合到靶标mRNA上使其降解或抑制其翻译[15]。Hamilton等于1999年首先在Science杂志报道发现了siRNAs在植物转录后基因沉默中的作用[16]。Lagos-Quintana等2003年在Nature杂志报道了化学合成的siRNA可以在哺乳动物细胞中引起RNAi作用[17]。随后一系列的发现激发了学术界和产业界应用RNAi技术在生物医学研究和药物开发上的热情。作为基因治疗药物研究的热点，小分子干扰RNA研究方兴未艾，然而至今尚未有siRNA药物开发成功上市。究其原因，是由于siRNA与靶标的结合并非一一对应，而是具有一定的非特异性，容易产生脱靶效应[18-19]。与反义寡核苷酸相比，siRNA既有级联放大效应带来的作用显著、需要剂量低的优点，但又有稳定性差、容易被降解和难以被输送到靶细胞的缺点。
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| 图 2 RNA干扰原理示意图(图片引自文献[15]) Figure 2 Schematic diagram of RNA interference[15]. |
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1.3 核酸适配体核酸适配体(Aptamer)是一类由化学合成的单链RNA或单链DNA寡核苷酸组成的小分子核酸配基[20]。其原理如图 3所示，核酸适配体能够折叠形成高级结构，并通过识别特异的三维结构，与其靶标进行相互作用，具有高特异性和亲和性，故而又有化学抗体之称。
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| 图 3 核酸适配体识别靶标示意图 Figure 3 Schematic diagram of aptamer binding to its target. |
| 图选项 |
与普通的蛋白抗体相比，核酸适配体有诸多优点：一是由于其分子量较低(8-25 kDa)，因此能够快速渗透组织；二是适配体在体内几乎不会引起免疫反应[21]；三是由于核酸适配体分子本质上具有很强的热稳定性；四是核酸适配体识别范围非常广，能够识别离子、药物、毒素、蛋白质[22]、病毒[23]、细菌[24]、癌细胞[25]，甚至肿瘤和组织[26-27]。
近年来，核酸适配体已被应用于临床研究，例如能与血管内皮生长因子特异性结合的一种RNA适配体药物Macugen已被美国FDA批准用于老年湿性黄斑变性(Wet age-related macular degeneration)以及家族性渗出性玻璃体视网膜病变(Familial exudative vitreoretinopathy)的治疗[28-30]。另外，如表 1所示，目前还有多种适配体药物处于临床试验阶段。
表 1 处于临床试验阶段的治疗性核酸适配体Table 1 Therapeutic aptamers in clinical trials stage
| Aptamers | Molecular target | R & D institutions | Indication | Current state |
| ARC1779 | Von Willebrand factor (vWF) | Archemix | Thrombocytopenic purpura type 2b hemophilia | Clinical PhaseⅡ |
| ARC1905 | Complement factor C5 | Ophthotech | Age-related macular degeneration | Clinical PhaseⅠ |
| AS1411 | Nucleolin | Antisoma | Leukemia, bone marrow metastatic renal cell carcinoma | Clinical PhaseⅠ |
表选项
1.4 三股螺旋寡核苷酸通过特异性识别DNA双螺旋中的多聚嘌呤或多聚嘧啶区域，寡核苷酸能够与DNA双螺旋的大沟或小沟结合形成局部三股螺旋结构[31-33]，被称为三股螺旋寡核苷酸(Triplex-forming oligonucleotide, TFO)。如图 4所示，TFO能够对目标基因有效定位及封锁，在转录水平抑制基因表达[34]，或在人体细胞中直接对基因组DNA进行修饰以修复遗传损伤[35]，有着重要应用潜力和研究价值。
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| 图 4 三股螺旋寡核苷酸抑制转录延伸(图片引自文献[34]) Figure 4 Triplex-forming oligonucleotide block the transcription elongation[34]. |
| 图选项 |
1.5 转录因子诱饵寡核苷酸转录因子诱饵寡核苷酸(Decoy ODN)是新一代强有力的反义基因策略，用于治疗多种疾病，并可确定某种特定基因表达的分子机制。如图 5所示，诱饵寡核苷酸是双链的，其序列与顺式作用元件的序列是一致的，因此能够通过竞争性结合抑制转录因子的功能作用。因此，用于转染的双链decoy ODN能够减弱基因组中真正的顺式作用元件和反式作用元件的相互作用，导致结合在内生性顺式元件上的反式因子被移除，控制目标基因的表达，从而发挥基因治疗作用[36]。
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| 图 5 诱饵寡核苷酸法抑制转录因子(TF)的功能(图片引自文献[36]) Figure 5 The decoy oligonucleotide approach to block the function of the transcription factor (TF)[36]. |
| 图选项 |
转录诱饵寡核苷酸已被试用于多种人类肿瘤和遗传性疾病的基因治疗。Morishita研究组以转录因子E2F的转录诱饵来抑制动脉粥样硬化和动脉内膜增生相关基因的表达，以治疗冠心病和血管增殖性心血管疾病[36-38]。如表 2所示，目前还有很多转录诱饵寡核苷酸正在进行临床研究，预期具有良好的应用前景。
表 2 用诱饵寡核苷酸作为基因治疗的潜在靶标转录因子Table 2 Transcription factors as potential therapeutic targets for gene manipulation by using decoy oligonucleotides
| Transcription factor | Participate in cell activity | Potential therapeutic applications |
| E2F | Cell proliferation | Neointimal hyperplasia, neoplasia, vascular nephritis, vascular regeneration, inflammation |
| AP-1 | Cell growth differentiation | Neointimal hyperplasia, cardiomyocyte growth and differentiation |
| NF-κB | Cytokine expression, Expression of leukocyte adhesion factor, Oxidative stress response, cAMP and protein kinase C activation, lg expression | Inflammation, immune response, transplant rejection, reperfusion injury, vascular ball nephritis |
| SSRE | Shear stress response, Growth factor, Vasoactive substances, Matrix protein, Adhesion molecules | Neointimal hyperplasia, bypass graft disease, angiogenesis, side of the secondary tube formation |
| CREB | cAMP response | cAMP activation reaction, tumor formation |
| MEF-2 | Cardiomyocyte differentiation | Cardiomyopathy, heart failure |
| CarG box | Cardiomyocyte differentiation | Cardiomyopathy, heart failure |
| Tax | Virus replication | HTLV infection |
| VP16 | Virus replication | Herpesvirus infections |
| TAR/tat | Virus replication | HIV infection |
| GRE/HRE/MRE | Glucocorticoid/mineralocorticoid-induced response | Steroid mediated response |
| Heat shock RE | HSR | Cell stress response |
| SRE | Growth factor response | Cell proliferation and differentiation |
| AP-2 | CAMP and protein kinase / retinoic acid reaction | Cell proliferation |
| Sterol response element | Adjust LDL receptor expression | Hypercholesterolemia |
| TGF-β Responsive element | TGF-β-induced cell processes | Cell growth and differentiation, migration, angiogenesis, neointimal hyperplasia, and apoptosis |
| HIF-1 | Hypoxia, vascular regeneration | Antiangiogenesis |
表选项
1.6 核酶和脱氧核酶早在1981年，Zaug等发现四膜虫rRNA的前体在没有蛋白质酶的催化作用下能专一性地催化寡核苷酸底物的连接与切割，证明RNA分子也具有催化活性，称之为核酶(Ribozyme)[39]。直到20世纪80年代末90年代初，核酶的结构才有了初步的了解，是一种简单的催化结构域——锤头结构(Hammerhead ribozyme)[40]。核酶可以很容易地用化学方法合成，随着对核酶功能以及结构研究的不断深入，核酶在抑制目的基因表达的研究过程中得到了广泛的应用。
由于核酶具有不稳定性，且利用化学修饰的过程比较复杂，1997年Santoro等通过体外筛选的方法设计出了一种依赖Mg2+离子、可特异性切割RNA的脱氧核酶(DNAzyme)[41]。如图 6所示，DNAzyme有两条任意可变的结合臂(armⅠ和armⅡ)，中间的催化中心含有14-15个碱基的保守序列。其中10-23 DNAzyme对底物RNA的要求是切割部位核心序列含有RY (R=A/G, Y=C/U)。与核酶相比，DNAzyme更易合成，对化学物质或核酸酶有较高的抵抗力，而且DNAzyme对于DNA:RNA杂合链与RNA:RNA双链在酶的评价指标方面(如底物的选择性、靶向性、酶的转换率、催化效率等)，与核酶相比均有所提高[41]。DNAzyme目前已经广泛用于治疗肝炎[42]、艾滋病[43]、癌症[44-46]等重大人类疾病的研究中。
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| 图 6 两种DNAzyme (8-17和10-23)与底物RNA结合和切割位点示意图(图片引自文献[41]) Figure 6 The binding and cleaving of the RNA substrates by two different (8-17 and 10-23) DNAzymes[41]. |
| 图选项 |
2 寡核苷酸大规模制备技术存在的问题规模化生产是药物开发的基础，这一点对于反义寡核苷酸药物尤为重要。反义寡核苷酸药物是目前最为成熟的寡核苷酸药物，但由于其没有级联放大作用，在临床和动物实验中使用剂量大，高达25?50 mg/kg[47]或800?1 000 mg/周[48]。因此，作为药物的寡核苷酸必须能够规模化生产，合成克级甚至千克级的寡核苷酸，并要降低成本，才有可能开展临床和动物实验。目前寡核苷酸几乎都是使用化学方法合成，即采用固相亚磷酰胺三酯法合成，并用高效液相色谱分离纯化。常规的DNA合成仪只能合成毫克级的寡核苷酸，大规模DNA合成必须采用克级和千克级DNA合成仪，如GE Healthcare公司生产的 KTA OligoPilot系列。目前仅有少数大型国际生物制药公司，如美国ISIS公司和丹麦的Santaris公司，才有能力合成千克级的寡核苷酸，开展反义药物的大规模临床研究。国内仅有军事医学科学院王升启等开展了寡核苷酸大规模合成及动物实验[49]，但目前尚无核酸药物上市或进入临床实验。究其主要原因，大规模合成寡核苷酸，仪器设备成本过于高昂，一直是寡核苷酸药物研究的瓶颈。
另外，化学合成寡核苷酸初产品被杂质和截短的错误序列(又叫失败序列)所污染，使产物纯化十分困难。产生这些失败序列的原因是在合成过程中脱三苯甲基(Detritylation)、耦合(Coupling)、硫化(Sulfurization)或保护(Capping)等反应不完全造成的，因此，必须对寡核苷酸粗产品进行纯化。然而合成寡核苷酸中最难以除去的杂质是大量(n-1)缺失序列(与完整长度为n的寡核苷酸相比仅相差一个核苷酸)。对于长度为18-21碱基对的寡核苷酸，用高效液相色谱法几乎无法从产品中完全除去(n-1)缺失序列[50]。此外，合成过程需要采用多种有害化学试剂，例如去保护试剂——三氯乙酸(TCA)或二氯乙酸(DCA)，必须溶解在卤化溶剂中(通常是二氯甲烷)。二氯甲烷具有高毒性、高挥发性和致癌性。因此，大规模的寡核苷酸生产不仅成本高昂，而且涉及到使用和处理危险化学品，对环境和人体存在潜在的威胁。
3 核酸扩增技术应用于制备寡核苷酸寡核苷酸在现代分子生物技术和生物制药研究中应用十分广泛。对具有特定序列的目标寡核苷酸进行扩增，不仅是一个需要克服的技术难题，而且在生物医药科学研究中具有重要的应用价值。商业化药物生产需要大量(以千克计)的寡核苷酸。传统的化学合成寡核苷酸不仅成本高昂，而且初产品纯度低、难以纯化，十分不利于临床研究和大规模药物生产。因此，开发一种简单、经济和安全的寡核苷酸大规模工业化生产方法已成为必要，而采用生物技术，用核酸扩增方法制备寡核苷酸无疑是最佳方案。
聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)技术自诞生以来[51]，一直是核酸扩增的主要方法。PCR和逆转录PCR技术在用于扩增有足够长度的DNA和RNA时简单而有效。但无法用PCR技术直接扩增短链寡核苷酸和siRNA。因为它们往往只有18-30个核苷酸的长度，无法设计一对特异性PCR引物。用PCR来扩增寡核苷酸或siRNA，首先必须设法将目标延长(如加接头或使用通用引物)，如此不可避免地会在产物中引入非目标序列。这在检测分析方法中没有问题，但对于制备方法而言，非常不利于后期分离纯化。而且由于底物是修饰性dNTPs，价格非常昂贵，产物中如果含有非目标序列，会造成底物(dNTPs)的浪费，是难以接受的。另外，更重要的是PCR只是将寡核苷酸引物延伸，PCR扩增产物的分子数不可避免地受输入寡核苷酸引物分子数的限制，因此PCR只能实现DNA分子量增加，而无法使寡核苷酸分子数目增加。因此，PCR技术不适合进行短链寡核苷酸或siRNA的大量制备。
近年来，基于核酸扩增技术的检测和诊断方法已获得广泛应用，给临床诊断提供了快速、灵敏和准确的方法。因此，国内外众多****不断致力于改进和探索新型核酸扩增技术，已经建立了多种多样的新型核酸扩增方法。按照扩增过程中温度是否变化来划分，核酸扩增方法可分为热循环扩增和恒温扩增两大类。热循环扩增主要包括经典的核酸扩增技术——PCR[51-52]和连接酶链式反应(Ligase chain reaction, LCR)[53-55]，而恒温扩增主要包括链置换扩增(Strand displacement amplification, SDA)[56-58]、滚环扩增(Rolling circle amplification, RCA)[59-61]、环介导扩增(Loop mediated amplification, LAMP)[62-63]、依赖解旋酶扩增(Helicase-dependent amplification, HDA)[64-65]、依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence based amplification，NASBA)[66-67]，等等。
这些DNA扩增技术和PCR一样，都需设计并采用至少一对化学合成的寡核苷酸作为引物，不可避免地会在产物中引入非目标序列。此外，这些方法只是将寡核苷酸引物延伸，其扩增产物的分子数也同样不可避免地受输入寡核苷酸引物浓度的限制，二次扩增必须加入新的寡核苷酸引物。因而一般也都不适合大量制备长度约20个碱基左右的寡核苷酸。
目前，已报道的专门用于扩增和制备短寡核苷酸的方法极少。指数扩增反应(EXPAR)是一个极为快速的恒温反应[68]，能够在10 min内快速扩增和制备目标寡核苷酸。EXPAR依赖于切刻内切酶Nt.BstNBI和具有链置换活性的DNA聚合酶，因此又被命名为切刻酶扩增反应(Nicking enzyme amplification reaction, NEAR)[69]。然而，目前EXPAR的应用十分有限，因为据报道该反应存在严重的非特异性扩增[70]。此外，该反应产物是单链的，仅对目标链进行扩增，而其模板(反义链)并未得到扩增。并且，EXPAR反应无法进行二次扩增，产量还是会受输入模板分子数目的限制，因此也不适合大量制备寡核苷酸。另外，滚环复制(Rolling circle replication, RCR)方法已被用于扩增环形DNA，可用于制备寡核苷酸[71]。然而，每轮RCR扩增之前都必须要进行费时费力的人工酶切、连接和重新环化，使之不适合进行自动化的大规模寡核苷酸制备。最近，Ducani等在Nature Method杂志报道改进版的RCR方法，称为Monoclonal stoichiometric (MOSIC)方法[72]。MOSIC方法依赖于具有链置换活性的Phi29 DNA聚合酶，以及特殊的内切酶BseGI，可按照预设的比例产生多个目标序列的单链寡核苷酸，预期可用于DNA纳米材料的制备。但目前该方法尚未实现制备带有修饰基团的药用寡核苷酸。
4 新型核酸扩增方法——PEAR技术及其在寡核苷酸制备中的应用如前所述，现有核酸扩增技术在应用于寡核苷酸扩增时均存在一定的困难。2010年Wang等研究开发了一种新型热循环酶促生物化学反应，称为聚合酶-内切酶扩增反应(PEAR)[73]，用于扩增和大量制备寡核苷酸。PEAR技术采用含有重复目标序列及酶切位点的双链DNA作为“种子”，通过独特的“滑动-切割机制”，用耐热DNA聚合酶延伸，耐热限制性内切酶切割，在热循环控制下，使寡核苷酸等小分子核酸能够像病毒一样自我复制，扩增特定的目标寡核苷酸。PEAR扩增产物的分子数能够以指数模式持续增加，并且不受输入初始“种子”寡核苷酸分子数的限制。PEAR产物无需经过任何处理，无需加入新的引物和模板，直接作为“种子”进行二次扩增。
PEAR反应DNA聚合酶和内切酶的选择范围很大，可制备各种天然和修饰寡核苷酸。目前用PEAR技术已经成功扩增和制备了带有硫代[74]和氟代[75]修饰基团的寡核苷酸。经高效液相色谱和质谱联用技术检测，表明PEAR产物中目标寡核苷酸所占比例很高。由于避免了产生(n-1)缺失序列，纯化过程十分容易。对于双链寡核苷酸而言，则无需进行高效液相色谱分离，用普通柱层析纯化后即可。因而，PEAR技术特别适合制备双链寡核苷酸，如转录因子诱饵。
PEAR技术具有操作简便、高效和稳定的特点，能够快速、准确、稳定地扩增寡核苷酸，产物纯度高。PEAR所采用的DNA聚合酶和内切酶等主要原材料都是纯生物制剂，生产过程安全无污染。并且，用PEAR方法制备寡核苷酸不需要昂贵的大规模DNA合成仪，而是采用价格低廉的热循环仪。因此，大规模生产的设备和材料费用均可大大降低。PEAR作为一种简单而高效的寡核苷酸扩增和制备方法，能够解决上述寡核苷酸生产中所存在的诸多问题。
5 结论寡核苷酸药物研究方兴未艾，应用前景广阔。寡核苷酸通常采用化学方法合成，但化学合成寡核苷酸会出现错误，纯度较低，而纯化十分困难。而且，由于天然的寡核苷酸在体内会被很快降解，具有一些毒副作用，因此作为药物的寡核苷酸必须带有修饰基团，增强寡核苷酸在体内的稳定性。大规模化学合成寡核苷酸的成本十分高昂，大大限制了寡核苷酸药物的研究和应用。目前已经出现了多种核酸扩增方法，但均不适用于大量制备寡核苷酸。新的寡核苷酸扩增方法“聚合酶-内切酶扩增反应” (PEAR)使寡核苷酸等小分子核酸能够在两种耐热酶的催化作用下，通过热循环进行自我复制，并实现指数扩增。这种新的寡核苷酸生产方法具有很多优点，能解决目前寡核苷酸制造中的诸多问题。该方法采用大容量热循环仪生产寡核苷酸，设备成本低，适合大量生产修饰寡核苷酸。PEAR技术是拥有自主知识产权的核酸扩增技术，很有可能用于大量生产成分更纯、成本低廉的寡核苷酸类药物，有助于推动寡核苷酸药物的研究和应用。
附表 1 各名词全称及缩写归纳表Appendix 1 Abbreviations
| Full name | Abbreviation |
| Antisense oligonucleotides | ASODN |
| Decoy oligonucleotide | decoy ODN |
| Exponential amplification reaction | EXPAR |
| Helicase-dependent isothermal DNA amplification | HDA |
| Loop mediated amplification | LAMP |
| Ligase chain reaction | LCR |
| Monoclonal stoichiometric | MOSIC |
| Nucleic acid sequence based amplification | NASBA |
| Polymerase chain reaction | PCR |
| Polymerase-endonuclease amplification reaction | PEAR |
| Rolling circle amplification | RCA |
| Strand displacement amplification | SDA |
| Triplex-forming oligonucleotide | TFO |
表选项
参考文献
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