1 浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，浙江 杭州 311300;
2 浙江农林大学 浙江省竹资源与高效利用协同中心，浙江 杭州 311300
收稿日期：2017-05-24;接收日期：2017-09-20; 网络出版时间：2017-09-25 基金项目：浙江省自然科学基金(No. LR12C16001)，国家自然科学基金(Nos. 31270645, 31470615)资助
摘要：MITEs (Miniature inverted-repeat transposable elements)转座子是一种特殊的转座子，其既有DNA转座子的转座特性——“剪切-粘贴”转座方式，又有RNA转座子的高拷贝特性。目前已被报道的MITEs种类和数量虽然很多，但是关于有转座活性的MITEs的报道却甚少。本文总结了近几年来有关活性MITEs的相关报道，发现具有转座活性的MITEs种类大都分布在Tourist家族，分别是mPing、mGing、PhTourist1、Tmi1和PhTst-3，另外还有Stowaway-like家族的dTstu1和MITE-39以及Mutator家族的AhMITE1。文中还分析了这些活性MITEs的结构(TIR和TSD)、拷贝数、进化模式以及转座特性等，为鉴定其他活性MITEs以及MITEs转座和扩增机制的研究奠定了基础。
关键词：微型颠倒重复转座元件(MITEs) 转座活性 末端重复序列(TIR) 靶位点重复序列(TSD)
Active miniature inverted-repeat transposable elements transposon in plants: a review
Bingjie Hu1, Mingbing Zhou1,2
1 State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Zhejiang A & F University, Hangzhou 311300, Zhejiang, China;
2 Zhejiang Provincial Collaborative Innovation Center for Bamboo Resources and High-efficiency Utilization, Zhejiang A & F University, Hangzhou 311300, Zhejiang, China
Received: May 24, 2017; Accepted: September 20, 2017; Published: September 25, 2017
Supported by: Natural Science Foundation of Zhejiang Province, China (No. LR12C16001), National Natural Science Foundation of China(Nos. 31270645, 31470615)
Corresponding author:Mingbing Zhou. Tel: +86-571-63731263; E-mail: zmbin@163.com
Abstract: Miniature inverted-repeat transposable elements transposon is a special transposon that could transpose by "cut-paste" mechanism, which is one of characteristics of DNA transposons. Otherwise, the copy number of MITEs is very high, which is one of characteristics of RNA transposons. Many MITE families have been reported, but little about active MITEs. We summarize recent advances in studying active MITEs. Most the MITEs belong to the Tourist-like family, such as mPing, mGing, PhTourist1, Tmi1 and PhTst-3. Additionally, DTstu1 and MITE-39 belong to Stowaway-like family, and AhMITEs1 belongs to Mutator-like family. Moreover, we summarize the structure (terminal inverse repeats and target site duplications), copy number, evolution pattern and transposition characteristics of these active MITEs, to provide the foundation for the identification of other active MITEs and subsequent research on MITE transposition and amplification mechanism.
Key words: miniature inverted-repeat transposable elements transposon activity terminal inverse repeats target site duplications
转座子(Transposons)是染色体中一段可以跳跃的DNA序列，可以从基因组的一个位置移动到另一个位置，引起基因组的改变甚至染色体结构的变异等[1]。根据转座子的转座机制不同，可将转座子分为两大类：RNA类转座子和DNA类转座子。RNA类转座子又称反转录转座子，该类转座子先是转录成RNA，然后再通过反转录成DNA转座到其他位置，整个过程以“DNA-RNA-DNA”的形式完成转座，所以RNA类转座子是以“复制-粘贴”的方式转座。RNA类转座子每次转座，其拷贝数都会相应增加，一般比DNA类转座子的拷贝数要高[2]。而DNA类转座子是通过“DNA-DNA”的“剪切-粘贴”的形式转座，是在转座酶的作用下，从一个位置剪切下来，插入到另一个位置[3]。
DNA转座子根据能否发生自主转座又可分为自主转座子和非自主转座子。自主转座子由于其结构完整，具有编码完整转座酶的能力，所编码的转座酶可以促使自身发生转座；而非自主转座子与自主转座子相比，其内部的转座酶编码序列有所缺失，不能编码转座酶，必须依靠相应的自主转座子编码的转座酶作用才能转座。
微型颠倒重复转座元件(Miniature inverted repeattransposable elements，MITEs)是比较特殊的非自主转座子，其结构类似于一般的非自主转座子，但是片段长度要小得多，一般长度在100–800 bp范围。另外，与一般的非自主转座元件相比，大多数MITEs家族在基因组中具有相当大的拷贝数，多达上千甚至上万[4]，例如，在玉米Zea mays中发现mPIF的拷贝数达到6 000多个拷贝[5]，在水稻Oryza sativa基因组有90 000多个MITEs，占水稻转座子75%以上[6]。此外，MITEs的A/T含量较高，可以形成稳定的发夹式二级结构，且两端具有高度保守的反向重复序列(Terminal inverted repeats，TIR，转座酶的识别位点)和2–11 bp靶位点重复序列(Target site duplications，TSD，转座酶识别位点)，倾向于插入基因内部或附近。MITEs两端的TIR可以形成茎环结构，能够转录加工成3种内源小RNA，包括miRNA、endo-siRNA和piRNA (PIWI-interacting RNA)[7-8]。这些来源于转座子的小RNA除了在抑制宿主转座子跳跃、维持基因组的生态环境发挥重要作用外，还调控着众多宿主基因的表达[9]，如来源于两个MITEs的水稻siRNA441和siRNA446除了参与MITEs转座活性的调控外，还参与了水稻对脱落酸信号和非生物胁迫的响应[10]。
目前已发现上百个不同的MITEs家族，根据MITEs两端的TIR和TSD特性，可将MITEs归为Stowaway类(TSD：TA)和Tourist类(TSD：TAA或TTA)两个大家族以及其他若干个小家族(如CACTA、MUDR等家族)[11]。MITEs的插入可以通过多种形式调控附近的基因表达，比如插入使基因失活，为基因提供顺式调控元件，引起基因的可变剪接，提供反义RNA或小RNA等[12]，这些调控在遗传和表观两个层次都能发挥作用，因此活性MITEs越来越受研究者重视，以期利用活性MITEs开发基因标签，为大规模研究基因功能和构建饱和突变体库提供新的工具。本文系统收集了目前已鉴定活性MITEs，总结了活性MITEs的结构(TIR和TSD)、拷贝数、进化模式以及转座特性，为鉴定其他活性MITEs以及MITEs转座和扩增机制的研究奠定基础。
1 MITEs的发现及其在植物基因组中的分布1992年，Bureau等[13]在研究玉米wx-B2基因的插入突变分析中发现一个128 bp的短片段元件，该元件在基因组中分布非常广，分析其序列发现该元件具有14 bp的TIR (5′-GGCCTTGTTC GGTT-3′)以及3 bp的TSD (TAA/TTA)保守序列，与其他带有TIR的转座子相比无序列相似性，且该家族元件的拷贝数非常丰富，因此将该类转座子另外命名为Tourist家族转座子。随后在Tourist家族转座子的基础上，Bureau[11]又在一些草本植物的基因组中发现另一类转座子，其TSD序列为TA，将其命名为Stowaway转座子，与Tourist转座子共同称为MITEs元件，自此，人们开始了对MITEs的研究之路。
20世纪90年代中期，随着基因组测序技术的发展，MITEs家族种类有暴发式的增长，人们根据已发现的MITEs的一些基本特征，研发出可以在基因组中鉴定出MITEs的计算工具，如RSPB[6]、FINDMITEs[14]、MUST[15]等，可以通过TIR、TSD等特征结构，直接在基因组中搜索发现不同种类的MITEs。这些计算工具的出现，相比于过去通过实验来检索验证MITEs，大大地方便了研究人员对MITEs的检索。但是由于技术不成熟，这些工具鉴定出的MITEs假阳性率很高。为了降低其假阳性率，MITE-Hunter[16]和MITE Digger[17]相继被开发出来，可以在全基因组中从头探测，特别是MITE Digger，其假阳性最低，并且速度快，是目前应用最为广泛的MITEs搜索工具。以水稻基因组中MITEs家族为例，MITE-Hunter的假阳性率为4.4%–8.3%，FINDMITE为85%，MUST为86%，而MITE Digger的假阳性率最低，仅有1.8%，并且搜索时间明显比前几种方法短。Ye等[18]基于MATLAB采用新颖的数值计算的方法，开发出一个新的程序——detect MITE，将其与MITE-Hunter、MITE Digger和RSPB的工作效率进行比较，发现detect MITE的工作效率是最高的，尽管RSPB搜索出的MITEs序列最多，但大部分都不完整。
根据已报道的一些物种基因组中的MITEs含量，发现虽然MITEs在植物基因组中含量丰富，但在不同的植物基因组中，MITEs的含量差异较大(图 1)，例如比较水稻与玉米的MITEs含量，玉米的基因组是水稻的7.6倍，但是其MITEs的含量却不到水稻的一半。
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| 图 1 不同物种基因组大小与其已报道的MITEs含量的关系[19] Figure 1 The relationship between the genomic size of different species and the reported MITEs content[19] |
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此外，比较一些物种的基因组与其报道的MITEs含量关系，发现MITEs的含量与物种基因组大小无明显的线性关系，如水稻的基因组比高粱Sorghum bicolr L.小近一倍，但是其报道的MITEs的含量却比高粱的多出很多(图 1)。其次，在亲缘关系较近的物种中，其拷贝数也存在较大的差异，如深山南芥Arabidopsis lyrata L.中的MITEs数量大约比拟南芥Arabidopsis thaliana L.多4倍。同样地，西瓜Citrullus lanatus L.中的MITEs数量大约是甜瓜Cucumis melo L.的7倍[20]。
对MITEs插入位点分析，发现大部分MITEs倾向插入到基因附近，也有一部分插入到内含子或者非翻译区[21]。如在水稻基因组有90 000个MITEs，占水稻转座子75%以上[6]，其中有8.2%位于基因内部，81.2%位于基因上游和下游2 kb以内区域[21]。
2 MITEs的扩增机制MITEs和非自主转座子一样，是缺失编码完整转座酶序列的转座子，不能自主转座，但是相比非自主转座子，MITEs在基因组中的拷贝数却比非自主转座子要高得多，引起了众多研究者对其扩增机制进行探究。有研究者提出“删除论”：一些自主的DNA转座子通过内部不断删减，保留了自主转座元件的TSD、TIR序列以及中间残留部分，最终形成了几百bp大小的MITEs，这些被删减的序列可能就是编码转座酶的序列片段，而保留的部分可能含有可被转座酶识别的序列，使编码的转座酶可以识别对应的MITEs，从而诱导MITEs发生转座[22]。2003年，Feschotte等[23]研究发现，水稻中Mariner-like elements (MLE)自主转座子与Stowaway-like MITEs的TIR和TSD序列高度一致，推测MLE编码的转座酶可能会催化Stowaway-like MITEs发生转座。2009年，Yang等[24]通过在体外构建的MLE转座酶序列，在酵母Saccharomyces cerevisiae体内催化Stowaway-like MITEs转座，更进一步明确了MLE和Stowaway-like MITEs之间的关系。由此推测MLE在物种进化过程中，由于内部编码转座酶序列不断删减，最后成为了缺失编码全部转座酶序列的Stowaway-like MITEs。另一例子是mPing，mPing是第一个发现的具有转座活性的Tourist-like家族的MITEs转座子[25-26]，Yang等[27]又发现了两个自主DNA转座子Ping和Pong，这两个自主转座子的末端与发现的mPing具有很高的同源性，这说明了mPing很有可能是Ping和Pong内部删减的结果。通过拟南芥遗传转化体系，证实了Pong自主转座子编码的转座酶可以促使mPing转座子发生转座。这些结果都验证了他们之前所提出的“删除论”。
3 活性MITEs发现与鉴定目前在已发现的具有转座活性的MITEs中(表 1)，种类最多的是Tourist-like家族，有mPing、mGing、PhTourist1、Tmi1和PhTst-3；另外还有属于Stowaway-like家族的dTstu1和MITE-39以及属于Mutator家族的AhMITE1。
表 1 活性MITEs特征Table 1 Features of active MITEs
| MITE | Class | Sequence length (bp) | TIR | TSD | Reference |
| mPing | Tourist-like | 430 | GGCCAGTCACAATGG | TWA | [25] |
| mGing | Tourist-like | 146 | GTTTAGTT | TWA | [28] |
| PhTourist1 | Tourist-like | 356 | GGCCAGTCTCAATG | TWA | [29] |
| TMi1 | Tourist-like | 306–336 | GGGGTCGTTT | TAT/TAA | [30] |
| PhTst-3 | Tourist-like | 295 | GGGCATGTACA | TTA | [31] |
| dTstu1 | Stowaway-like | 239 | CTCCCTCYGTC | TA | [24] |
| MITE-39 | Stowaway-like | 260 | CTCCCTCCGTTCTTAAATA | TA | [32] |
| AhMITE1 | Mutator-like | 201–223 | GGTGGATACTACAATGAAGATGGCA | ATGCAATAA | [33] |
表选项
3.1 Tourist-like家族活性MITEs的发现与鉴定3.1.1 mPing水稻作为单子叶植物中的典型模式植物，其参考基因组序列较为完善。通过生物信息学分析发现，虽然水稻基因组仅有430 Mb，但MITEs含量非常高，并且种类丰富，几乎涵盖了所有类型的MITEs，因此被认为是适合研究MITEs转座子的模式材料[34-35]。对于这一现象，有研究者推出一个“cross-mobilization”的假说，认为MITEs的起源和扩增发生在不同的时间段，MITEs最早起源是由于早期的自主转座子经过长期的内部删除，经完全删除转座酶编码序列后，只剩下TIR和TSD序列以及不编码的小片段，再经过后面一些“年轻的”自主转座子编码的转座酶作用下发生转座并发生扩增，并随着时间的积累，扩增的MITEs也不断积累，从而出现富集的现象[23]。
2003年，在研究γ射线诱导水稻颖叶表型突变的过程中，研究人员发现，经过γ辐射后，在水稻的Rurm 1基因中有一个MITE片段发生了跳跃，这是第一个被发现具有转座活性的MITE转座子，遂将其命名为mPing。比较并分析突变后的水稻与野生型水稻的Rurm 1基因，mPing插入到Rurm 1基因的第4个内含子中，从而改变了Rurm 1基因的表达，导致水稻颖叶比野生型的更加细长[25]，并且mPing的拷贝数也会明显增加[36-37]。同年，另两个研究发现，mPing在水稻花药组织培养过程中亦可以被激活并发生转座[26]。mPing除了在Ping转座元件编码的转座酶催化下发生转座外，也会在Pong的转座酶作用下被激活[34]。2013年，有研究发现，在没有外界胁迫因素的情况下，当编码泛素蛋白的基因被沉默后，mPing的转座活性会提高[38]。上述研究表明，mPing是一个仍然具有转座活性的MITEs，并且能在花药组培或辐射等胁迫条件下被激活转座，而当泛素蛋白被沉默时，其转座频率会增加。
分析mPing的序列发现，其序列有430 bp，包括15 bp的TIR (5′-GGCCAGTCACAATGG-3′)和3 bp的TSD (TTA或TAA)，因此该MITE家族属于Tourist类转座子。在之后的研究中，研究人员通过同源性比较搜索，发现了两个自主DNA转座子Ping和Pong的末端与mPing具有很高的同源性。mPing的TSD和TIR序列与Ping一样，除了mPing缺失了Ping元件中的两个ORFs外，其他序列几乎一致，推测mPing很可能是Ping自主转座元件长期不断的内部删除的结果。通过拟南芥遗传转化体系，证实了Pong与Ping两个自主转座子编码的转座酶可以促使mPing转座子发生转座[27, 39]。
进一步研究发现，mPing序列有96个调控保守区，其中有1/3与环境胁迫有关，对附近基因表达调控起着重要作用。mPing在基因组的分布广泛，使水稻395个基因具有受冷害、高盐和干旱条件诱导表达的特性[37]。当mPing插入转录起始位点上游1–5 kb范围内，会上调下游基因的表达；但是当mPing插入到外显子中，则会下调下游基因的表达；当mPing插入到启动子区，会影响顺式作用元件和反式作用元件的相互作用，继而影响下游基因的表达[40]。这些结果表明，mPing的插入为转录因子或其他转录调节蛋白提供一个新的结合位点，从而影响下游基因的表达丰度。
3.1.2 mGingGaijin-like MITEs属于Tourist家族，最早于1996年在水稻基因组中发现[41]，但是当时对Gaijin的研究结果仅仅是在水稻基因组中鉴定出5个不同位点的Gaijin-like MITEs的插入，并对这几个Gaijin元件进行了简单的结构分析，之后并没有继续深入研究该家族的其他方面(如转座活性、功能等)。2012年，Dong等[28]在水稻PLRRP (Putative leucine-rich repeat protein)基因中鉴定出一个新的Gaijin-like MITEs——mGing，这也是继mPing之后第二个被发现具有转座活性的Touris类转座子。该类MITEs大小只有146 bp，包括8 bp的TIR (GTTTAGTT)和3 bp的TSD (TAA或TTA)序列，并且如其他Tourist类转座子一样，倾向于插入富含AT区。以146 bp的mGing元件作为query序列，在水稻全基因组中比对，发现其拷贝数达上千，然而在拟南芥基因组中尚未发现该家族元件。为鉴定mGing是否具有转座活性，选取同一株水稻种子，用不同剂量的γ射线处理水稻种子并培育，对不同处理的水稻基因组做转座子显示技术(Transposon display，TD)，发现500 gy处理的水稻基因组出现多处多态性条带，而未辐射和300 gy剂量的水稻条带均一，并与已报道的Gaijin-like MITEs为对照，均未表现出多态性，排除了基因重组、基因重排等假阳性，说明500 gy处理后的水稻基因组中，mGing可能发生转座。通过PCR技术扩增含mGing的片段并测序，发现有几个mGing的侧翼序列在数据库中并未与mGing相连，这也确定了mGing在水稻种子经过辐射处理后的确发生了转座。另外，比较了mGing转座前后的位置序列，均发现随着mGing的剪切或插入，其侧翼序列都有部分碱基改变，或者有小片段插入。
3.1.3 PhTourist12015年，胡慧等利用已知mPing的特点(TSD和TIR序列结构等)，通过transpo[42]在毛竹Phyllostachys edulis C.基因组中鉴定出30个mPing-like的MITEs——PhTourist1，比对该30条序列发现，其TIR序列是GGCCAGTCTCAATG，共14 bp，与mPing的TIR (GGCCAGTCACAA TGG)序列相比(表 1)少一个碱基(GGCCAGT CACAATGG)，并且伴有一个碱基不同。比较PhTourist1家族转座子的侧翼序列发现，其TSD序列为TWA (W=A/T)，以及插入偏好序列为(C/T)T(C/A)T(T/A)A(G/T)A(A/C)。通过PCR扩增及测序发现，30个PhTourist1的MITEs序列及其侧翼序列均符合毛竹基因组序列，但是在这30个MITEs中，有一个PhTourist1-3发现具有多态性，证明了在毛竹实生苗生长过程中PhTourist1发生了转座，对PhTourist1-3转座足迹分析发现，PhTourist1-3几乎精确切除，仅在5′端缺失1个碱基。这是首次在毛竹基因组中发现并被鉴定出具有活性的Tourist-like的MITEs。通过定量PCR验证发现，当该位点PhTourist1-3转座缺失后，其下游基因的表达较缺失前明显增加。因为所选取的材料是来自同一棵毛竹的半同胞实生苗，并且种植环境相同且适宜，胡慧等推测PhTourist1的活性转座可能不是由于外界压力激活的，很有可能是在种子发芽的过程中发生转座，也有可能是在授粉过程中，由于授粉的父本毛竹不同而导致的。PhTourist1的插入很有可能是改变了顺反式作用元件的作用，从而抑制了下游基因的表达，当PhTourist1转座切除后，下游基因的表达量明显增加[29]。
3.1.4 TMi1骆红梅等[30]在烟草Nicotiana tabacum L.中发现一个具有转座活性的MITEs——TMi1，这也是首次在烟草基因组中发现具有转座活性的MITEs。TMi1的TSD序列为TAT/TAA，属于Tourist-like家族转座子，其序列长度在306–336 bp不等，TIR序列为GGGGTCGTTT，共17 bp。该研究利用TD技术初步评估出TMi1家族在若干个不同品种的烟草中存在着明显的多态性，初步判断烟草TMi1家族的MITEs可能仍具有转座活性；将具有扩增差异的条带胶回收并测序，分析测序结果发现，回收的条带大部分都是带有TMi1元件的序列，随后利用Blastn将上述测序结果与数据库中的序列比对，发现部分测序结果中的序列多出TMi1元件，这些结果说明TMi1家族在若干个不同烟草品种间发生了跳跃，推测烟草中TMi1家族转座元件目前仍具有转座活性。
3.1.5 PhTst-3随着毛竹的基因组测序的完成，我们在毛竹基因组中鉴定出489 592个MITEs，分别可以归纳为362个家族，占据毛竹全基因组的4.74%。根据这些MITEs的TIR和TSD序列的保守性，可将其分成6个超家族，分别是Stowaway-like MITEs、hAT-like MITEs、Tourist-like MITEs、Mutator-like MITEs和CACTA-like MITEs，而对于一些TIR或TSD序列特征不明显的MITE暂时归为未知超家族类别[43]。在对毛竹基因组中的MITEs家族进化、插入时间、分布等分析之后，我们进一步对MITEs的转座活性以及转座后对附近基因的影响进行研究，在胡慧等[29]研究发现PhTourist1家族具有转座活性之后，又先后在毛竹基因组中鉴定了两个具有转座活性的Tourist-like和Stowaway-like MITEs。陈昂[31]在不同毛竹实生苗中，发现有一个MITE在PH01002699G0010基因的第6个内含子中存在插入多态性，初步判断该类MITEs具有转座活性。通过生物信息学的方法，分析发现该类MITEs在毛竹基因组中具有94个拷贝，全长295 bp，其TIR序列为GGGCATGTACA，TSD序列为TTA，属于Tourist-like MITEs，命名为PhTst-3。通过荧光定量PCR发现，与含有PhTst-3插入的基因相比，未插入的PH01002699G0010基因的表达量明显有所上升，表明PhTst-3插入内含子的作用相当于一个沉默子，下调了基因的表达。
3.1.6 Tourist-like家族活性MITEs进化模式分析将mPing、mGing、PhTourist1、Tmi1和PhTst-3共5个Tourist-like家族的MITE序列与Ping和Pong序列通过DNAMAN比对(图 2A)，发现除了Tmi1家族MITE的TSD序列为TAW (T/A)，其余几个家族的TSD均为TW (A/T)A。Tmi1家族MITEs的TIR序列也与其他MITEs的TIR差异明显。Ping、Pong、mPing、PhTourist1的TIR序列一致性较高，特别是mPing与Ping和Pong，除TIR序列一致以外，其内部序列与Ping的内部序列相似度很高。
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| 图 2 活性Tourist-like MITEs与Ping和Pong的进化关系. (A)活性Tourist-like MITEs (mPing、mGing、PhTourist1、Tmi1和PhTst-3)与Ping和Pong的TSD与TIR比对图(红框：TSDs；蓝框：TIRs；绿框：省略的部分序列). (B)活性Tourist-like MITEs (mPing、mGing、PhTourist1、Tmi1和PhTst-3)与Ping和Pong转座子的聚类分析 Figure 2 Evolution of active Tourist-like MITEs, Ping and Pong. (A) The comparison of TSD and TIR of active Tourist-like MITEs (mPing, mGing, PhTourist1, Tmi1 and PhTst-3) with Ping and Pong (Red frame: TSDs; blue frame: TIRs; green frame: partially omitted sequence). (B) Clustering analysis of Tourist-like MITEs (mPing, mGing, PhTourist1 Tmi1 and PhTst-3), Ping and Pong |
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为了进一步分析Tourist-like家族活性MITEs的进化特征，利用MEGA 6.0将Ping、Pong与活性Tourist-like MITEs (mPing、mGing、PhTourist1、Tmi1和PhTst-3)进行聚类分析(图 2B)，构建ML进化树。结果显示，PhTourist1、mPing与Ping和Pong亲缘关系较近，推测PhTourist1、mPing与Ping和Pong转座子可能来自同一祖先。而PhTst-3、TMi1和mGing与前四者亲缘关系较远，说明这3个MITEs家族与前四者MITEs起源的祖先不一样。
3.2 Stowaway-like家族活性MITEs的发现与鉴定3.2.1 dTstu1Yang等[24]通过将水稻中一个Stowaway-like的MITE序列和Mariner-like自主转座子转座酶编码序列扩增出来，分别构建到表达载体中，共同转化到酵母中，检测发现该MITE在转座酶的作用下发生转座，整合到酵母基因组中。然而这只是通过体外试验间接说明了Stowaway类的MITEs有转座活性，并未在植物基因组中证实。次年，研究人员在马铃薯Solanum tuberosum L.表皮颜色变化的研究中发现一个新的具有转座活性的MITE，其在不同品种的马铃薯中存在插入多态性[44]，将其命名为dTstu1。经过分析发现，dTstu1序列有239 bp，其中A/T含量是67%，两端TIR序列为CTCCCTCYGTC，TSD序列与Stowaway类转座子的序列一致，为TA序列[11]。这是第一次在植物体内发现具有转座活性的Stowaway-like家族的MITEs。
随后，为了研究dTstu1对马铃薯表皮颜色变化的调控机制，Momose等从三倍体栽培品种72218 (块茎表皮为红色)的叶子上获取原生质体，通过体外细胞培养获得其组培苗[45]。三倍体栽培的72218品种和组培苗JKR品种的基因组中存在F3’5’H基因，该基因的第一个外显子中有dTstu1插入，该MITE的插入导致一个终止子(GTA)编码，产生一个只有24个氨基酸的截短体蛋白；而在组培苗JKP品种的该基因位置，dTstu1发生缺失，使得缺失dTstu1的F3’5’H基因编码一个含510个氨基酸的完整蛋白[46]。dTstu1的跳跃导致F3’5’H基因合成不同的蛋白，致使后期块茎表皮细胞中二氢山奈酚中羟基基团数不同，合成的花青素也不一样：72218品种和JKR品种的二氢山奈酚合成天竺葵色素，使块茎表皮表现为红色；而JKP品种块茎表皮细胞中二氢山奈酚比另两个品种中的多出两个羟基，合成牵牛花色素，表现为块茎紫色。整个研究过程表明双子叶植物中存在着具有活性的Stowaway类转座子，并且该MITE的插入和缺失会导致下游基因的表达，改变表型。
3.2.2 MITE-39周倩倩[32]通过RepeatMasker (www.reoeatmasker. org)软件，在毛竹基因组数据库中搜索出启动子中的MITEs。根据搜索出的序列设计引物，通过实验发现并验证，在毛竹基因PH01003704G0280的启动子有一个MITE元件，该MITE在不同野生实生苗中存在插入多态性。经分析发现，该MITE全长260 bp，TIR为CTCCCTCCGTTCTTA AATA，TSD序列为TA，属于Stowaway-like MITE，命名为MITE-39。利用定量PCR研究该MITE在启动子中的作用，发现当该MITE插入PH01003704G0280基因的上游启动子时，会下调该基因的表达量；而该MITE转座离开后，该抑制会被解除，基因表达水平得以恢复。由于实验中所用的实生苗为半同胞苗，是同一母本但不一定是同一父本，而实生苗生长环境均统一且适宜，作者推测认为MITE-39的转座可能是因为来源的父本基因不同导致的。
3.3 其他MITE家族的活性转座子3.3.1 Mutator家族的AhMITE12004年，Patel等[33]在花生Arachis hypogaea L.的脂肪酸合成研究中发现一类MITEs转座子，发现当这个MITE插入编码合成脂肪酸的基因(ahFAD2B)中，ahFAD2B基因发生突变，不能正常合成脂肪酸。比对该家族MITEs序列发现其含有25 bp的TIR和9 bp的TSD，既不属于Stowaway家族也不属于Tourist家族，而是属于Mutator家族。2012年，Shirasawa等[47]对几个花生品种中AhMITE1进一步研究，首先从富含MITEs的A. hypogaea花生品种的基因组数据库中比对获取504条AhMITE1，大小在201–223 bp不等，平均GC含量30.1%。将504条AhMITE1的5′和3′端的9 bp的TSD序列与已报道的花生突变体中的AhMITE1的TSD比较，发现有286条AhMITE1的TSD与之前报道的完全匹配，而其余218条出现1到9 bp不等的错配，这218条序列有可能在TSD、TIR序列或转座子内部发生突变。
为了研究AhMITE1的活性，取4种花生品种Nakateyutaka、YI-0311、Satonoka和Kintoki的种子。取一部分Nakateyutaka种子，经过γ射线处理后发苗，培育两代，取第二代M2叶子进行PCR扩增，与原4个花生品种的序列比对，发现经过γ射线处理后，至少在AhTE0433、AhTE0426、AhTE0121三个位点的AhMITE1具有活性，发生转座，并伴有一到两个碱基插入或突变。
4 总结与展望30年前，在转座子发现初期，转座子一直被认为是没有用的DNA片段[48]，随着人们对转座子研究的不断深入，发现转座子的插入、切除和扩增改变着基因组的结构和大小，继而影响了基因的表达，促使物种多样性的形成[49]。而MITEs转座子作为特殊的DNA转座子，由于其拷贝数高，插入多态性高，而受研究者青睐。本文总结了近几年鉴定具有转座活性的MITEs，发现已鉴定的活性MITEs大部分属于Tourist家族。
目前已被报道具有转座活性的MITEs共有8个家族：包括水稻中的mPing、mGing两个家族，毛竹中的PhTourist1家族、PhTst-3和MITE-39三个家族，还有烟草中的TMi1家族、土豆中的dTstu1家族以及花生中的AhMITE1家族。本文汇集了近几年来这些被发现并鉴定具有转座活性的MITEs，总结了这些活性MITEs的TIRs、TSDs、插入偏好性等特性，以及这些活性MITEs转座后对附近基因的影响，例如mPing影响水稻种子颖叶的长细，dTstu1影响马铃薯表皮颜色调控基因，PhTst-3插入基因启动子下调下游基因的表达等，这些结果表明，MITEs的转座很可能会调控附近植物基因表达，甚至可能影响植物的表型，对植物基因组结构、进化或植物物种进化等有重要作用。
毛竹和水稻同属于禾本科植物，是我国东南部地区的重要经济竹种，其基因组中含有丰富的MITEs[43]，在毛竹表观遗传学研究中有重要的意义。我们通过研究毛竹基因组中的活性MITEs，分析其转座和扩增机制。在胡慧等[29]发现并鉴定具有转座活性的PhTourist1后，陈昂[31]、周倩倩[32]先后分别发现了另外两个具有转座活性的MITEs家族PhTst-3和MITE-39，发现这两个MITEs在基因的启动子区发生转座跳跃，比较转座前后该位置基因的表达，发现这两类MITEs的存在抑制沉默了下游基因的表达，而转座后该抑制被解除，下游基因表达水平恢复。这些发现为后续更多毛竹活性MITEs的研究发现、鉴定以及功能分析等作了基础性的铺垫。
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