李与琦1,2, 阳建华1, 张涛2, 孙新文1, 王新峰1
, 毛胜勇2, 成艳芬2, 朱伟云2 1. 石河子大学动物科技学院, 新疆 石河子 832003;
2. 南京农业大学消化道微生物研究室, 江苏 南京 210095
收稿日期：2019-10-02；修回日期：2019-12-02；网络出版日期：2019-12-27
基金项目：国家自然科学基金（31360558）；动物消化道营养国际联合研究中心开放课题；江苏省“一带一路”技术合作项目（BZ2018055）
*通信作者：王新峰, Tel:+86-993-2058077;E-mail:wxf-4@163.com;
成艳芬, E-mail:yanfencheng@njau.edu.cn.
摘要：[目的] 本试验旨在利用16S rDNA高通量测序技术研究不同比例微贮棉秆的添加对断奶湖羊瘤胃微生物区系的影响。[方法] 选择日龄相近、体重相似的湖羊30只，根据日粮中微贮棉秆的含量随机分为3组：对照组（S0）、50%微贮棉秆组（S50）和100%微贮棉秆组（S100），每组随机屠宰6只分析生长性能，并取瘤胃液进行瘤胃发酵参数和微生物区系分析。[结果] 饲喂50%微贮棉秆能够显著提高湖羊日增重和屠宰率（P < 0.05）。Bacteroidetes和Firmicutes是湖羊瘤胃的优势菌门，Prevotella和Unclassified Bacteroidales是湖羊瘤胃的优势菌属。日粮中添加100%微贮棉秆可以显著降低湖羊瘤胃菌群的多样性（P < 0.05）；显著降低Unclassified Bacteroidales和BF311的相对丰度（P < 0.05）。三条代谢通路甜菜素生物合成、吲哚生物碱生物合成和加压素调节水的重吸收随着微贮棉秆比例升高而显著增加（P < 0.05）。[结论] 饲喂50%微贮棉秆在提高日增重的同时对湖羊瘤胃微生物菌群结构与功能影响较小。在生产实践中，微贮秸秆添加量应低于50%。
关键词：微贮棉秆断奶湖羊微生物区系
Effect of different proportions fermented cotton stalk intake on rumen microflora of lambs
Yuqi Li1,2, Jianhua Yang1, Tao Zhang2, Xinwen Sun1, Xinfeng Wang1
, Shengyong Mao2, Yanfen Cheng2, Weiyun Zhu2 1. College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi 832003, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China;
2. Laboratory of Gastrointestinal Microbiology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu Province, China
Received: 2 October 2019; Revised: 2 December 2019; Published online: 27 December 2019
*Corresponding author: Xinfeng Wang, Tel: +86-993-2058077;E-mail:wxf-4@163.com;
Yanfen Cheng, E-mail:yanfencheng@njau.edu.cn.
Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China (31360558), by the Open Topic of the National Center for International Research on Animal Gut Nutrition and by the Jiangsu Province "Belt and Road" Technical Cooperation Project (BZ2018055)
Abstract: [Objective] The objective of this study was to assess the effect of fermented cotton stalk in the diet on rumen microflora of weaned lambs by using high-throughput sequencing technology. [Methods] Thirty Hu sheep were selected and randomly divided into three groups according to different proportions of fermented cotton stalk in the diet:the control (S0), 50% fermented cotton stalk (S50) and 100% fermented cotton stalk (S100), six sheep were randomly slaughtered in each group to analyze their growth performance, rumen fermentation parameters and microflora analysis. [Results] Feeding 50% fermented cotton stalk can significantly improve the daily gain and slaughter rate of lambs (P < 0.05). Bacteroidetes and Firmicutes are the dominant phylum in the rumen, Prevotella and Unclassified Bacteroidales are the dominant genus of the rumen of the lambs. Adding 100% fermented cotton stalk to the diet could significantly reduce both the diversity of rumen microflora and the relative abundance of Unclassified Bacteroides and BF311 (P < 0.05). Three metabolic pathways significantly increased as the proportion of fermented cotton stalk increased (P < 0.05). [Conclusion] Feeding 50% fermented cotton stalk had little effect on the structure and function of rumen microflora while increasing daily weight. In production practice, the content of fermented stalk should be lower than 50%.
Keywords: fermented cotton stalksweaning lambsmicroflora
我国棉花的栽种已有久远的历史，新疆地区作为中国的三大产棉区之一，棉花种植面积达到3700多万亩，占全国棉花种植面积的80%[1]。大面积的棉花种植为新疆本土带来了极其丰富的棉秆资源，其年产量约占秸秆总量的三分之一，位居新疆农作物秸秆产量之首[2]。但棉花秸秆因其半纤维素含量低、木质素和游离棉酚含量高等特点很难被饲料化利用[3-4]，大量秸秆被农户在田间地头焚烧或丢弃，这既会占用大量农村土地、影响环境卫生，还会成为火灾隐患。因此，这就造成了一个两难的局面：一方面新疆各地畜牧业发展正在面临饲草料供应不足的难题，另一方面每年棉花收获后产生的大量棉秆不能得到充分合理的利用，如何更科学、合理有效地利用棉花秸秆资源变得越来越重要。
使用微生物处理棉秆是一种理想的棉秆利用途径，棉花秸秆的微贮只需要添加少量高效的微生物活性菌种，用量少、成本低，且微贮制作过程简单，制作季节长，可常年使用[5-7]。陈柯等[8]以风干秸秆和发酵秸秆饲喂山羊，结果表明微生物发酵秸秆能够提高山羊的生产性能，并能提高山羊的免疫功能。李建臻等[9]研究微贮水稻秸秆的营养价值及其对麻羊消化率、采食量的影响，结果表明微贮秸秆质地柔软湿润、适口性好，饲喂微贮秸秆后麻羊的采食量及增重均有提高。刘家平等[10]使用不同处理的棉花秸秆饲喂小尾寒羊，结果表明以微贮棉花秸秆为主要日粮的试验组的日增重、经济效益均显著高于对照组。为进一步挖掘棉秆的饲用价值，为棉秆的微贮发酵提供合适的条件依据，本试验选用早期断奶湖羊为试验动物，使用不同比例微贮发酵棉秆饲喂湖羊并分析其瘤胃微生物区系的变化，探究发酵棉秆对湖羊瘤胃菌群的影响，为微贮棉秆在畜牧业中的合理使用提供理论依据。
1 材料和方法 1.1 试验设计与试验动物 试验于2017年4月20日至2017年7月1日在新疆生产建设兵团农六师新湖总场晨旺养殖专业合作社进行，试验采用单因子随机试验设计的方法，随机选择试验组和对照组，选用50–60日龄体质健康、体重相似(16–18 kg)的公湖羊30只，分为3组，每组10只。分别饲喂3种添加不同微贮棉秆比例的混合粗饲料，即S0组：饲喂100%青干草；S50组：饲喂50%青干草+50%微贮棉秆；S100组：饲喂100%微贮棉秆。
1.2 试验日粮与饲养管理 试验中所用棉花秸秆通过自动采棉机打碎，采取切断揉软的方式改变棉花秸秆的结构，使其便于与微贮制剂充分接触，每段秸秆长度约为3 cm。微贮棉秆配方：棉花杆和甜菜渣比例为7:3 (干物质基础)，添加0.2%菌液、0.2%尿素和0.05%食盐，使混合体系水分含量保持在65%–70%，青贮窖密封混合发酵90 d。试验中采用的复合菌剂(植物发酵复合菌剂，新疆石大德润生物科技公司)主要由枯草芽孢杆菌(3.4×105 CFU/mL)、酵母菌(9.7× 109 CFU/mL)、乳酸菌(6.4×109 CFU/mL)等菌种复合而成。各组基础日粮营养水平见表 1。
表 1. 基础日粮营养水平(干物质基础) Table 1. Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis)
| Items | Treatments | ||
| S0 | S50 | S100 | |
| Metabolic energy/% | 12.77 | 12.86 | 12.56 |
| CP/% | 6.18 | 7.59 | 8.89 |
| NDF/% | 46.95 | 59.51 | 70.22 |
| ADF/% | 31.95 | 46.22 | 61.12 |
| Ca/% | 0.41 | 0.42 | 0.43 |
| P/% | 0.24 | 0.26 | 0.29 |
| S0: 100% dried hay; S50: 50% dried hay + 50% fermented cotton stalk; S100: 100% fermented cotton stalk. | |||
表选项
试验羊在条件一致的圈舍内饲管，采用全舍饲饲养管理。7 d预饲，预饲期内进行分组编号、圈舍清理和疫病防治。试验羊采用分栏饲喂的方式，每天早晚饲喂2次(09:30、19:30)，先粗后精，在饲喂同等精料补充料(表 2)的条件下，饲喂微贮棉秆混合料，试验羊自由采食粗饲料并自由饮水，每次饲喂前清理料槽中剩余的饲草，称重并记录。试验开始和结束连续2 d早晨空腹称重，计算日增重，用以分析生长性能。120日龄时，每组随机选取6只进行屠宰并采集瘤胃液，–20 ℃保存以备DNA提取，并分析瘤胃发酵参数。
表 2. 精料补充料配方及营养水平(%) Table 2. Concentrate supplement formula and nutritional levels
| Items | Levels | Nutrient content | Levels |
| Corn | 56.00 | CP | 19.60 |
| Wheat bran | 17.50 | CF | 10.38 |
| Soybean meal | 12.50 | Ash | 15.83 |
| Cottonseed meal | 10.90 | Ca | 1.26 |
| CaHPO4 | 1.00 | P | 0.53 |
| Stone powder | 1.00 | NaCl | 1.05 |
| Salt | 0.10 | Energy | 37.05 |
| Trace element | 1.00 | ||
| Total | 100.00 |
表选项
1.3 测定项目及方法 pH值采用pH211型台式酸度计(HANNA instruments，意大利)直接测定。
参照Weatherburn的方法[11]测定氨态氮(苯酚-次氯酸钠比色法)和乳酸(对羟基联苯比色法)。配制苯酚溶液和次氯酸钠溶液用于氨态氮测定，1000 mL苯酚溶液含有C5H4FeN6Na2O3 50 mg，结晶苯酚9.9757 g；1000 mL次氯酸钠溶液含有NaOH 5 g，Na2HPO4·7H2O 38 g，次氯酸钠溶液50 mL。测定时将1 mL待测样品加入4 mL 0.2 mol/L HCl溶液中混匀，加入2.5 mL苯酚试剂和2.5 mL次氯酸钠溶液摇匀，60 ℃水浴10 min。反应结束后冷却，在560 nm波长测定OD值，样品中NH4Cl浓度利用标准曲线得出。配制标准乳酸溶液、20%硫酸铜溶液、对-羟基联苯试剂和5%氢氧化钠溶液用于乳酸测定。1000 mL标准乳酸溶液含有乳酸钙1.730 g；100 mL 20%硫酸铜溶液含有硫酸铜20 g；100 mL对-羟基联苯试剂含有对-羟基联苯1.5 g，5% NaOH溶液20 mL。测定时在1 mL发酵饲料浸提液中加入一滴硫酸铜溶液、6 mL浓硫酸，100 ℃水浴5 min，冷却后加入0.2 mL对-羟基联苯试剂，30 ℃水浴30 min，冷却后在560 nm波长测定OD值。
参照Makkar的方法[12]利用考马斯亮蓝测定瘤胃中的微生物蛋白。1000 mL考马斯亮蓝溶液含有考马斯亮蓝G250 100 mg，85%磷酸溶液100 mL，过滤后使用。测定时将样品解冻离心后弃上清，将底物加入0.5 mL NaOH，水浴、离心后取上清加入考马斯亮蓝，在595 nm波长测定OD值。
1.4 总DNA提取 参照Zoetendal[13]的方法对DNA进行提取。解冻的瘤胃液涡旋后在4 ℃条件下10000×g离心15 min，弃上清，将沉淀物转移至锆珠管中，加入CTAB缓冲液之后利用珠磨法对细胞进行破壁处理，然后利用酚-氯仿-异戊醇(DNA提取液)对总基因组DNA进行抽提。DNA样品质量采用Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific, Madison, Wisconsin, 美国)可见分光光度仪进行检测，样品质量合格的标准为：吸光值OD260/280在1.80至2.00之间。
1.5 湖羊瘤胃液的高通量分析 瘤胃液完成DNA提取并确定质量合格后，利用1%琼脂糖凝胶进行电泳检验。按指定测序区域(V3+V4区)，合成带有barcode的特异引物。PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检验，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN Corporation，美国)回收PCR扩增产物。将PCR产物用QuantiFluorTM-ST荧光定量系统(Promega Corporation，美国)进行定量检测，然后使用Illumina Miseq测序平台对样品进行测序。
测序原始数据经QIIME(version 1.9)进行序列拼接与质量过滤，删除小于250 bp的序列，去除序列尾部质量值小于20的碱基，拼接时两条序列overlap长度大于10 bp。使用UCHIME对过滤后的序列进行OTU(Operational Taxonomic Units)聚类，将相似性达到97%及以上的序列归为同一OTU。在此基础上，利用QIIME(version 1.9)进行α多样性和β多样性分析，并利用Greengene数据库(version 13.8)进行分类信息注释。在Galaxy(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)进行LEfSe分析及菌群功能预测[14]。测序原始数据提交至SRA数据库，登录号为SRP149061。
1.6 数据处理与分析 数据通过Excel2016初步整理后，采用IBM SPSS Statistics 20.0软件(IBM Corp，美国)进行统计分析，利用单因素ANOVA中的Duncan法比较羔羊生长性能和瘤胃发酵参数的差异，利用非参数Kruskal-Wallis秩和检验比较湖羊瘤胃微生物菌群的差异，使用GraphPad Prism 7软件(GraphPad Software，美国)处理分析过的数据。置信区间为95%，其中P < 0.1为有上升或下降趋势，P < 0.05为差异显著。数据以平均值±标准误的形式表示。
2 结果和分析 2.1 饲喂微贮棉秆对湖羊生长性能的影响 饲喂不同比例微贮棉秆对湖羊生长性能的影响结果见表 3。由表 3可知，三组间日增重差异显著(P < 0.05)，其中S50组最高，为56.6±18.3 g/d，比S100组提高了21.38%。S50组屠宰率最高，S100组最低，三组间存在显著差异(P < 0.05)，且S50组屠宰率比S100组提高了6.03%。采食量和料重比的结果随着饲料中微贮棉秆比例的增加而增加，三者从低到高分别是S0组、S50组和S100组，三组间存在显著差异(P < 0.05)。
表 3. 微贮棉秆对湖羊生长性能的影响 Table 3. Effects of fermented cotton stalk on growth performance of lambs
| Items | Treatments | P-value | ||
| S0 | S50 | S100 | ||
| Original weight/kg | 16.21±2.7 | 17.51±1.9 | 17.43±1.6 | 0.393 |
| Final weight/kg | 19.32±2.7 | 20.43±2.1 | 20.11±1.9 | 0.801 |
| Daily body weight gain/(g/d) | 51.93±17.8b | 56.62±18.3a | 44.51±16.2c | < 0.001 |
| Slaughter rate/% | 41.51±0.5b | 43.14±0.7a | 40.52±0.2c | < 0.001 |
| Feed intake/kg | 0.62c | 0.91b | 1.04a | < 0.001 |
| F/G | 11.87c | 16.04b | 23.57a | < 0.001 |
| S0: 100% green hay; S50: 50% green hay + 50% fermented cotton stalk; S100: 100% fermented cotton stalk. a.b.c Significant differences, P < 0.05. | ||||
表选项
2.2 饲喂微贮棉秆对湖羊瘤胃发酵参数的影响 由表 4可以看出，三组间氨态氮和微生物蛋白浓度无显著差异(P > 0.05)，乳酸浓度随饲料中微贮棉秆比例的增加而增加，且三组间差异显著(P < 0.05)。pH值随饲料中微贮棉秆比例的增加而显著降低(P < 0.05)。
表 4. 微贮棉秆对湖羊瘤胃发酵参数的影响 Table 4. Effects of fermented cotton stalk on rumen fermentation parameters of lambs
| Items | Treatments | P-value | ||
| S0 | S50 | S100 | ||
| NH3-N/(μg/mL) | 0.12±0.02 | 0.14±0.03 | 0.12±0.07 | 0.219 |
| Lactate/(μg/mL) | 0.20±0.03c | 0.56±0.03b | 1.14±0.07a | < 0.001 |
| pH value | 6.52±0.22a | 6.42±0.11b | 6.22±0.14c | < 0.001 |
| Microbial crude protein/(μg/mL) | 11.86±0.67 | 11.99±0.62 | 11.69±0.48 | 0.937 |
| S0: 100% green hay; S50: 50% green hay + 50% fermented cotton stalk; S100: 100% fermented cotton stalk. a.b.c Significant differences, P < 0.05. | ||||
表选项
2.3 饲喂微贮棉秆对湖羊瘤胃菌群多样性的影响 去掉低质量序列后，得到656564条高质量序列，S0、S50和S100组的有效序列分别为37807±1928、32815±3408和38806±2399条。
不同比例微贮棉秆对瘤胃菌群α多样性的影响见表 5。由表 5可知，S0组与S50组OTU数量、Chao1指数及Shannon指数均显著高于S100组(P < 0.05)。
表 5. 微贮棉秆对湖羊瘤胃菌群多样性和丰度的影响 Table 5. Effects of fermented cotton stalk on rumen bacterial diversity and abundance of lambs
| Items | Treatments | P-value | ||
| S0 | S50 | S100 | ||
| Number of OTU | 1039.00±19.53a | 1056.00±24.85a | 950.00±13.17b | 0.004 |
| Coverage /% | 99.54±0.02 | 99.53±0.03 | 99.50±0.01 | 0.491 |
| Chao1 index | 1105.26±16.49a | 1130.32±17.00a | 1032.00±15.43b | 0.002 |
| Shannon index | 8.40±0.13a | 8.62±0.09a | 8.06±0.10b | 0.006 |
| S0: 100% green hay; S50: 50% green hay + 50% fermented cotton stalk; S100: 100% fermented cotton stalk. a.b Significant differences, P < 0.05. | ||||
表选项
主坐标分析结果显示S0组和S50组比较接近，两组间差异较小，但S100组与S0组和S50组之间距离较远，说明差异较大(图 1)。
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| 图 1 微贮棉秆对湖羊瘤胃菌群影响的PCoA分析 Figure 1 PCoA analysis of rumen microbiota of lambs. S0: 100% green hay; S50: 50% green hay + 50% fermented cotton stalk; S100: 100% fermented cotton stalk. |
| 图选项 |
2.4 饲喂微贮棉秆对湖羊瘤胃菌群组成的影响 通过图 2-A可以看出，Bacteroidetes和Firmicutes是组成湖羊瘤胃微生物门水平的主要菌群，两者之和占湖羊瘤胃微生物总菌的87.35%–89.34%。Bacteroidetes是断奶湖羊瘤胃内门水平上的第一大菌群，平均相对丰度为64.64%；Firmicutes排在第二位，平均丰度为23.60%。添加微贮棉秆对瘤胃菌群门水平没有显著影响(P > 0.05)。
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| 图 2 微贮棉秆对湖羊瘤胃微生物在门水平和属水平上的影响 Figure 2 Composition of rumen microbiota at the level of phylum and genus in lambs. S0: 100% green hay; S50: 50% green hay + 50% fermented cotton stalk; S100: 100% fermented cotton stalk. |
| 图选项 |
图 2-B为饲喂不同比例微贮棉秆后瘤胃菌群在属水平上的变化，共有20个属相对丰度大于1%。其中Prevotella和Unclassified Bacteroidales是组成湖羊瘤胃微生物属水平的主要菌群，两者之和占湖羊瘤胃微生物的50.04%–55.59%。Prevotella是湖羊瘤胃属水平上的第一大类菌群，平均丰度为30.63%；Unclassified Bacteroidales排在第二位，平均丰度为21.34%。
2.5 饲喂微贮棉秆对湖羊瘤胃菌群组成差异的影响 LEfSe分析湖羊日粮中添加不同比例微贮棉秆后微生物菌群的差异如图 3-A所示。LDA值超过2.0的差异物种有23个，其中8个物种的LDA效应在S0组相对较高，6个物种的LDA效应在S50组相对较高，9个物种的LDA效应在S100组相对较高。23个物种在进化分支中的种属关系如图 3-B所示。
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| 图 3 LEfSe分析微贮棉秆对湖羊瘤胃菌群的影响 Figure 3 LEfSe analysis of rumen microbiota in Hu sheep fed with fermented cotton stalk. S0: 100% green hay; S50: 50% green hay+50% fermented cotton stalk; S100: 100% fermented cotton stalk. |
| 图选项 |
将三组中LDA值超过4.0的物种Unclassified Bacteroidales、BF311和Bacteroidaceae的相对丰度做单独分析，结果见图 4。图中实线代表各样品对应OTU的相对丰度平均值，虚线代表各样品对应OTU的相对丰度中位数。
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| 图 4 LDA分析微贮棉秆对湖羊瘤胃菌群的影响 Figure 4 LDA analysis of rumen microbiota in Hu sheep fed with fermented cotton stalk. S0: 100% green hay; S50: 50% green hay + 50% fermented cotton stalk; S100: 100% fermented cotton stalk. |
| 图选项 |
2.6 微贮棉秆对湖羊瘤胃微生物代谢功能的影响 微贮棉秆对湖羊瘤胃微生物代谢显著影响的十条KEGG通路见图 5-A，其中Betalainbiosynthesis (图 5-B)、Indole alkaloidbiosynthesis (图 5-C)和Vasopressin-regulatedwater reabsorption (图 5-D)三条通路随着微贮棉秆比例升高而显著增加(P < 0.05)。
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| 图 5 瘤胃菌群KEGG代谢通路的差异分析 Figure 5 Structure of KEGG pathway with differences in rumen flora. S0: 100% green hay; S50: 50% green hay+ 50% fermented cotton stalk; S100: 100% fermented cotton stalk. The error bars represent the standard error of the mean (n=6). *P < 0.05. |
| 图选项 |
3 讨论 不同结构组成的饲料具有不同的适口性及营养水平，其不仅影响反刍动物的采食量，还会影响反刍动物对饲料的消化利用效果, 进而影响反刍动物的生长性能[15]。本研究中随着微贮棉秆在饲料中比例的增加，湖羊的采食量也随之增加。饲喂青干草和微贮棉秆各一半时，湖羊的日增重和屠宰率显著高于其他两组，这说明适当添加微贮棉秆可以在提高湖羊采食量的同时提高湖羊的日增重及屠宰率。高飞(2011)[16]使用微生态制剂处理过的玉米秸秆饲喂白绒山羊，发现饲喂加入微生态制剂的饲料能够显著提高肉羊的育肥性能。郑爱荣等[17]研究微贮小麦秸秆对杜寒杂交羊生产性能的影响，结果表明微贮小麦秸秆能够提高杜寒杂交羊的日增重，具有较好的经济效益，这与本试验结果一致。
瘤胃中的氨态氮来自于饲料中蛋白质与尿素等物质的降解，氨态氮的浓度在很大程度上影响着瘤胃内微生物蛋白的产量。本试验中，不同处理组对湖羊血清中的尿素氮和微生物蛋白的含量无显著影响，但有先增加再降低的趋势。Argyle等[18]报道，当瘤胃内pH值低于6.2时，会降低瘤胃内纤维降解菌活性。完全饲喂微贮棉秆的S100组的pH值和乳酸浓度显著高于其他两组，这表明发酵棉秆在饲料中的添加并非越多越好，需要有一个合适的比例。
瘤胃消化功能的正常运行与宿主动物的健康状况密切联系，而瘤胃微生物的组成与结构是影响瘤胃发酵功能的重要因素，其与宿主之间的关系是互惠共生的[19-21]。诸多要素影响瘤胃微生物区系的结构，其中最重要的因素是日粮的组成[22]。本研究中完全饲喂微贮棉秆的S100组Shannon指数最低且OTU数量最少，说明其菌群多样性最低。LEfSe分析的结果也显示，LDA值超过4.0的Bacteroidaceae和BF311在S0组中的相对丰度最高，在S100组中的相对丰度最低。有研究表明，饲粮成分越复杂，瘤胃微生物多样性越高[23]。董瑞阳(2014)[24]研究饲料中添加不同比例玉米青贮对瘤胃微生物菌群的影响，结果表明当玉米青贮与苜蓿干草的比例从10 kg︰6 kg上升到23 kg︰2 kg时，瘤胃内总菌数量减少。Kong等[25]通过荧光定量法研究不同日粮组成对瘤胃微生物群落的影响，结果表明同时饲喂大麦青贮与干草饲料的奶牛瘤胃微生物群落比仅饲喂干草饲料的更为丰富，这与本试验结果一致。
湖羊20日龄时在其瘤胃内就可以发现Bacteroidetes和Firmicutes菌[26]。Shoaie等[27]通过代谢模型也证明了Bacteroidetes和Firmicutes是肠道中主要的菌门。本研究中不管是否在断奶湖羊的日粮中添加微贮棉秆，Bacteroidetes(拟杆菌门)和Firmicutes(硬壁菌门)都是组成湖羊瘤胃门水平微生物的主要类群。大量研究表明，瘤胃内Bacteroidetes和Firmicutes的丰度水平会影响反刍动物的日增重，Myer等[28]研究来自不同饲喂效果的奶牛的瘤胃微生物，发现Bacteroidetes (53%–63%)和Firmicutes(23%–33%)在每个样品中都占主导地位，且Firmicutes数量的增加与脂肪的沉积有关；Elie等[29]研究瘤胃微生物在调节乳成分的潜在作用时也证明了随着Firmicutes的增加会提高乳脂产量与脂肪沉积。本研究中随着微贮棉秆在断奶湖羊日粮中比例的不断升高，Firmicutes的丰度出现先升高、后降低的情况，说明当微贮棉秆和青干草在日粮中的添加量各一半时，有助于断奶湖羊的增重，这与实际日增重的结果相一致。
反刍动物瘤胃内栖息着各种各样的微生物，主要包括原虫、细菌和厌氧真菌。粗饲料中的纤维物质就是依靠这些微生物的快速降解从而转化为营养物质满足反刍动物的能量需求，而纤维素的降解主要受到纤维素降解菌的影响[30-32]。有研究表明，Prevotella菌属含有丰富的水解淀粉蛋白，可以起到高效降解纤维素的作用[33]。谢骁[34]研究饲喂苜蓿干草对湖羊瘤胃微生物菌群的影响，发现瘤胃发酵半小时后Prevotella菌属快速定植于粗饲料表面并进行粗纤维降解；Purushe等[35]通过基因组分析也证明了Prevotella菌属在肠道中强大的非纤维素多糖降解作用。在本研究中，Prevotella在S50组中有着较高的丰度，这说明适当添加微贮棉秆在饲料中可以提高瘤胃对粗纤维的降解能力。
PICRUSt可以利用已测得的瘤胃微生物基因组16S rDNA序列对菌群的代谢功能进行预测，不仅能分析出相应的KEGG通路，还能得到每个样本中相关的拷贝数。在饲料中添加微贮棉秆有利于增强抗利尿激素血管加压素在肾脏中对水循环的调节，改善湖羊抗利尿激素血管加压素对尿液的重吸收能力，完全饲喂微贮棉秆的S100组与完全饲喂青干草的S0组相比，与加压素调节水重吸收的相关序列拷贝数明显增多，这暗示着饲喂微贮棉秆能改善湖羊体内加压素调节水重吸收的能力，具体的代谢机制还需进一步研究。
4 结论 日粮中添加100%微贮棉秆会降低瘤胃微生物多样性，对其菌群结构和功能产生显著影响；日粮中添加50%微贮棉秆对瘤胃微生物多样性、菌群结构及功能的影响较小，且能提高湖羊日增重。因此微贮棉秆在断奶湖羊中的使用量不应超过50%。
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