张梦寒1,2, 李巧玉1,2, 周朝晖3, 卢丽玲3, 堵国成1,4, 陈坚1,5, 方芳1,2
1.江南大学生物工程学院, 江苏 无锡 214122;
2.工业生物技术教育部重点实验室, 江苏 无锡 214122;
3.广东珠江桥生物科技股份有限公司, 广东 中山 528415;
4.糖化学与生物技术教育部重点实验室, 江苏 无锡 214122;
5.粮食发酵工艺与技术国家工程实验室, 江苏 无锡 214122
收稿日期：2016-12-22；修回日期：2017-02-15；网络出版日期：2017-03-02
基金项目：国家自然科学基金（31371821）；广东省科技计划项目（2015B020205002）
*通信作者：方芳, Tel: +86-510-85918307; Fax: +86-510-85918309; E-mail: ffang@jiangnan.edu.cn
摘要：[目的]通过诱变育种提高解淀粉芽孢杆菌JY06利用精氨酸的能力，并将其用于降低酱油中的氨基甲酸乙酯及前体，从而提高酿造酱油的安全性。[方法]采用等离子诱变和紫外诱变两种诱变育种方法对解淀粉芽孢杆菌JY06进行突变，应用高通量筛选手段获得具有高精氨酸利用能力的突变株，验证突变株降低酱油中氨基甲酸乙酯的能力。[结果]获得了12株精氨酸利用能力提高的突变株，与出发菌株JY06相比，突变株C12和E6可使酱油中瓜氨酸含量分别降低了15.6%和14.7%，EC的含量分别降低了19.3%和13.1%。[结论]通过等离子诱变和紫外诱变进一步提高了解淀粉芽孢杆菌JY06降低酱油中EC及其前体瓜氨酸的能力，具有控制或减少酱油中生物危害物的应用潜力。
关键词： 酱油 氨基甲酸乙酯 瓜氨酸 解淀粉芽孢杆菌 诱变育种
Reduction of ethyl carbamate in soy sauce by Bacillus amyloliquefaciens mutants
Zhang Menghan1,2, Li Qiaoyu1,2, Zhou Zhaohui3, Lu Liling3, Du Guocheng1,4, Chen Jian1,5, Fang Fang1,2
1.School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China;
2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China;
3.Guangdong Pearl River Bridge Biological Limited Corporation, Zhongshan 528415, Guangdong Province, China;
4.Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China;
5.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China
Received 22 December 2016; Revised 15 February 2017; Published online 2 March 2017
*Corresponding author: Fang Fang, Tel: +86-510-85918307; Fax: +86-510-85918309; E-mail: ffang@jiangnan.edu.cn
Supported by the National Natural Science Foundation of China (31371821) and by the Technology Research Program of Guangdong, China (2015B020205002)
Abstract: [Objective]To prepare mutants of Bacillus amyloliquefaciens JY06 stain with enhanced arginine consumption capability to reduce carcinogenic compound ethyl carbamate and its precursors in soy sauce.[Methods]Atmospheric and room temperature plasma (ARTP) and UV mutagenesis were used to mutate Bacillus amyloliquefaciens JY06, and a high-throughput screening approach was used to characterize mutants with high arginine utilization capability. The properties of mutants were studied following addition to soy sauce moromi during fermentation to initiate reduction of citrulline and ethyl carbamate.[Results]Twelve mutants with elevated arginine utilizing ability were obtained through ARTP and UV mutagenesis, of which C12 and E6 displayed the highest capacity for eliminating EC and citrulline. Compared with the JY06 parent strain, the addition of C12 or E6 to the moromi during soy sauce fermentation decreased citrulline content in soy sauce by 15.6% and 14.7%, and reduced ethyl carbamate by 19.3% and 13.1%, respectively.[Conclusion]Both ethyl carbamate and its precursor citrulline were significantly decreased in soy sauce by B. amyloliquefaciens JY06 mutants in the moromi during fermentation, demonstrating the potential of the mutants to control or eliminate toxic compounds in soy sauce and similar food products.
Key words: soy sauce ethyl carbamate citrulline Bacillus amyloliquefaciens mutagenesis
氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，简称EC)是一种广泛存在于发酵食品中的有害化学物质[1]，2007年被国际癌症研究机构(IARC)归类为2A级致癌物[2]。研究结果表明酱油中存在着氨基甲酸乙酯[3]，并且氨基甲酸乙酯的存在严重影响了酱油的食用安全性[4]。由于EC的热稳定性很好，形成后很难被降解，因此，通常采用降低或消除氨基甲酸乙酯的前体物质的方法达到降低或消除发酵食品中EC的目的。
发酵食品中氨基甲酸乙酯的前体物质主要包括乙醇、尿素、焦炭酸二乙酯、氨甲酰磷酸、氰化物和瓜氨酸[5]。酱油中氨基甲酸乙酯的前体物质有乙醇、尿素和瓜氨酸，其中乙醇和瓜氨酸为主要前体物质。已有研究证实，酱油发酵前期即乳酸发酵时期是瓜氨酸的主要积累时期[6]。酱油中的瓜氨酸的生成和积累主要是酱醪中细菌通过精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminase，ADI)途径对精氨酸的利用而形成[7-10]。因此，降低或消除酱油中EC的有效措施之一是减少或消除EC的主要前体物质瓜氨酸[6]。
在酱油发酵过程中，可通过强化能够利用瓜氨酸或优先利用瓜氨酸前体精氨酸且不积累瓜氨酸的菌株，达到控制酱油中瓜氨酸积累的目的。我们的前期研究结果表明，筛选自酱油酱醪的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) JY06可以利用精氨酸生成鸟氨酸并不积累瓜氨酸，将其添加至酱油发酵初期的酱醪中，发酵结束后酱油成品中EC及其前体瓜氨酸的含量都显著减少，并且对酱油的风味也有所改善[11-13]。
为了进一步降低酱油中EC含量和提高发酵食品的安全性，本研究将采用诱变育种的方法对解淀粉芽孢杆菌JY06进行改造，利用高通量筛选技术获得可高效利用精氨酸的菌株，进一步减少乳酸发酵时期瓜氨酸的积累量和产品中的EC含量。
1 材料和方法 1.1 菌株 解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens) JY06，本实验室保藏。鲁氏酵母ZQ01和鲁氏酵母ZQ02，广东珠江桥生物科技股份有限公司保藏。
1.2 试剂与培养基
1.2.1 试剂: 3, 5-二硝基水杨酸试剂：称取3, 5-二硝基水杨酸1 g，溶于20 mL的2 mol/L的NaOH溶液中，加入50 mL双蒸水，再加入30 g酒石酸钠，待溶解后用蒸馏水定容至100 mL。
用于精氨酸显色反应的显色剂[14]：(1) 40 g/L氢氧化钠溶液；(2) 80 g/L甲萘酚正丙醇溶液；(3) 0.5 mL/mL的双乙酰正丙醇溶液。
1.2.2 培养基: LB培养基(g/L)：酵母粉5、蛋白胨10、NaCl 10，pH 7.0±0.2。初筛培养基(g/L)：酵母膏5、牛肉膏5、胰蛋白胨5、NaCl 10、葡萄糖0.5、吐温-80 1.0、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·H2O 0.05、FeSO4·7H2O 0.4、柠檬酸三胺2.0、CaCO3 0.1、5-磷酸吡哆醛0.05、K2HPO4 2、精氨酸7、溴甲酚紫0.06，pH 6.0±0.2。精氨酸利用培养基(g/L)[15]：酵母膏5、牛肉膏5、胰蛋白胨5、NaCl 180、葡萄糖0.5、吐温-80 1.0、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·H2O 0.05、FeSO4·7H2O 0.4、柠檬酸三胺2.0、CaCO3 0.1、吡哆醛-5-磷酸0.05、K2HPO4 2.0、精氨酸5.0，pH 6.0±0.2。
1.3 诱变方法
1.3.1 紫外诱变: 取5 mL培养至对数生长期的菌液(菌浓为107 CFU/mL)，离心后弃上清，用PBS缓冲液(pH 7.0)清洗菌体2–3次后，向离心管中加入5 mL PBS缓冲液悬浮菌体，然后，取适量菌悬液加入无菌培养皿中，在15 W紫外灯30 cm处照射100 s，照射完成后将菌体转入无菌试管中并立即放入冰水中；在避光条件下取适量的照射菌液加到LB培养基中，在37 ℃、120 r/min摇床培养2–4 h；避光条件下将培养后菌液稀释涂布于LB固体培养基中，避光培养24–36 h。
1.3.2 等离子诱变: 将解淀粉芽孢杆菌JY06接种至LB液体培养基，37 ℃、220 r/min摇床培养至对数生长期(菌浓107 CFU/mL)。取10 μL的菌悬液滴加在无菌载玻片上，用ARTP (常压室温等离子体)进行等离子诱变。在100 W和10 SLM的条件下诱变60 s，将诱变后的菌悬液转移至装有1 mL生理盐水的无菌管中，稀释涂布于LB固体培养基，在37 ℃培养箱中培养24–36 h。
1.4 突变株初筛 突变株经ADI途径利用精氨酸并形成氨，氨的形成使培养基的pH增大，从而导致含有pH指示剂溴甲酚紫的培养基变成紫色[16-18]。利用这一原理，用Qpix420自动挑菌仪(美国Molecular Devices公司)挑取诱变后的单菌落，接种至含1 mL初筛培养基的96深孔板中，37 ℃、220 r/min摇床培养24 h后，离心收集上清液，采用酶标仪(美国Thermo Fisher公司)测定436 nm可见光下的吸光值(OD436)。以未接种的培养基作为对照，选择吸光值OD436相差较大的菌株进行复筛。
1.5 突变株复筛 精氨酸的侧链胍基在碱性介质中，可与甲萘酚和双乙酰的混合液反应生成紫红色的物质，此物质在OD540吸光值与精氨酸浓度呈线性关系[19]。即反应液的吸光值越小表明精氨酸被利用越多，依此对初筛得到的突变株进行复筛。
1.6 突变株传代稳定性考察 将经等离子和紫外诱变筛选得到的利用精氨酸能力较强的突变株接种至LB液体培养基，每隔24 h转接1次，至20 d传代培养200代后，考察突变株高效利用精氨酸特性的传代稳定性。
1.7 酱油发酵 日式酱油成曲由广东珠江桥生物科技股份有限公司提供。酱油发酵工艺为：将17.1 kg的成曲与23%的盐水(W:V)以体积比1:1.61的比例混合，混合后的酱醪转入2 L容器后开始发酵。在发酵的第0天分别添加107 CFU/mL解淀粉芽孢杆菌JY06或其突变株。发酵第7天向酱醪中加入107 CFU/mL鲁氏酵母(ZQ02)，发酵第23天加入107 CFU/mL鲁氏酵母(ZQ01)。发酵前23天控制发酵温度为(15±1)℃，发酵第23天至发酵结束为30 ℃恒温发酵。
1.8 分析方法
1.8.1 游离氨基酸的测定方法: 采用高效液相色谱法(HPLC法)进行测定[20]。测定前对样品进行前处理：取1 mL发酵液，12000 r/min离心10 min后去除菌体取上清。加入4倍体积5%的三氯乙酸，经孔径为0.22 μm的滤膜过滤。处理后的样品置于–20 ℃保存。
色谱条件：Agilent 1260色谱仪，色谱柱C18，250 mm×4.6 mm。检测器为VWD紫外检测器，检测波长338 nm，柱温40 ℃。
流动相A相(1 L)：无水乙酸钠5 g，四氢呋喃5 mL，三乙胺200 μL，pH 7.2。
流动相B相(1 L)：无水乙酸钠5 g，超纯水200 mL，甲醇400 mL，乙腈400 mL，pH 7.2。
1.8.2 EC的检测方法: 取一定量发酵结束后的酱油样品，95 ℃加热30 min，采用GC-MS对样品中的氨基甲酸乙酯进行测定，同时以未经加热处理的原油样品作为对照。
样品的处理：取10 g液体样品于100 mL烧杯中，然后添加1 mL n-氨基甲酸丙酯(nPC)溶液作为内标，再加入超纯水定容至40.0 g，然后将混合液转移至Extrelut QE celite的固相萃取柱中，用80 mL二氯甲烷进行洗脱，收集洗脱液，用旋转蒸发器在30 ℃水浴中将洗脱液浓缩至2–3 mL，再使用氮气将其浓缩至1 mL，将浓缩液转移至自动进样瓶中待测[21]。
色谱柱：J & W DB-WAX石英毛细柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升温程序：40 ℃保持0.75 min，以10 ℃/min升至60 ℃，然后以3 ℃/min升至150 ℃，然后迅速升至220 ℃，220 ℃保持4.25 min；载气(He)流速为1 mL/min，进样量为1 μL；不分流进样。
电子轰击(EI)离子源；电子能量70 eV；传输线温度为180 ℃；离子源温度为200 ℃；选择离子扫描(SIM)，定性离子m/z 62、m/z 74、m/z 89，定量离子m/z 62；激活电压为1.5 V。
1.8.3 酱油中还原糖的含量: 采用3, 5-二硝基水杨酸(DNS)方法测定；氨基酸态氮和总酸的测定方法参照Cui所述方法[22]；酱醪pH用pH计测定。
2 结果和分析 2.1 解淀粉芽孢杆菌诱变及高效利用精氨酸突变株的高通量筛选 前期研究证实，分离自酱醪的解淀粉芽孢杆菌JY06可将酱醪中精氨酸转化生成鸟氨酸，不积累中间产物瓜氨酸，从而显著减少了酱油中的EC[11-13]。为进一步提高酱油的食品安全性，采用诱变育种的方法改造菌株JY06，提高其利用精氨酸的能力，使其用于酱油发酵时进一步降低EC及其前体瓜氨酸含量。
分别用紫外诱变和等离子诱变方法对菌株JY06进行诱变，运用如图 1所示的高通量筛选策略，通过初筛和复筛，共筛选得到25株精氨酸利用能力高于出发菌株JY06的突变株。
 |
| 图 1 高效利用精氨酸JY06突变株的高通量筛选策略 Figure 1 Strategy for high-throughput screening of JY06 mutants with higher arginine utilization capability. |
| 图选项 |
2.2 突变株利用精氨酸能力的比较 酱醪发酵体系是高盐环境，对细菌利用精氨酸有抑制作用，并且能影响菌株ADI途径的代谢通量。为了获得在酱油发酵过程中精氨酸利用能力较高的菌株，考察了25株突变株在18% NaCl的盐胁迫条件下利用精氨酸的能力。通过比较，获得了12株在盐胁迫条件下具有比出发菌株JY06利用精氨酸能力高的突变株(表 1)。其中，等离子诱变突变株利用精氨酸的能力与对照菌株JY06相比提高了6.1%–18.0%；紫外诱变突变株利用精氨酸的能力与对照菌株JY06相比提高了5.1%–17.1%。在12株突变株中，菌株E6和C12分别是紫外诱变和等离子诱变效果最好的突变株，利用精氨酸能力分别比出发菌株JY06提高了17.1%和18.0%。对突变株利用精氨酸的能力与对照菌做显著性差异分析，结果显示PC12=0.007 < 0.05，PE6=0.008 < 0.05，说明突变株E6和C12利用精氨酸的能力与JY06相比差异性显著(表 1)。因此，选择突变株C12和E6进行后续研究。
表 1. 菌株利用精氨酸能力的比较 Table 1. Consumption of arginine by JY06 and its mutants
| Strain | ?Arg/(g/L) | P-value | ?Cit/(g/L) | ?Orn/(g/L) |
| JY06 | 4.90±0.03 | / | 0.00 | 2.94±0.04 |
| ARTP-B1 | 5.72±0.01 | 0.009 | 0.00 | 4.15±0.02 |
| ARTP-B3 | 5.65±0.03 | 0.012 | 0.00 | 4.03±0.05 |
| ARTP-C12 | 5.78±0.06 | 0.007 | 0.00 | 4.81±0.01 |
| ARTP-F5 | 5.62±0.04 | 0.015 | 0.00 | 3.81±0.03 |
| ARTP-G2 | 5.60±0.02 | 0.016 | 0.00 | 4.12±0.04 |
| ARTP-A1 | 5.68±0.05 | 0.011 | 0.06±0.01 | 3.81±0.01 |
| ARTP-F9 | 5.20±0.08 | 0.170 | 0.00 | 4.21±0.01 |
| ARTP-H5 | 5.52±0.03 | 0.024 | 0.00 | 4.61±0.02 |
| UV-A4 | 5.56±0.02 | 0.019 | 0.00 | 4.48±0.06 |
| UV-E6 | 5.74±0.01 | 0.008 | 0.00 | 4.58±0.03 |
| UV-A10 | 5.57±0.05 | 0.018 | 0.00 | 4.21±0.08 |
| UV-D10 | 5.15±0.10 | 0.243 | 0.00 | 4.35±0.05 |
| ARTP: ARTP mutagenesis; UV: UV mutagenesis; ?Arg: consumption of arginine; ?Cit and ?Orn production of citrulline and ornithine. | ||||
表选项
利用诱变技术提高菌株利用或合成某一物质的能力是一种对菌株进行非基因编辑的有效改造手段。程功等通过常压室温等离子诱变技术选育出了一株L-精氨酸高产菌株C. glutamicum ARG 3-16，其L-精氨酸的产量较原始菌株提高了49.79%[23]。郝刚等通过紫外(UV)和亚硝基胍(NTG)逐级诱变，获得1株能够积累L-精氨酸的菌株UN100-12 (SGr，AEr)，并且突变株具有较好的遗传稳定性[24]。本研究中通过等离子诱变和紫外诱变获得了利用精氨酸能力较好的菌株，为符合在实际生产中的应用要求，应考察突变株相关特性的传代稳定性。
2.3 菌株利用精氨酸的传代稳定性 为评估菌株利用精氨酸能力的传代稳定性，考察了JY06和2个突变株传代后利用精氨酸的能力。结果表明，传代200代后，JY06和突变株C12与E6利用精氨酸能力均有所下降，但是同JY06相比，突变株C12与E6利用精氨酸能力分别是JY06的1.97倍和1.81倍(图 2)，说明突变株比出发菌株具有更好的利用精氨酸能力的传代稳定性。
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| 图 2 解淀粉芽孢杆菌利用精氨酸能力的传代稳定性 Figure 2 The genetic stability of B. amyloliquefaciens strains in arginine utilization. ?Arg consumption of arginine. |
| 图选项 |
2.4 解淀粉芽孢杆菌JY06突变株用于减少酱油中EC 为了验证突变株用于减少酱油中氨基甲酸乙酯及其前体瓜氨酸的积累是否比出发菌株解淀粉芽孢杆菌JY06更有效，分别考察了添加解淀粉芽孢杆菌JY06、突变株C12和E6在酱油发酵过程中对酱醪中EC前体瓜氨酸生成和积累相关氨基酸(精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸)含量的影响。未添加解淀粉芽孢杆菌的对照，发酵终点时酱醪中瓜氨酸含量为4.5 g/L (图 3-A)。添加解淀粉芽孢杆菌JY06及其突变株的酱醪中瓜氨酸含量与未添加菌株的酱醪中瓜氨酸含量相比显著减少。此外，突变株对酱醪中瓜氨酸含量的控制与减少能力高于出发菌株JY06。由图 3-B–D可知，突变株C12和E6对精氨酸的利用比JY06提高了21.3%和14.8%；酱醪中瓜氨酸的含量分别比JY06减少了15.6%和14.7%；鸟氨酸的含量分别比JY06提高了3.1%和2.6%。以上结果说明突变株C12和E6降低酱油中EC前体瓜氨酸比解淀粉芽孢杆菌JY06更有效。此外，发酵结束后，添加了芽孢杆菌的酱油原油中未检测出EC，杀菌后酱油中添加了突变株C12和E6的酱油样品EC含量降低至13 μg/kg以下，分别比添加JY06的酱油中EC含量降低了19.3%和13.1% (表 2)。
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| 图 3 酱油发酵过程精氨酸代谢相关氨基酸含量的变化 Figure 3 Detection of amino acids corresponding to arginine utilization in the moromi during soy sauce fermentation. A: Control, detection of amino acids corresponding to arginine utilization in the moromi during soy sauce fermentation; B–D: Add JY06, C12 and E6 in soy sauce fermentation process of arginine, citrulline and ornithine concentration change. |
| 图选项 |
表 2. 酱油中氨基甲酸乙酯含量比较 Table 2. Quantification of ethyl carbamate in soy sauce
| Sample | Control | JY06 | C12 | E6 |
| EC*(μg/kg) | 11.3±0.2 | ND | ND | ND |
| EC**(μg/kg) | 45.2±0.7 | 14.5±0.3 | 11.7±0.2 | 12.6±0.5 |
| *: Before sterilization; **: Sterilization (heated at 95 ℃ for 30 min); ND: not detected. | ||||
表选项
对于以单一菌株为生产菌株或是体系中有害物的产生与主要生产菌株代谢相关的发酵过程来说，改造生产菌株的代谢特性是一种控制体系中有害物质积累的有效方法。例如李晓敏等通过敲除编码精氨酸酶的CAR1基因获得一株酿酒酵母菌株，将其应用于黄酒发酵体系中的尿素和EC的含量分别降低了86.9%和50.5%[25]。此外，将组成型表达尿素水解酶的代谢工程菌应用于黄酒发酵体系，分别使黄酒中EC的含量降低了49.1%和55.3%[26]。酱油发酵是混菌发酵的复杂体系，目前采取的降低酱油中EC的方法是酶法和优化工艺的方法。Kim等添加脲酶至豆瓣酱中，可使添加了瓜氨酸、乙醇和尿素的酱中EC含量分别降低了38.5%、17.3%和18.8%[27]。但是酱油中EC的前体主要是瓜氨酸，因此去除尿素并不是减少EC的有效措施。通过精炼使原料中精氨酸的含量大幅降低，减少瓜氨酸的积累，从而达到降低EC的目的[7, 28]。但是精炼后原料的营养成分损失严重，影响产品的风味和营养价值。
2.5 解淀粉芽孢杆菌JY06突变株对酱油理化性质的影响 前期研究结果表明，在酱油发酵前期添加解淀粉芽孢杆菌JY06可使酱油原油中醇的浓度少量降低，而酸和酯的含量增加，酱油的香味和口感也有所提高[13]。将突变株C12和E6用于酱油发酵可显著减少酱油中EC及其前体，但是添加解淀粉芽孢杆菌突变株是否会影响酱油的品质，还需进行分析和比较。分别以不添加菌株和添加菌株JY06进行发酵的酱油原油为对照，考察了添加突变株C12和E6对酱油主要理化指标的影响(图 4)。结果表明，与未添加菌株的对照相比，添加突变株C12和E6进行发酵的酱油原油总酸略有增加，氨基酸态氮和还原糖含量无显著差异；与添加菌株JY06的样品相比，添加突变株C12和E6的样品pH值、总酸、氨基酸态氮和还原糖浓度均无明显差异。上述结果说明，在酱油发酵过程添加解淀粉芽孢杆菌突变株C12和E6对酱油主要理化性质无明显影响。
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| 图 4 添加解淀粉芽孢杆菌对酱油理化性质的影响 Figure 4 Effect of addition of B. amyloliquefaciens JY06 and its mutants on the physical and chemical properties of soy sauce. |
| 图选项 |
3 结论 本研究通过等离子诱变和紫外诱变的方法对一株可减少酱油中氨基甲酸乙酯和其前体瓜氨酸的菌株解淀粉芽孢杆菌JY06进行了育种，获得了2株(C12和E6)精氨酸利用能力提高的突变株。将C12和E6用于酱油发酵(2 L发酵体系)，进一步降低了酱油中氨基甲酸乙酯和其前体的含量，使氨基甲酸乙酯含量降低至12 μg/kg以下。本研究结果可为减少酱油中氨基甲酸乙酯及其前体瓜氨酸的积累提供参考，对于寻找控制或减少混菌发酵体系中生物危害物的有效措施具有重要意义。
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