医学院布莱恩·科比尔卡教授研究组合作在《科学》发文阐述beta2肾上腺素受体胞内别构激动剂的调控机理
清华新闻网7月1日电 6月28日，清华大学医学院、结构生物学高精尖创新中心布莱恩·科比尔卡（Brian Kobilka）教授研究组合作在《科学》（Science）期刊在线发表题为《胞内别构激动剂调控beta2肾上腺素受体的机理》（Mechanism of β2AR regulation by an intracellular positive allosteric modulator）的文章，首次报道了激活态的beta2肾上腺素受体（β2AR）同时结合正构激动剂BI167107和别构激动剂Cmpd-6FA的晶体结构。这项工作鉴定了一个新的G蛋白偶联受体（GPCR）别构调节位点，并发现了新的别构调节机制，为针对GPCR的别构药物研发提供了指导。
G蛋白偶联受体（GPCR）家族在人体中有800多个成员，在视觉，嗅觉，味觉，以及激素和神经递质的信号转导中发挥着重要的生理功能，同时也是关键的药物研发靶点。目前绝大多数的GPCR药物靶向其正构位点，即天然底物结合的位点。正构位点在不同亚型的GPCR之间保守性较高，以致正构药物常存在亚型选择性较差的问题。别构调节物指的是不结合在GPCR正构底物结合位点的小分子化合物。其结合位置通常保守性较低，因此有可能具有更好的选择性。近年来，不少GPCR结合别构调节物的结构被报道出来，但是这些结构多数报道的是别构拮抗剂，它们将GPCR稳定在非激活状态。在本工作发表之前，仅有一个激活态GPCR结合小分子别构激动剂的结构被发表，即布莱恩·科比尔卡在斯坦福大学研究组于2013年发表的激活态M2乙酰胆碱受体结合别构激动剂LY2119620的结构(Kruse et al., 2013)。
Beta2肾上腺素受体属于 GPCR家族，在心肺系统中起重要调节作用。Beta2肾上腺素受体的配体，如beta阻滞剂（beta-blocker）和beta激动剂（beta-agonist），是常用的治疗心血管和呼吸道疾病的临床药物。在2017年，布莱恩·科比尔卡教授在清华大学医学院的研究组和杜克大学罗伯特·莱夫科维茨（Robert Lefkowitz）教授研究组合作在《自然》发文报道了Beta2肾上腺素受体结合首个胞内别构拮抗剂Cmpd-15的结构(Liu et al., 2017)。近期罗伯特·莱夫科维茨教授研究组通过DNA编码的小分子库筛选发现另一个小分子化合物Cmpd-6对beta2肾上腺素受体具有别构激动剂的活性(Ahn et al., 2018)。其能提高beta2肾上腺素受体对正构激动剂的亲和力，并且能与下游信号传导蛋白如G蛋白和arrestin协同作用，介导下游信号的传导。
布莱恩·科比尔卡教授研究组和罗伯特·莱夫科维茨教授研究组合作，尝试利用蛋白质晶体学的手段获得激活态β2AR与Cmpd-6的复合物结构。然而初期的多次尝试都无法检测到Cmpd-6的电子密度。研究人员分析认为这是由于Cmpd-6溶解度较低，且亲和力较弱（uM级别），导致在晶体里面Cmpd-6的占有率较低，无法检测到电子密度。为了解决这个问题，罗伯特·莱夫科维茨教授研究组在Cmpd-6上引入乙酸基团获得溶解度更高的衍生物Cmpd-6FA。布莱恩·科比尔卡研究组发现在较高沉淀剂PEG400浓度下Cmpd-6FA溶解度比较高，并经过一系列的晶体筛选和优化，成功在高PEG400浓度的条件下获得了激活态β2AR的晶体。最终在一个添加了3 mM Cmpd-6FA的结晶条件下收到了3.2埃的晶体数据，并且观测到了属于Cmpd-6FA的电子密度。Cmpd-6FA结合在跨膜螺旋2、3、4和第二胞内环（ICL2）形成的结合口袋里（图1）。
图1：Cmpd-6FA的分子式及对β2AR的别构激活剂活性，以及激活态β2AR结合纳米抗体NB6B9，正构激动剂BI167107和别构激动剂Cmpd-6FA的结构。
有趣的是，β2AR的第二胞内环在非激活态下是无规卷曲的结构，在激活态下是alpha螺旋结构。而Cmpd-6FA的结合稳定了其alpha螺旋结构。一方面，这有助于β2AR与下游Gs蛋白的结合。另一方面，为了形成第二胞内环的螺旋结构，β2AR的跨膜螺旋3（TM3）需要向内移动大约3埃，螺旋3的内移引起跨膜螺旋5和6（TM5和TM6）的外移，而后者是GPCR激活态的标志性构象。因此，尽管Cmpd-6FA结合在胞内的位置，它促使β2AR更倾向于处在激活状态，进而影响结合在β2AR胞外口袋的正构激动剂的亲和力（图2）。这一机理不同于之前报道的LY2119620影响M2乙酰胆碱受体的机理。LY2119620结合在M2乙酰胆碱受体的胞外口袋直接阻止正构激动剂的解离。
图2：别构激动剂Cmpd-6FA调节β2AR的分子机理。（A） Cmpd-6FA的结合有助于β2AR与Gs蛋白形成复合物。（B）Cmpd-6FA的结合引起TM3的内移，进而引起TM5和TM6的外移，从而使受体更倾向于处在激活状态。
研究人员设计了一系列的Cmpd-6的衍生物，并测试了其活性。其结果与结构模型相互支持。Cmpd-6对于β2AR具有亚型选择性，它能显著提高β2AR对于正构激动剂的亲和力，而对同一家族的β1AR影响很小。分析表明在参与结合Cmpd-6的14个氨基酸中，只有7个在β2AR和β1AR之间是一样的。当把β1AR结合位点上的氨基酸突变成和β2AR一样时，Cmpd-6对β1AR也有较强的别构激动剂活性。这一突变实验进一步验证了结构模型。
Cmpd-6的别构位置可能普遍存在于其他GPCR中。该位置和别构激动剂AP8结合游离脂肪酸受体GPR40的位置有部分重合(Lu et al., 2017)。另外近期有研究组利用突变实验鉴定出多巴胺受体D1R的别构激动剂DETQ可能结合在其第二胞内环(Wang et al., 2018)。本工作鉴定出来的Cmpd-6结合模型可能用于指导其他GPCR的别构激动剂的设计。
本论文是清华大学医学院、结构生物学高精尖创新中心、斯坦福大学医学院分子与细胞生理学系布莱恩·科比尔卡教授与杜克大学罗伯特·莱夫科维茨教授共同合作的成果。布莱恩·科比尔卡教授与罗伯特·莱夫科维茨教授为本文的共同通讯作者。清华大学医学院刘翔宇博士与杜克大学Ali Masoudi博士和Alem W. Kahsai博士为本文的共同第一作者。本课题得到北京市结构生物学高精尖创新中心和生命科学联合中心的资助。衍射数据收集得到日本Spring-8同步辐射光源的支持和协助。
论文链接：
https://science.sciencemag.org/content/364/6447/1283
供稿：医学院
编辑：李华山
审核：周襄楠
2019年07月01日 11:42:57 清华新闻网
