李海燕, 吴丽华
太原师范学院生物系, 晋中 030619
收稿日期: 2021-01-29; 修回日期: 2021-03-11; 录用日期: 2021-03-11
基金项目: 国家自然科学基金（No.21307087）；山西省应用基础研究计划项目（No.201601D021104）；山西省高校科技创新项目（No.2019L0820）；太原师范学院大学生创新项目（No.CXCY2160）
作者简介: 李海燕(1996-), 女, E-mail: lihaiyan1201@163.com
通讯作者（责任作者）: 吴丽华(1981—), 女, 博士, 教授, 主要从事环境毒理学方面的研究.主持国家级和省部级研究课题共3项, 发表研究论文近20篇, 出版学术著作1部. E-mail: wlh1981622_510@163.com

摘要：以模式生物酿酒酵母为研究对象，采用醋酸铅试纸条法、BIGGY琼脂及qRT-PCR技术检测了不同浓度亚砷酸钠胁迫下H₂S产量及产H₂S酶编码基因表达的变化，以探讨砷化物对酵母细胞H₂S代谢的影响.结果显示，0.5~2 mmol·L^-1的亚砷酸钠可诱导酵母细胞内源H₂S的产生，且H₂S合成相关基因的相对表达量与对照相比均有不同程度的上调.经0.05~0.2 mmol·L^-1的外源H₂S预处理后，酵母细胞对砷的耐受性明显提高.研究表明，亚砷酸钠可影响酵母细胞H₂S代谢，而H₂S含量可在一定程度上调控砷对酵母的毒性.
关键词：硫化氢酿酒酵母亚砷酸钠硫氢化钠
Effect of sodium arsenite on H₂S metabolism in yeast cells
LI Haiyan, WU Lihua
Department of Biology, Taiyuan Normal University, Jinzhong 030619
Received 29 January 2021; received in revised from 11 March 2021; accepted 11 March 2021
Abstract: The model organism, Saccharomyces cerevisiae, was used to investigate the effects of arsenite on H₂S metabolism in yeast cells. Changes in H₂S production, and the expression of genes encoding H₂S-producing enzymes under the stress of different concentrations of sodium atsenite were detected using the lead acetate test strip method, bismuth sulfite glucose glycine yeast (BIGGY) agar, and qRT-PCR. The experiment results showed that sodium arsenite at 0.5~2 mmol·L^-1 induced endogenous H₂S production in yeast cells, and the relative expression levels of H₂S synthesis-related genes were all upregulated to different levels compared to the control. The tolerance of yeast cells to arsenic was significantly increased after pretreatment with 0.05~0.2 mmol·L^-1 of exogenous H₂S. The results suggest that sodium arsenite can affect yeast cell H₂S metabolism, and H₂S can regulate the toxicity of arsenic to yeast to some extent.
Keywords: hydrogen sulfide (H₂S)Saccharomyces cerevisiaesodium arsenitesodium hydrosulfide (NaHS)
1 引言(Introduction)硫化氢(Hydrogen sulfide, H₂S)是继一氧化碳(CO)和一氧化氮(NO)之后的第3种气体信号分子, 在植物、动物和微生物体内均具有一定的生理功能(Wang, 2002).已有研究证明, 在哺乳动物中, H₂S可舒张血管、降压, 并具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等功能(Abe et al., 1996)；当H₂S代谢异常时, 可增加高血压、糖尿病、肝脏疾病等多种疾病发生的风险, 甚至引发癌症(徐文静, 2020；Zheng et al., 2021).在植物中, H₂S参与了植物生长、发育、成熟和衰老整个生理过程(Jin et al., 2015；裴雁曦, 2016), 同时还可提高植物对环境胁迫的耐受性(Jin et al., 2015；Zhou et al., 2018；贾红磊等, 2020).在微生物中, Shen等(2012)发现表达拟南芥合成H₂S酶编码基因的大肠杆菌, 对镉毒性的耐受性明显提高.
砷是一种存在于自然界且具有毒性的环境污染物, 可抑制植物幼苗根和茎的生长, 并改变植物学形态(de Freitas-Silva et al., 2016；Shamim et al., 2017)；同时会导致肾、肺、肝脏等动物组织器官的损伤(Hu et al., 2018; Zhao et al., 2019；李秀娟等, 2019；Sosa et al., 2020).本课题组前期研究发现, 气体信号分子NO参与调控亚砷酸钠引起的细胞死亡(吴丽华等, 2012), 但H₂S是否影响酵母细胞对砷的耐受性尚不清楚.因此, 本实验以模式生物酿酒酵母为研究材料, 分析亚砷酸钠对酵母细胞H₂S代谢的影响, 以探讨H₂S在酵母细胞应对砷胁迫中的作用, 以期为解释砷毒性机理及砷中毒防治方面提供理论依据.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 实验材料供试菌株酿酒酵母(BY4741), 保存于本实验室.
2.2 酵母细胞培养取酵母单菌落于YPD液体培养基后, 28 ℃、180 r·min^-1条件下恒温培养至对数生长期, 然后进行砷胁迫处理.
2.3 亚砷酸钠对H₂S产量的影响2.3.1 醋酸铅试纸法将一定量对数期细胞接种于含0~2 mmol·L^-1亚砷酸钠的YPD液体培养基中, 使各处理组培养液初始OD₆₀₀相等且小于0.1, 同时在瓶口处放置醋酸铅纸条, 用橡胶塞塞住, 28 ℃、180 r·min^-1条件下恒温振荡培养12或24 h后, 取下试纸条, 量取试纸条上黑色部分的长度, 同时测定培养液OD₆₀₀.将试纸条上硫化铅黑色部分长度(cm)与培养液OD₆₀₀的比值记为H₂S相对含量(高雪洁等, 2018), 处理组OD₆₀₀与对照组OD₆₀₀的比值记为相对生长率.
2.3.2 BIGGY法参照马捷等(2013)的方法, 将对数期细胞(OD₆₀₀约为1.8左右)用无菌水洗涤后, 各取5 μL点样至含不同浓度(0、0.5、1、1.5和2 mmol·L^-1)亚砷酸钠的BIGGY培养基上, 28 ℃恒温培养48 h后, 观察记录, 并根据菌斑的颜色来判断H₂S产量变化.
2.4 外源H₂S对细胞相对存活率和砷耐受性的影响2.4.1 细胞相对存活率检测将一定量对数期细胞用无菌水稀释到相同浓度后涂布至含不同浓度(0、1、1.5、2、2.5和5 mmol·L^-1)NaHS的YPD固体培养基上, 使每个平板上含细胞数约300个左右, 28 ℃恒温倒置培养48 h后计数, 处理组菌落数除以对照组菌落数即为细胞相对存活率.
2.4.2 砷耐受性检测将相同数量的对数期细胞经不同浓度(0、0.05、0.1、0.15和0.2 mmol·L^-1)NaHS预处理6 h后, 10倍梯度稀释, 并按一定顺序点样到含有0或1 mmol·L^-1亚砷酸钠的YPD固体培养基中, 常规方法培养后观察, 拍照记录.
2.5 qRT-PCR检测参照本实验室已建立的方法(吴丽华等, 2019)提取RNA, 反转录并qRT-PCR, 然后计算基因的相对表达量.其中, ACT 1为本实验所选用的内参基因, 引物序列见表 1.
表 1(Table 1)

表 1 qRT-PCR引物 Table 1 Primers for qRT-PCR

表 1 qRT-PCR引物 Table 1 Primers for qRT-PCR 基因 正向引物 反向引物 ACT1 TACTCTTTCTCCACCACTGCTGA CTTGACCATCTGGAAGTTCGTAG MET3 CGTAAGACACCTGCCCAACT GGCTCTCACAGTCAACTCCC MET5 GCGCTGCTGTTGATGATGAG GCGTGAGTAACACCACCTGA MET10 TACGACAATGCTACCGGCTC AGGCGACACTTTGTACCTCG MET14 AGAAGTCGCTGAGCAAAGGG TTCAACCGTCTTCTGGTCGG MET16 AATTGGACGTTCGAGCAGGT CCTTCCTTGACGGGTTGTGT

2.6 数据统计分析采用SPSS 16.0软件对实验结果进行Duncan检验, 分析所测指标在处理组与对照组间的差异显著性(^*p < 0.05, ^{* *}p < 0.01), 然后用Graphpad Prism 7软件作图.
3 结果(Results)3.1 酿酒酵母在不同生长时间段H₂S产量变化H₂S可与醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀, 因此, 试纸条颜色可间接反映酵母细胞H₂S的产量.由图 1可知, 不同生长阶段的酵母, 产生H₂S的量有所不同.在培养前10 h中, H₂S产量很低, 在试纸条上几乎看不到沉淀颜色；培养10~14 h后, 试纸条下端可看到较深的颜色, 说明H₂S释放量明显增多(图 1a)；在12~24 h之间, H₂S累积量明显多于前12 h(图 1b), 但在胁迫12 h和24 h均可以明显看到H₂S的累积.因此, 在后续实验中选择12 h和24 h作为本实验的胁迫时间.
图 1(Fig. 1)

图 1 酿酒酵母在不同生长时间段H2S产量变化 Fig. 1Changes in H2S production of S. cerevisiae during different growth periods

3.2 亚砷酸钠对酵母细胞H₂S产量的影响醋酸铅试纸条法和BIGGY法检测结果显示, 酵母细胞H₂S产量随砷浓度升高呈现先升后降的趋势, 当亚砷酸钠浓度为1 mmol·L^-1时, H₂S产量最高(图 2a、2b和2e).在2 mmol·L^-1处理组中, 试纸条上黑色部分长度短于对照组, 且BIGGY平板中几乎完全看不到H₂S的累积(图 2c和2e), 但H₂S相对含量却显著高于对照组(图 2d).这可能是因为高浓度砷虽然可增加相同数量细胞中H₂S产生的量, 但由于细胞数量相对较少, 从而导致H₂S相对总含量减少.
图 2(Fig. 2)

图 2 亚砷酸钠对酵母细胞H2S产量的影响(a.醋酸铅试纸法(12 h), b.醋酸铅试纸法(24 h)；c.细胞生长情况；d.H2S相对含量；e.BIGGY法) Fig. 2Effect of sodium arsenite on H2S production in yeast cells

3.3 亚砷酸钠对酵母细胞产H₂S相关基因表达的影响由图 3可知, 酵母细胞经0.5 mmol·L^-1亚砷酸钠处理12 h后, 产H₂S相关基因的相对表达量均与对照组间无显著差异；2 mmol·L^-1处理组中, 产H₂S相关基因的相对表达量均显著高于对照组.其中, MET5基因相对表达量在酵母细胞经亚砷酸钠胁迫12 h后呈先升后降的趋势, 在1.5 mmol·L^-1处理组中相对表达量达到最高；胁迫24 h后, 其相对表达量随砷浓度的升高逐渐上升, 此结果与H₂S相对含量结果一致(图 2d).结果表明, 亚砷酸钠可影响产H₂S酶编码基因表达, 进而调节H₂S产量.
图 3(Fig. 3)

图 3 亚砷酸钠对酵母细胞产H2S相关基因表达的影响(a. MET3; b. MET5; c. MET10; d. MET14; e. MET16) Fig. 3Effects of sodium arsenite on the relative gene expression of biosynthesis H2S related genes in yeast cells

3.4 外源H₂S对酵母细胞砷耐受性的影响由图 4可知, NaHS可影响酵母细胞的活性.酵母细胞经NaHS胁迫后, 细胞相对存活率随着NaHS浓度的升高而逐渐降低；在高浓度处理组(1.5~5.0 mmol·L^-1)中, 细胞相对存活率显著低于对照组(图 4a).酵母细胞经低浓度(0.05~0.2 mmol·L^-1)NaHS预处理后, 细胞在含有1 mmol·L^-1亚砷酸钠的平板中生长情况均明显优于砷单独处理组(未经NaHS预处理)；经0.05 mmol·L^-1NaHS预处理后, 在稀释倍数为10⁵处, 仍长出一定数量的菌落, 而砷单独处理组中几乎看不到菌落(图 4b).结果说明, 高浓度NaHS可诱导细胞死亡, 低浓度NaHS可提高酵母细胞对砷的耐受性, 即H₂S作为信号分子可在一定程度上调控酵母细胞的存活.
图 4(Fig. 4)

图 4 外源H2S对酵母细胞相对存活率(a)和砷耐受性(b)的影响 Fig. 4Effects of exogenous H2S on relative survival rate(a) and arsenic tolerance(b) in yeast cells

4 讨论(Discussion)H₂S作为一种内源性小分子, 其在生物体内的含量受各种外界胁迫的影响.已有大量研究证明, Cd胁迫可激活植物内源H₂S的产生, 并上调H₂S酶编码基因的表达(Cui et al., 2014；Shi et al., 2014；Zhang et al., 2015).吴帼秀等(2020)在黄瓜幼苗中发现, 低温胁迫亦可诱导植物体内H₂S的迅速产生.本实验中, 亚砷酸钠可激活酵母细胞内源H₂S的产生, H₂S相对含量随着砷浓度的升高而逐渐升高.醋酸铅试纸条法和BIGGY法检测结果显示, 内源H₂S含量随着砷胁迫浓度的升高呈现先升后降的趋势, 这可能是因为高浓度亚砷酸钠可完全抑制酵母细胞的生长, 使细胞总量减少, 导致H₂S总释放量减少.本实验中采用的酿酒酵母为本课题组长期使用的一种实验材料, 具有生长周期短、培养条件简单、遗传背景清楚等优点, 且前期研究结果与多数****在植物和动物研究中的结果一致(Wu et al., 2013; Wu et al., 2016; 吴丽华等, 2019).因此, 本实验结果可为探讨亚砷酸钠对高等生物硫代谢的影响提供实验依据.
在酵母细胞中, H₂S的产生与含硫氨基酸的代谢和有机含硫化合物的合成有关, 是硫酸盐代谢过程中的产物之一(Beinrt et al., 1997).硫酸盐进入细胞后, 可依次在ATP硫酸化酶(MET3)、5-磷酸硫酸腺苷激酶(MET14)、3-磷酸腺苷硫酸盐还原酶(MET16)和亚硫酸还原酶(MET5和MET10)的作用下生成H₂S(Marzluf, 1994).因此, 这些基因表达的高低会在一定程度上影响酵母内源H₂S的生成.本研究发现, 亚砷酸钠可上调产H₂S酶编码基因MET3、MET10、MET14及MET16的表达, 且随着砷浓度的升高而逐渐上调.MET5基因的表达量在胁迫24 h后也呈现相同趋势, 而在胁迫12 h后, 呈先升高后降低的趋势, 其表达变化趋势与H₂S相对含量具有一致性, 说明MET5在砷胁迫下调控内源H₂S产生的过程中起重要作用.
砷作为一种毒性较强的重金属, 可通过添加外源H₂S(NaHS)缓解其对豌豆幼苗的毒性(Singh et al., 2015).潘际刚等(2020)在SH-SY5Y细胞中也证明了NaHS对砷毒性具有同样的干预效果.陈志刚(2018)用MET5突变株研究时发现, H₂S的释放量在一定程度上会影响酵母对金属铜和锌的耐受性.本研究结果显示, 高浓度NaHS可诱导酵母细胞死亡, 而0.05~0.2 mmol·L^-1的NaHS可以缓解重金属对酵母细胞的毒性作用.以上结果说明, 亚砷酸钠可以通过改变H₂S酶编码基因的表达而影响酵母细胞H₂S产生的量, 而H₂S含量在一定程度上可干预亚砷酸钠对酵母细胞的毒性.
5 结论(Conclusions)亚砷酸钠可激活酵母细胞内源H₂S的产生, 诱导产H₂S酶编码基因的表达上调.低浓度NaHS可提高酵母细胞对砷的耐受性, 而高浓度NaHS可诱导酵母细胞死亡, 推测H₂S参与调控酿酒酵母对砷化物的耐受性.该研究可为砷毒性的干预及NaHS的安全使用提供实验依据.

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