, 王倩1,2, 李贶家3, 辛蕊4, 赵珍珍1,2, 何思雨1,2, 许智恒1,2, 崔向超1,2, 魏巍1,21. 信阳师范学院地理科学学院, 信阳 464000;
2. 信阳师范学院, 河南省水土污染协同防治重点实验室, 信阳 464000;
3. 水利部发展研究中心, 北京 100038;
4. 天津大学海洋科学与技术学院, 天津 300350
收稿日期: 2021-03-08; 修回日期: 2021-04-15; 录用日期: 2021-04-15
基金项目: 国家自然科学基金（No.42007209，41807038）；信阳师范学院‘南湖****奖励计划’青年项目
作者简介: 张凯(1987-), 男, 讲师(博士), E-mail: kaizhang1014@163.com
摘要：环境中重金属抗性基因（Metal resistance genes，MRGs）的迁移转化作为环境及生态领域的重要研究内容近年来备受关注，但目前环境中重金属是否是MRGs的重要驱动因素则尚不明确.本研究采用宏基因组技术对华中地区水库沉积物MRGs进行了定量，并分析了不同形态重金属在MRGs迁移转化过程中起到的作用.结果表明，trcop（抗Cu基因）及arsM（抗砷基因）是水库环境中的主要MRGs，供水水库之间MRGs分布并无地域性差异.czrA（多抗基因）的潜在宿主菌较为广泛，trcop及arsM很可能位于同一种可移动遗传元件上进行水平转移.重金属总量与MRGs之间并无明显联系，而可交换态及碳酸盐结合态（B1）则是环境中MRGs的重要驱动因素.
关键词：水库环境重金属抗性基因赋存特征重金属形态华中地区
Distribution pattern and influencing factors of heavy metal resistance genes in reservoir sediment of central China
ZHANG Kai1,2
, WANG Qian1,2, LI Kuangjia3, XIN Rui4, ZHAO Zhenzhen1,2, HE Siyu1,2, XU Zhiheng1,2, CUI Xiangchao1,2, WEI Wei1,21. School of Geographic Sciences, Xinyang Normal University, Xinyang 464000;
2. Henan Key Laboratory for Synergistic Prevention of Water and Soil Environmental Pollution, Xinyang Normal University, Xinyang 464000;
3. Development Research Center, Ministry of Water Resources of People's Republic of China, Beijing 100038;
4. School of Marine Science and Technology, Tianjin University, Tianjin 300350
Received 8 March 2021; received in revised from 15 April 2021; accepted 15 April 2021
Abstract: The migration and transformation of heavy metal resistance genes (MRGs) in the environment has attracted much attention in recent years. However, it is not clear whether heavy metals in the environment are important drivers of MRGs in the environment. In this study, metagenomic technique was adopted to determine MRGs abundance in the water supply reservoirs of Central China. Moreover, the role of heavy metal fractions in MRGs dissemination was analyzed. The results indicated that trcop (conferring Cu resistance) and arsM (conferring As resistance) were the main MRGS in the reservoir environment, and there wasno regional difference in the MRGs distribution in the reservoirs. There were a wide range of potential host bacteria of czrA (conferring resistance to multiply heavy metals). trcop and arsM were likely to transfer horizontally on the same mobile genetic element. There was no obvious relationship between the total heavy metal total contents and MRGs, while exchangeable and carbonate bound fraction of heavy metals (B1 fraction) were the important driving factors of MRGs in the environment.
Keywords: reservoirsmetal resistance genesdistribution patternheavy metal fractionscentral China
1 引言(Introduction)重金属抗性基因(MRGs)存在于微生物体内, 其主要靠外排泵机制、酶转运机制及细菌体内重金属的螯合作用帮助细菌抵御重金属的危害, 其在环境中的迁移转化是近年来环境及生态领域的重要研究内容(Barman et al., 2020).如Jie等(2016)研究发现, 在受重金属污染比较严重的河流沉积物中, MRGs广泛存在.师碧玲等(2019)发现铜尾矿库区土壤中, 相对丰度较高的MRGs能够对Cu、As表达抗性的基因.Salam(2020)采用宏基因组调查了长期受污染土壤中MRGs的赋存状况, 发现了对铜、锌、镉、镍、铬、钴、汞、砷、铁等元素表达出抗性的多种MRGs.Yang等(2019b)研究表明, 海洋微塑料中MRGs的丰度远高于海水中MRGs的丰度.
水库作为水环境的重要组成部分, 在我国水资源调配中发挥着重要作用.其中, 供水水库是我国重要的饮用水来源, 其水质状况直接关系到人类的生命健康与生产活动, 对生态环境的演变和社会的发展有着极为重要的作用(Bai et al., 2019; Dang et al., 2020).不同于河海等环境介质, 湖库环境中污染物迁移扩散相对较慢, 因此更容易蓄积.湖库环境中污染物的赋存特征及影响因素是环境领域的持续热点.近年来, 有研究开始逐渐注意到湖泊环境中MRGs的赋存特征, 如Song等(2019)确定了中国博斯腾湖和艾比湖中MRGs的赋存特征, 并发现细菌群落结构是其重要驱动因素.但湖库环境中MRGs的赋存特征及影响因素研究总体上仍处于起步阶段.
在诸多研究中, 能够对MRGs的产生提供直接选择性压力的重金属是最引人关注的研究对象.重金属广泛存在于环境中, 自然演变和人类活动均能对其分布造成影响.研究表明, 重金属对微生物的生理生化活动均能产生明显影响.例如, Ding等(2021)发现铁能够影响厌氧氨氧化细菌活性和丰度；Rajeev等(2021)发现重金属污染严重的地区γ-变形杆菌、β-变形杆菌和放线杆菌的细菌种类比例较高；Ji等(2020)发现在土壤中添加重金属后, 土壤微生物活性和微生物生物量碳(MBC)的形成受到抑制, 其中, 添加As的土壤中细菌和真菌生物量下降尤为明显.但目前为止, 探索重金属与MRGs之间关系的研究得到的结果往往差异较大, 重金属与MRGs之间的联系目前尚无明确定论(Chen et al., 2019; Song et al., 2019; Thomas et al., 2020).BCR连续提取法将重金属分为4种形态, 其中, 可交换态及碳酸盐结合态(B1态)为易被生物利用的形态, 而残渣态(B4态)则不能被生物利用(王莉等, 2020).基于此, 本课题组认为应将研究点聚焦在B1态重金属与MRGs之间的联系上, 以明确B1态重金属与MRGs之间的关系.
华中地区位于中国的中部地区, 由河南、湖北、湖南三省组成, 人口众多, 以农业生产发展为主, 居民用水及农业生产用水主要来源于水库的水体.该地区含有多个大型水库, 水库的水资源对三省的经济与社会发展有着极为重要的影响.因此, 本研究选取华中地区10个大型供水水库, 采用宏基因组的方法确定沉积物中MRGs的丰度水平及细菌群落结构特征, 以明确水库沉积物中重金属的污染水平和微生物菌群结构的特征, 确定水库沉积物中MRGs的分布规律, 明确水库环境中B1态重金属对MRGs的影响.
2 采样和分析(Samples and analysis)2.1 样品采集本研究所设采样点如图 1所示.样品采集于2019年10—11月, 在华中地区的水库中选取10个大型水库作为采样点, 在每个采样点选择一个10000 m2的方形区域, 在该区域的4个顶点和中间分别取10 g的表层沉积物, 混合均匀后保存在无菌密封袋中, 放置于带有冰块的保温箱中立即带回实验室.将充分混匀的沉积物样品分成2份, 一份于-86 ℃条件下冷干、过100目筛后存于封口袋中用于重金属分析, 另一份保存于-40 ℃超低温冰箱中用于宏基因组分析.
图 1(Fig. 1)
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| 图 1 华中地区水库采样点示意图 Fig. 1Sampling points of reservoirs in central China |
2.2 重金属分析采用BCR形态分析法对7种重金属(As、Cr、Cu、Mn、Ni、Pb、Zn)进行形态分析.BCR法将沉积物重金属赋存形态分为4类, 分别为可交换态及碳酸盐结合态(B1)、铁锰氧化物结合态(B2)、有机物及硫化物结合态(B3)及残渣态(B4).重金属所有形态均用ICP-MS(Agilent 8900, 美国)进行测定, 重金属的回收率为80%~115%.
2.3 DNA提取和测序采用CTAB/SDS方法进行水库沉积物样品中DNA的提取(Wang et al., 2018).DNA纯度通过凝胶电泳(DYCP-32C, 六一, 中国)和分光光度法(Nanodrop 2000, ThermoFisher, 美国)进行验证.DNA浓度用Qubit(Qubit 2.0, ThermoFisher, 美国)及Qubit dsDNA HS Assay Kit(ThermoFisher, 美国)确定.宏基因组测序工作由深圳微生态公司完成, 采用Illumina Novaseq平台对测序样本进行双端测序.下级数据raw Data经质控及过滤掉宿主DNA和不合格序列后, 用于后续组装分析.
采用Kraken2对所有样品的全部有效序列进行注释分类.采用Bracken对Kraken2得到的结果进行分类后, 重新估算丰度来估算宏基因组样本的物种水平或属水平丰度.MRGs通过用Blastx (http://bacmet.biomedicine.gu.se)对比BacMet数据库进行注释(e-value≤1×10-5).设置参数为匹配度≥85%且氨基酸长度≥30(Zhang et al., 2020).
2.4 数据分析本研究的所有基础数据均由Excel 2019进行分析, Spearman相关性分析及Mantel test分析分别由R 3.4.3的psych包及vegan包进行.
3 结果和讨论(Results and discussion)3.1 华中地区供水水库MRGs的分布特征华中地区供水水库MRGs的分布特征如图 2所示.本研究共注释出33种MRGs, 总体检出率为37.2%, 其中, 有9种基因仅能在1个水库中检出, 有7种基因仅能在2个水库中检出, 有8种基因的检出率≥50%, 检出率为100%的基因仅有1种.上述结果表明, 华中地区供水水库沉积物中MRGs的分布并不普遍.该结果与以往针对湖泊环境中MRGs的研究类似, 表明湖库环境中MRGs并不常见(Song et al., 2019).在所有检出的重金属中, 有9种对多种重金属能表达出抗性.其余能够对单个重金属表达出抗性的基因数量为：Cu(5)=Hg(5)>Cr(4)>As(3)>Fe(2)>Ag(1)=Ni(1)=Pb(1).
图 2(Fig. 2)
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| 图 2 供水水库MRGs的分布热图 (HB: 湖北，Hu: 湖南，HN: 河南) Fig. 2The distribution pattern of MRGs in water supply reservoirs of central China |
华中地区供水水库MRGs的丰度为12.07~27.15 ppm(ppm用于表示MRGs的相对丰度，1 ppm表示100万短序列中有1个目的基因的短序列(Zhang et al., 2020)), 其中最高值出现在HB3处, 最低值出现在Hu2处, 但各省水库之间的MRGs含量并无显著性差异(t-test, p>0.05).此外, 聚类分析结果显示(图 2), 同一省份的水库中只有Hu1和Hu4距离最近, 其余距离最近的水库均为非同省的水库.上述结果表明, 华中地区供水水库MRGs的丰度不具备地域性差异.
聚类分析结果表明, MRGs总体上可以分为2组.组1包括trcop及arsM, 其中, trcop的检出率(100%)和丰度(1.83~8.13 ppm, 平均丰度为5.11 ppm)均为最高；平均丰度为第2高的arsM的丰度水平(1.96 ppm)及检出率(80%)则仅次于trcop.因此, 组1中的MRGs为水库环境的主导基因.trcop能够对Cu表达出抗性, Yang等(2019a)发现湖泊环境中Cu的抗性基因广泛存在.在所有MRGs中, 对Cu能够表达出抗性的常见MRGs有20余种, 在所有类别MRGs中数量最多.因此, 湖库环境中, 针对Cu有抗性的MRGs可能是最为常见的MRGs(Argudín et al., 2019).arsM能够对As表达出抗性, 且广泛存在于沉积物环境中(Guo et al., 2019).以往研究表明, arsM能够使As(Ⅲ)转化为更具毒性的[M As(Ⅲ)], 因此, 沉积物中arsM的检出需要引起关注(Tang et al., 2019; Xue et al., 2020).
3.2 华中地区供水水库重金属的分布特征华中地区供水水库重金属的形态分布特征如图 3所示.重金属B1态的含量顺序为Mn>Zn>Ni>Pb>Cu>As>Cr, 其中, 锰的B1态的百分比为30.9%~79.4%, 平均值为53.1%, 表明大部分锰为可被生物利用的部分.相对而言, 毒性相对较大的Pb(B1态占比为7.2%)及As(B1态占比为5.0%)只有少部分可被生物直接利用.所有采样点中Cr的B1态占比均为0, 表明水库环境中该元素的危害可忽略不计.重金属B4态的含量顺序为Cr>As>Ni>Zn>Cu>Pb>Mn, 其中, 前5位重金属的残渣态占比均大于50%, 表明这些重金属的大部分不能被生物利用.
图 3(Fig. 3)
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| 图 3 供水水库重金属的形态分布热图 Fig. 3Heavy metal fraction content in water supply reservoirs of central China |
重金属含量波动较大, 如As含量为8.67~41.55 mg·kg-1, Zn含量为55.42~150.05 mg·kg-1.上述结果表明, 水库环境中重金属含量有较大差异.总体而言, 总量位于前5位的重金属分别是Mn、Zn、Cr、Pb及Ni, 其中, Mn的高含量归结于其较高的背景值.与其他环境介质相比, 华中地区重金属含量总体处于较低水平(Yang et al., 2018; Li et al., 2019).该结果与以往研究结果相一致, 表明水库环境中重金属污染相对较轻(Sojka et al., 2019).
3.3 水库环境细菌群落结构的分布特征图 4展示了水库环境中平均丰度位于前30位的细菌丰度.在30种菌属中, 有23种菌属都属于变形菌门(Proteobacteria), 表明水库环境中该门类细菌占主导地位.在所有菌属中, 陶厄氏菌属(Thauera)的平均丰度(10.3%)及检出率(100%)均为最高, 表明该属细菌为华中地区水库沉积物中的优势菌属.陶厄氏菌属属于β-变形菌纲, 该纲的细菌为变形菌门的主要组成部分之一, 对生物脱氮效率影响较大(赵红梅等, 2020).此外, 研究表明, 隶属于该属的多种菌株均有较好的反硝化能力(Semedo et al., 2020; Wang et al., 2020).沉积物环境含有丰富的营养盐, 如总氮、总磷、TOC等, 这些营养盐能够为硝化相关细菌的生长繁殖提供有利条件(Zhang et al., 2021).本研究结果表明, 水库沉积物环境也存在较为常见的硝化反硝化现象.
图 4(Fig. 4)
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| 图 4 供水水库Top30细菌的丰度分布气泡图 Fig. 4The abundance of the top 30 bacteria in water supply reservoirs of central China |
除陶厄氏菌属外, 假单胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)、德昂菌属(Ideonella)及食酸菌属(Acidovorax)平均丰度位于前5位.以往研究表明, 假单胞菌属在各种环境中均为优势菌属(程森等, 2020; 王慎等, 2020; 周栀子等, 2020), 且隶属于该属的菌株也有较强的反硝化作用.本研究表明, 假单胞菌属同样是水库沉积物环境中的优势菌属, 其在水库环境中的检出进一步证实了水库沉积物环境中反硝化作用较为普遍.
3.4 水库环境MRGs与细菌群落结构的共现关系网络共现关系常被用于确定功能基因的潜在宿主菌(Zhao et al., 2020).不同研究在网络共现分析时采用的Spearman相关性系数不尽相同, 但大多数研究基于强相关关系(即r至少大于0.6, p值至少小于0.05)(Stachler et al., 2019; Han et al., 2020; Zhang et al., 2020).本研究采用该方法确定MRGs与细菌群落结构的关系.为尽可能地发掘MRGs的潜在宿主菌, 当菌属和MRGs指标之间的Spearman相关系数大于0.6, 且p值小于0.05时, 即在本研究中被考虑采用参与该分析(Zhang et al., 2021).由图 5可知, 参与网络分析的指标可分为7个模块, 模块内的指标有更为紧密的联系.所有模块中, 最大的模块是Module1, 其含有21个节点；最小的模块是Module7, 其含有4个节点.模块1中最大的节点为MRG基因czrA, 该基因对Zn及Cd均能表达出抗性.由图 5可知, 该基因与多种细菌均有密切联系, 表明该基因具有广泛的潜在宿主菌.与其他功能基因类似, MRGs能够位于质粒等可移动遗传元件(Mobile genetic elements, MGEs)上, 并借助MGEs进行水平传播(Gallo et al., 2019; Kothari et al., 2019).但总体而言, 该基因的潜在宿主菌并非水库环境中的优势菌属(大部分排名在top100之外), 因此, 水库环境中该基因并不是水库环境中的主导基因.水库环境中的主导基因trcop及arsM均属于同一模块(Module2)中, 表明水库环境中这两种基因的紧密联系.位于同一模块的功能基因往往会更可能位于同一种MGEs中, 借助该MGEs同时进行水平转移(Zhang et al., 2020; Zhao et al., 2020).此外, 这两种基因的潜在宿主菌如Opitutus、Methylosarcina及Cupriavidus, 均是水库环境中的优势菌属.上述原因可能是导致水库环境中trcop及arsM广泛存在的重要因素, 上述结论有待更为精确的试验证明.
图 5(Fig. 5)
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| 图 5 MRGs与细菌群落结构的网络共现关系 Fig. 5Network analysis revealing co-occurrence patterns among MRGs and microbial taxa |
3.5 B1态重金属、重金属总量与MRGs的关系Mantel test是基于距离矩阵的分析方法, 能综合反映一组因变量对目的指标的影响, 近年来被广泛应用于环境及生态领域中目标物的影响因素分析(Pu et al., 2020; Yu et al., 2020; Ma et al., 2021).本研究采用Mantel test综合分析B1态重金属、重金属总量与MRGs的相关关系, 结果表明, 重金属总量与MRGs之间无相关性(r=0.014, p=0.452, permutations=9999), 而B1态重金属与MRGs之间呈显著正相关(r=0.395, p=0.023, permutations=9999).上述结果表明, 易被吸收态的重金属能够对MRGs的迁移转化产生影响, 而重金属总量与MRGs没有明显联系.
作为MRGs作用的主要目标, 重金属无疑能够为MRGs产生选择性压力.但重金属总量包含残渣态重金属, 其难以被生物吸收利用(姜时欣等, 2020).本研究结果表明, 水库沉积物中残渣态重金属占一定的比例, 因此, 水库环境中总金属总量难以对MRGs的迁移转化产生影响.与之相反, B1态重金属易于被生物吸收利用, 其在重金属的4种形态中最容易对有机体产生直接影响, 因此, B1态重金属与MRGs联系密切.本研究结果初步表明, B1态重金属可能是影响MRGs迁移转化的重要影响因素, 但该结论仍需在其他环境介质中进行进一步的验证.
4 结论(Conclusions)本研究于2019年10—11月采集了华中地区供水水库沉积物, 分析了重金属对MRGs的影响, 得到的主要结论如下：
1) 水库环境中MRGs的丰度及类别相对较少, trcop及arsM为水库环境中的优势基因.
2) 本研究选取的重金属污染相对较轻, 且大部分重金属为不可被生物利用的形态.
3) czrA的潜在宿主菌较为广泛, trcop及arsM很可能位于同一种可移动遗传元件上进行水平转移.
4) 可交换态及碳酸盐结合态重金属为影响水库环境中MRGs分布的重要因素.
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