, 唐瑞祥1, 吴大冰11. 兰州交通大学环境与市政工程学院, 兰州 730070;
2. 甘肃省黄河水环境重点实验室, 兰州 730070
收稿日期: 2020-11-18; 修回日期: 2020-12-23; 录用日期: 2020-12-23
基金项目: 国家自然科学基金项目（No.51568034）；国家重点研发计划项目（No.2016YFC0400700）
作者简介: 严子春(1970—), 男, E-mail: yanzichun@mail.lzjtu.cn
通讯作者（责任作者）: 严子春, E-mail: yanzichun@mail.lzjtu.cn
摘要：为考察有机物对厌氧氨氧化生物膜反应器脱氮效能的影响，采用MPN（most probable number）法和高通量测序技术，结合处理效果数据，对比分析了有无有机物影响下生物膜中微生物群落差异.试验表明：在进水有机物（COD）为30和60 mg·L-1作用下，总氮去除率与进水COD为0 mg·L-1时的84.10%相比较分别提高了5.08%和10.41%；COD为90 mg·L-1时，总氮去除率降至89.05%.由MPN法和高通量测序结果可知，相对于无有机物，60 mg·L-1有机物使反应器中反硝化菌数量增加，浮霉菌门和变形菌门丰度明显提高，且微生物群落更加丰富.有机物能影响反应器中厌氧氨氧化、反硝化脱氮效能及微生物菌落丰度，适宜的有机物浓度可使厌氧氨氧化与反硝化作用有效耦合，提高反应器的脱氮效能.本研究可为厌氧氨氧化生物膜反应器处理含有机物的实际污水提供参考价值.
关键词：有机物厌氧氨氧化生物反硝化微生物群落
Effect of organic matter on nitrogen removal efficiency and microbial community of an anammox biofilm reactor
YAN Zichun1,2
, TANG Ruixiang1, WU Dabing11. School of Environmental and Municipal Engineering, Lanzhou Jiaotong University, Lanzhou 730070;
2. Key Laboratory of Yellow River Water Environment of Gansu Province, Lanzhou 730070
Received 18 November 2020; received in revised from 23 December 2020; accepted 23 December 2020
Abstract: In order to investigate the influence of organic matter on the nitrogen removal efficiency of an anammox biofilm reactor, MPN (most probable number) method and high-throughput sequencing technique were employed to compare and analyze the microbial community differences in the reactor with or without organic matter. The results showed that, the total nitrogen removal rate increased by 5.08% and 10.41%, respectively, with 30 and 60 mg·L-1 COD in the influent, compared with the 84.10% of total nitrogen removal rate in the influent without organic matter. However, the total nitrogen removal rate decreased 89.05% under 90 mg·L-1 organic matter. Based on MPN and high throughput sequencing results, compared with the condition of organic matter absence, 60 mg·L-1 organic matter significantly increased the population abundance of denitrifying bacteria Planctomyces and Proteobacteria in the reactor. Organic matter could affect the efficiency of anammox and denitrification, and the abundance of microbial colonies in the reactor. The appropriate organic matter concentration could couple denitrification and anammox effectively to improve the nitrogen removal efficiency of the reactor. This study could provide a reference for anammox biofilm reactor to treat wastewater containing organic matter.
Keywords: organic matteranammoxbiological denitrificationmicrobial community
1 引言(Introduction)厌氧氨氧化(Anammox)作为新型高效脱氮技术, 与传统硝化-反硝化脱氮技术相比, 具有无需外加有机碳源、污泥产量少、氮负荷高等优点(Mulder, 2003; Tsushima et al., 2007; Tang et al., 2011), 但脱氮过程中硝氮(NO3--N)的产生会影响脱氮率进一步提高(Ahn et al., 2004; Li et al., 2017).厌氧氨氧化菌利用无机碳源进行自养代谢, 众多研究表明有机碳源对厌氧氨氧化活性污泥反应器的脱氮效能产生影响, 陈重军等采用乙酸钠为碳源, 40 mg·L-1有机物(COD)时, 总氮(TN)去除率88.5%, COD升至60 mg·L-1时, 脱氮效能下降(陈重军等, 2019)；苗蕾等采用厌氧氨氧化序批式反应器(ASBR), 在进水COD低于50 mg·L-1条件下, 厌氧氨氧化菌活性高且脱氮效果稳定, 当COD增至150 mg·L-1, 厌氧氨氧化菌受到不利影响, 反应器脱氮性能不佳(苗蕾等, 2014).
以上研究侧重于厌氧氨氧化活性污泥系统, 但厌氧氨氧化菌有聚集生长的特点, 主要存在于颗粒或生物膜中(Hubaux et al., 2015).与厌氧氨氧化颗粒污泥形态的反应器不同, 厌氧氨氧化生物膜形态的反应器中厌氧氨氧化菌附着填料生长并富集, 填料能有效截留生物质, 且生物膜中微生物多样性更好, 使得反应器的稳定性增强(Wang et al., 2012；卢欣欣等, 2020；王淑雅等, 2020).此外生物膜系统与颗粒污泥系统中各种微生物群落存在差异, 针对有机物影响下厌氧氨氧化生物膜中微生物群落变化的研究鲜少.一般认为, 反硝化脱氮效率的提高需要有机物作为碳源, 而有机物会抑制厌氧氨氧化的效率, 有机物对两者的作用显著不同.探究在适当的有机物浓度条件下, 减轻对厌氧氨氧化菌不利影响、同时利用反硝化菌的脱氮作用, 使两类脱氮微生物共存, 形成耦合提高生物膜系统整体脱氮效果.本研究考察不同有机物浓度对以聚氨酯多孔载体为填料的厌氧氨氧化生物膜反应器影响, 以期研发厌氧氨氧化与反硝化有效耦合的生物膜反应器, 为处理有一定有机物含量的实际含氮污水提供参考价值.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 试验装置试验装置为柱状升流式厌氧氨氧化生物膜反应器, 采用蠕动泵连续进水, 每天进水量为38 L, 水力停留时间为4 h.如图 1所示, 反应器柱径10 cm, 高170 cm, 有效容积6.28 L, 底部设置高10 cm的鹅卵石层, 中部装填规格为1 cm×1 cm×1 cm的聚氨酯多孔载体, 填料区体积占47%, 顶部设置三相分离器.反应器在恒温室中进行避光培养, 通过室内温控系统, 使水温控制在30~32 ℃.
图 1(Fig. 1)
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| 图 1 厌氧氨氧化生物膜反应器 (1.进水桶；2.闸阀；3.进水管；4.蠕动泵；5.转子流量计；6.温控仪；7.三相分离器；8.排气管；9.出水管；10.填料；11.取样口；12.鹅卵石层；13.湿式气体流量计；14.恒温室) Fig. 1Anammox biofilm reactor |
2.2 接种污泥及试验用水反应器接种污泥取自于兰州市某A2/O(anaerobic-anoxic-oxic)工艺污水处理厂, 污泥量为5 L.采用静置24 h的自来水配制人工模拟污水, 进水NO3--N为0.21~3.83 mg·L-1, 药品NH4Cl和NaNO2等均为分析纯, 水中氨氮(NH4+-N)与亚硝氮(NO2--N)按物质的量比1 ∶ 1.32配制, 浓度分别为39.04~40.91、51.22~54.07 mg·L-1；并采用蔗糖配制进水COD, 依次为0、29.10~31.50、59.05~63.00、88.15~93.20 mg·L-1.进水pH范围为7.4~7.7, 依据文献(He et al., 2018) 配制的微量元素添加量为2 mL·L-1.
2.3 测试项目与方法进出水常规检测指标有NH4+-N、NO2--N、NO3--N、TN和COD, 各指标检测方法分别为纳氏试剂分光光度法、N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法、过硫酸钾氧化-紫外分光光度法(国家环境保护总局, 2002)、重铬酸钾比色法、麝香草酚分光光度法.
进水COD为0 mg·L-1和60 mg·L-1阶段末, 在反应器内距底部16 cm处, 采用MPN法(Isabel et al., 2019)检测单位体积填料的生物膜上反硝化菌数量, 操作：取10.0 g(11.8 cm3)填料置于装有100 mL无菌磷酸缓冲液的锥形瓶中, 并在摇床上振荡30 min使生物膜脱落, 制成100 mL均匀悬浊液, 然后用10倍梯度稀释法将悬浊液稀释成一系列梯度, 再进行培养及显色检测；同时取该处的填料分别制作了对应的生物膜样本ANB-0和ANB-60；高通量测序委托上海美吉生物医药科技有限公司通过Illumina Miseq(周子寒等, 2017)平台对反应器中微生物群落多样性进行检测.
3 结果与分析(Results and analysis)反应器总氮负荷0.56 kg·m-3·d-1, 在进水不含有机物条件下, 经过120 d的挂膜及富集培养后, 氨氮和亚硝氮去除率分别达到98.44%、99.63%, 厌氧氨氧化菌大量聚集生长, 生物膜呈现出特征性砖红色.厌氧氨氧化生物膜培养完成后, 考察了有机物对反应器处理效果及微生物的影响, 试验分为4个阶段, 每个阶段运行15 d, 对应的有机物浓度分别为0、30、60、90 mg·L-1.
3.1 有机物对反应器脱氮效能影响如图 2a所示, 第1阶段COD为0 mg·L-1, NH4+-N去除效果好, 去除率高达99.62%；第2、3阶段COD相对较低, NH4+-N平均去除率分别为98.68%和97.90%, 表明低浓度有机物对反应器内厌氧氨氧化脱氮效果无明显影响；第4阶段COD增至90 mg·L-1, NH4+-N去除率持续下降到80.20%, 在本阶段后期又回升至83.25%, 说明该浓度COD对厌氧氨氧化脱除NH4+-N产生不利影响.
图 2(Fig. 2)
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| 图 2 有机物对氮素去除效果影响 (a.NH4+-N和NO2--N去除效果, b. NO3--N和TN去除效果) Fig. 2The effect of organic matter on nitrogen removal efficiency |
图 2a中, 4个阶段运行过程中NO2--N去除率均高于98%, 有机物对该反应器的NO2--N去除效果无明显影响, 结果与倪守庆等研究相符(Ni et al., 2012).
由图 2b与图 3可知, 第1阶段, 反应器的出水NO3--N浓度为14.97 mg·L-1, 随着COD的增加, 出水NO3--N浓度逐渐降低, 至第4阶段时, 平均NO3--N出水浓度为2.61 mg·L-1, 由此可知, 反应器出水NO3--N浓度与有机物浓度呈负相关, 有机物浓度增加有利于反应器去除NO3--N.第4阶段的出水NO3--N浓度远小于厌氧氨氧化产生NO3--N浓度的理论值8.56 mg·L-1, 推测反应器内反硝化脱氮作用增强.
图 3(Fig. 3)
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| 图 3 出水污染氮素浓度变化 Fig. 3Changes in nitrogen concentration in effluent pollution |
由图 2b和图 3可知, 第1阶段TN平均去除率为83.94%, 出水主要氮素为NO3--N；COD增加, 第2、3阶段反应器的TN去除率因出水NO3--N浓度减少持续上升, 且在第3阶段达到最高94.35%, 与第1阶段相比, 分别提高了5.08%和10.41%；第4阶段COD为90 mg·L-1, TN去除率下降至89.05%, 出水主要氮素是NH4+-N, TN去除率因出水NH4+-N浓度增加而下降.结果表明, 适宜浓度范围的有机物能提高反应器的TN去除效果, 有机物浓度过高则造成TN去除效果变差.
3.2 有机物对反硝化菌数量的影响对生物膜内反硝化菌数量进行计数, 见表 1, 相对于无有机碳源时, 60 mg·L-1 COD使得反硝化菌数量增加了两个数量级, 表明有机物能刺激反硝化菌大量繁殖；且有机物浓度较低时, 反硝化菌能优先利用NO3--N(张美雪等, 2016), 因此适宜浓度的有机物能提高反应器的NO3--N去除效果.
表 1(Table 1)
| 表 1 不同有机物浓度下反硝化菌计数结果 Table 1 Counting results of denitrifying bacteria at different organic concentrations | ||||||||||||||||||||||||||||||||
表 1 不同有机物浓度下反硝化菌计数结果 Table 1 Counting results of denitrifying bacteria at different organic concentrations
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3.3 有机物对微生物群落丰富度影响各样本的文库覆盖率均为1.00, 测序结果能对样品生物膜中微生物群落进行有效分析(卢欣欣等, 2020).ACE和Chao1指数与微生物种数呈正相关, Simpson和Shannon指数分别与微生物群落多样性呈负相关和正相关(Kang et al., 2019), 对比分析表 2数据, 60 mg·L-1 COD使反应器中微生物种数增加显著且群落更加丰富.
表 2(Table 2)
| 表 2 生物膜微生物群落多样性指数表 Table 2 Biofilm microbial community diversity index table | |||||||||||||||
表 2 生物膜微生物群落多样性指数表 Table 2 Biofilm microbial community diversity index table
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3.4 有机物影响下门水平分析如图 4所示, 两样本中主要优势菌门有浮霉菌门(Planctomycetes)、变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(chloroflexi)和酸杆菌门(Acidobacteria).在厌氧反应器中检测出的浮霉菌门为厌氧氨氧化功能菌(杨瑞丽等, 2018), 相对于ANB-0中24.71%的浮霉菌门丰度, ANB-60中丰度增加8.32%, 两者均为丰度最高的脱氮菌门；变形菌门内的大部分细菌在微生物反硝化脱氮及众多有机物降解过程中发挥重要作用(Nguyen et al., 2011), ANB-0和ANB-60中丰度分别为16.16%、21.93%, 后者丰度增加了5.77%.相对于无有机物阶段, 60 mg·L-1 COD条件下两种脱氮菌门在生物膜中丰度明显增加, 说明厌氧氨氧化与反硝化作用耦合, 使反应器脱氮效能提高.
图 4(Fig. 4)
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| 图 4 生物膜中微生物主要菌门变化分析 Fig. 4Analysis of changes in the main phylum of microorganisms in biofilms |
绿弯菌门为能固定无机碳的自养型微生物(Cho et al., 2010), 与ANB-0对比, 其在ANB-60中的丰度降低了10.61%, 使与之有竞争作用的浮霉菌门因可利用无机碳源增多而丰度明显增加；酸杆菌门具有嗜酸特性(Costa et al., 2014), 由于反硝化作用产生碱度, 反应器中pH增加, 形成对酸杆菌门不利的环境, 使得ANB-60中酸杆菌门丰度减少4.84%.60 mg·L-1 COD对绿弯菌门和酸杆菌门不利, 两者丰度下降明显, 生物膜中脱氮菌门的竞争优势增加, 使反应器脱氮功能增强.
3.5 有机物影响下属水平分析从图 5看出, 在属分类水平下, 两样本中均检测出厌氧氨氧化菌属Brocadia和Jettenia, 两种菌属普遍存在于污水厂和反应器等生态系统中, Jettenia适合生存于低盐度环境中(洪义国等, 2019), 而Brocadia对NH4+和NO2-亲和性更强, 生长速率较快(Oshiki et al., 2011), 易成为优势菌属.在ANB-0和ANB-60中, Brocadia丰度分别为20.38%、28.58%, 后者丰度增加8.20%；Jettenia丰度分别为1.38%、1.24%, 两者相近.结果表明, 60 mg·L-1 COD对Jettenia菌属无明显影响, 但能增加生物膜内Brocadia菌属的丰度.
图 5(Fig. 5)
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| 图 5 生物膜中微生物主要菌属变化分析 Fig. 5Analysis of the main bacteria in the biofilm |
变形菌门内丰度上升的菌属依次为Thauera、Denitratisoma、Comamonadaceae, 三者均能降解有机物并具有反硝化功能(Fahrbach, 2006；李正魁等, 2008；郑林雪等, 2015), 与ANB-0相比, ANB-60中三者丰度分别增加了0.65%、1.25%、2.31%.Bacillus属于厚壁菌门且为有机化能营养型细菌, 能进行反硝化作用(布坎南, 1984；Du et al., 2017), 其在ANB-0和ANB-60中的丰度值分别为2.92%、2.75%, 变化较小.由此可知, 有机物浓度的增加可促进生物膜中异养反硝化菌的增殖.
适宜的有机物浓度不仅可提高具有厌氧氨氧化功能的Brocadia菌属丰度, 又能使反应器内维持足够的异养反硝化菌数, 两种脱氮功能菌在反应器中共存(吕振等, 2019), 形成脱氮效能高且稳定的耦合生物膜, 反应器脱氮效能得以提高.
3.6 微生物代谢通路level 1变化如表 3所示, 通过PICRUSt1功能预测分析, ANB-60样本中微生物的细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、新陈代谢、生物体系统等代谢通路的丰度统计值均明显高于ANB-0.在60 mg·L-1 COD作用下, 生物膜中微生物群落的代谢功能显著增强, 且微生物群落的脱氮功能增强, 进而使反应器的脱氮性能提升.
表 3(Table 3)
| 表 3 生物膜微生物群落代谢通路level 1丰度表 Table 3 Biofilm microbial community metabolic pathway level 1 abundance table | |||||||||||||||||||||
表 3 生物膜微生物群落代谢通路level 1丰度表 Table 3 Biofilm microbial community metabolic pathway level 1 abundance table
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4 讨论(Discussion)如图 2a和图 6所示, 90 mg·L-1 COD条件下, 有机碳源充足, 促进生物膜中反硝化菌大量增殖, 反硝化菌与厌氧氨氧化菌竞争共同底物NO2--N和生存空间(朱泽沅等, 2016), 厌氧氨氧化菌为自养菌且因NO2--N底物不足而影响其脱氮, 两种菌对有机碳源的需求存在矛盾, 导致反应器脱氮效能下降.降低有机物浓度能减轻有机物对厌氧氨氧化的不利作用, 见图 2和图 6, 进水有机物为30和60 mg·L-1时, 低浓度有机碳源对厌氧氨氧化脱氮无明显影响, 且反硝化菌利用NO3--N和NO2--N, 生物膜内两种菌协同脱氮；反应器内厌氧氨氧化菌产生的NO3--N为反硝化菌所利用(刘常敬等, 2015), 同时反硝化菌能为厌氧氨氧化菌提供无机碳源和NO2--N(韦愿等, 2019), 两者相互促进, 表现为共生关系, 反应器内厌氧氨氧化与反硝化作用有效耦合, 使脱氮效能得以提升.
图 6(Fig. 6)
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| 图 6 厌氧氨氧化菌与反硝化菌关系 Fig. 6The relationship between anammox bacteria and denitrifying bacteria |
5 结论(Conclusions)1) 与无有机物相比, 在90 mg·L-1有机物条件下, 生物膜中反硝化菌与厌氧氨氧化菌竞争, 不利于厌氧氨氧化脱氮, 反应器脱氮性能不佳；有机物浓度为30和60 mg·L-1时, 反应器中反硝化菌与厌氧氨氧化菌协同共生、优势互补, 使反应器具备耦合脱氮能力, 脱氮功能增强.
2) 相对于无有机物影响时, 在60 mg·L-1有机物作用下, 浮霉菌门、变形菌门丰度依次增加了8.32%、5.77%, 浮霉菌门下丰度上升的厌氧氨氧化菌属为Brocadia, 变形菌门内丰度增加的主要反硝化菌属是Thauera、Denitratisoma、Comamonadaceae.
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