于雯超^1,2, 朱利英^1,2,4, 魏源送^1,2,3, 海永龙^1,2,3
1. 中国科学院生态环境研究中心, 环境模拟与污染控制国家重点联合实验室, 北京 100085;
2. 中国科学院生态环境研究中心水污染控制实验室, 北京 100085;
3. 中国科学院大学, 北京 100049;
4. 中国矿业大学, 北京 100085
收稿日期: 2020-06-11; 修回日期: 2020-08-18; 录用日期: 2020-08-18
基金项目: 国家水体污染控制与治理科技重大专项项目（No.2017ZX07102，2017ZX07102-002）；中国博士后基金（No.2019M660825）
作者简介: 于雯超(1988-), 女, 博士, E-mail:wcyu@rcees.ac.cn
通讯作者（责任作者）: 魏源送, E-mail:yswei@rcees.ac.cn

摘要：水体中溶解性有机物（DOM）对各种类型污染物的迁移转化具有重要影响.为了考察干湿季节下再生水补给水体的DOM分子多样性变化及其主要成分对致病菌分布及迁移的影响，本研究以北京两个典型的再生水补给水体（清河和沙河水库）为对象，分别在旱季和雨季采集水样，采用三维荧光光谱（3D-EEM）、平行因子分析（PARAFAC）、光谱指数（FI、HIX和BIX）和¹H-NMR等方法分析水样的DOM，并采用定量PCR测定目标致病菌基因（ecfX、mcr1、gltA、tcpA和23S rDNA）的相对丰度.结果发现，清河和沙河水库水样的DOM分别为5个和4个组分，主要以自生源为主，且微生物活性较高，降雨会导致腐殖酸类有机质的输入.¹H-NMR分析表明，清河和沙河水库水样中DOM有6个氢核基团，旱季以烷氧基和脂肪族羟基基团为主，雨季则以羧基或芳香环氢核基团为主.相关性分析结果表明，旱季致病菌基因的相对丰度与DOM特征组分的相关性较弱；雨季DOM更利于与致病菌表面吸附，致病菌基因的相对丰度与CH₃、CH、CHO/N、H_Ar、H_p和CH-α呈显著相关性（p < 0.05）.
关键词：再生水溶解性有机质三维荧光光谱平行因子分析干湿季节
Characteristics of dissolved organic matter and its correlation with pathogenic genes for river replenished by reclaimed water in wet and dry seasons
YU Wenchao^1,2, ZHU Liying^1,2,4, WEI Yuansong^1,2,3, HAI Yonglong^1,2,3
1. State Key Joint Laboratory of Environment Simulation and Pollution Control, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085;
2. Laboratory of Water Pollution Control Technology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085;
3. University of Chinese Academy of Science, Beijing 100049;
4. China University of Minning and Technology, Beijing 100085
Received 11 June 2020; received in revised from 18 August 2020; accepted 18 August 2020
Abstract: Dissolved organic matter (DOM) is widely distributed in the aquatic environment in which fluvial networks are globally pertinent to the processing of DOM, and plays an important role in the migration and transformation of various types of contaminants, such as heavy metals, organic pollutants, endocrine disrupters (EDC) and bacterial or pathogens. To investigate the diversity and molecular characteristics of DOM in the river replenished by reclaimed water and compare the change of DOM composition at different seasons, one river and one reservoir receiving effluent from the typical reclaimed water treatment plants were selected to take samples in dry and wet seasons. Spectral index (FI, HIX and BIX), EEM-PARAFAC, and ¹H-NMR were applied to determine the DOM. And quantity PCR was applied to measure the relative abundance of the pathogenic genes including ecfX, mcr1, gltA, tcpA and 23S rDNA to study their correlation with DOM. The results showed that DOM for the Qinghe River and Shahe Reservoir were divided into five and four components, respectively, which were mainly composed of microbial endogenous metabolites with high bioavailability and low degree of humidity. A positive correlation was found between DOM components (CH₃, CH, CHO/N, H_Ar, H_p and CH-α) and relative abundance of pathogenic genes (p < 0.05) in the Shahe Reservoir during the wet season.
Keywords: reclaimed waterdissolved organic matter (DOM)three-dimensional fluorescence spectrumparallel factor analysis (PARAFAC)wet and dry season
1 引言(Introduction)随着人口增长、工业化和城市化进程加快, 以及全球气候变化, 中国正面临包括短缺和污染在内的严重的水资源问题, 水资源短缺已成为制约中国经济发展的关键因素.水的回收、循环和再利用已成为解决水危机的重要举措(FAO, 2012), 世界范围内均有水回用项目的实施以减轻水资源短缺问题.美国已在公共/家庭用水、工业/商业用水、农业灌溉、畜牧养殖和热电系统等方面实施再生水利用, 其中, 农业灌溉和热电系统分别占回用总量的40%和39%(USEPA, 2012).随着我国城市污水处理率的提高, 再生水利用率也不断提高.2018年我国城市污水处理量达497.6亿m³, 污水处理率达95.49%, 再生水利用量达10.7亿m³(中华人民共和国住房和城乡建设部, 2019).近年来, 北京市在城市污水处理与回用方面做了大量的工作, 缓解了长期缺水的状况, 再生水利用已成为北京市水资源管理的重要组成部分.据统计, 2018年北京市总供水量达39.3亿m³, 再生水使用量占总供水量的27%, 其中约9.2%和2.2%的再生水分别用于环境再利用和工业再利用, 约3.0%的再生水用于农业灌溉(北京市水务局, 2011).因此, 再生水补充地表水已成为缓解城市生态用水危机的有效措施之一.
再生水利用是缓解水资源短缺和水环境质量恶化的有效途径之一, 但再生水成分复杂, 包含一定量的无机物、悬浮物、有机物和病原菌等, 存在一定的生态风险(Yi et al., 2011), 其安全性和对环境的影响已引起了国内外****的广泛关注.溶解性有机物(Dissolved Organic Matter, DOM)是脂肪族和芳香族聚合物的非均相混合物, 其组成随时间和空间的变化而发生变化(Stedmon et al., 2003).DOM是连接生物碳和无机碳的关键因子, 一方面, DOM表面富含多种化学活性较高的官能团, 对水中污染物的环境行为(吸附、解吸、迁移)具有重要作用(郭彦芬等, 2017)；另一方面, DOM可以作为营养物质为微生物提供碳源或作为载体转移致病菌, 对人类健康和生态系统造成危害(徐爱玲等, 2018).由于受纳水体空间环境的不同, 再生水的DOM组成在再生水进入到受纳水体后发生较大改变.因此, 为了提高再生水利用的安全性, 迫切需要深入了解再生水的DOM结构组成和特性.
近年来, 已有许多科研人员开展了水环境中DOM结构和特征的研究和调查, 对不同区域自然水体中有机质组分(如富里酸、类色氨酸物质、陆源/海洋类腐殖酸物质、微生物产物非腐殖酸类有机质组分等)及有机质分子组成(如—OH键、C=O键和C—O键等碳水化合物、芳香酸等)进行了总结和分析(Sanchez et al., 2014;赵夏婷等, 2018; 张广彩等, 2019; Zuo et al., 2019).但对于再生水补给河道的有机质特征及分子结构尚不清楚, 有机质的存在对再生水中残留的细菌甚至致病菌的分布和迁移具有重要意义, 再生水中有机质关键分子组成与致病菌之间具有何种相关性目前还不得而知.早期关于DOM特征的研究采用紫外-可见光谱(UV-Vis)、三维荧光光谱(3D-EEM)、傅立叶红外变换光谱(FTIR)及体积排阻色谱(HP-SEC)等单一或组合测定方法.其中, 荧光光谱法作为一种三维激发-发射矩阵(EEM), 能够有效捕捉荧光DOM特征, 揭示有机质组分的构象变化及蛋白质、色氨酸等残基的微环境变化, 是表征DOM的一种简单而有前途的技术(Zuo et al., 2019).随着光谱研究的不断发展, 平行因子分析(PARAFAC)方法可将化学性质独立但光谱重叠的荧光成分进行数学分离(Sanchez et al., 2014), 进而对不同组分进行有效的定性与定量分析, 促进了EEMs在DOM结构和特征中的应用研究.
因此, 针对北京市再生水补充河湖的现状, 本研究根据再生水受纳水体的环境特征, 选择北京市两座典型再生水厂(清河和沙河)出水及其受纳水体的上下游水体作为研究对象, 分别在旱季和雨季进行采样, 结合HP-SEC、3D-EEM、PARAFAC和¹H-NMR, 分析DOM的组成、分布和来源, 以明确DOM的时空变化特征.同时, 定量分析水样中5种致病菌的典型基因(ecfX、mcr1、gltA、tcpA和23S rDNA), 揭示再生水进入受纳水体过程中致病菌与DOM关键组分的相关性, 以期为北京市再生水的安全利用提供科学依据.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 研究区域与样品采集沙河再生水厂和清河再生水厂分别位于北京市昌平区、海淀区, 平均日处理规模分别为9×10⁴、55×10⁴ m³ · d^-1, 其中, 沙河再生水厂采用A²/O+MBR处理工艺, 清河再生水厂采用倒置A²/O工艺、A²/O工艺和A²/O+MBR工艺, 均执行北京市《城镇污水处理厂水污染物排放标准》(DB11/890-2012), 两个再生水厂的排水去向分别是沙河水库和清河.根据GPS定位仪, 采样点分别位于沙河再生水厂排入沙河水库的出水口(40.13°N、116.30°E)和清河再生水厂排入清河的出水口(40.02°N、116.36°E), 并分别在距离出水口上游1000 m、上游500 m、下游500 m、下游1000 m和下游2000 m处采集表层水(约距水面0.5 m).采样点分布如图 1所示.
图 1(Fig. 1)

图 1 清河和沙河水库的再生水出水口及其上下游采样点示意图 Fig. 1Map of sampling sites in Sha River and Qing River

本研究分别于2019年旱季(4月)和雨季(7月)采集水样, 共采集144个样品.为避免采样误差对样品自身性质的干扰, 每季连续采样3 d, 每个位点采集两个样品.其中, 旱季分别于4月17—19日连续3 d采样, 且在样品采集前后24 h内无降雨发生；雨季分别于7月23—25日连续3 d采样, 采样前后24 h内有降雨发生, 累计降雨量为53.8 mm.将水样装入500 mL无菌袋中, 置于冰盒的密封保温箱中, 立即运回实验室进行各项指标分析测定.
2.2 DOM基本结构和特征分析2.2.1 三维荧光光谱与平行因子分析3D-EEM采用三维荧光光谱仪(F-7000, 日本日立)测定.将分析水样预先经过0.45 μm滤膜过滤, 通过超纯水稀释水样直至其吸光度A₂₅₄＜0.05.荧光分光光度计光源为150 W氙灯, PMT电压为700 V.激发波长为200~400 nm, 发射波长为220~550 nm, 激发和发射波长狭缝宽度均为5 nm, 扫描速度为12000 nm · min^-1.使用Milli-Q超纯水拉曼光谱强度进行空白校订.计算荧光指数(FI)、生物指数(BIX)和腐殖化指数(HIX), 其中, FI是激发波长为370 nm时, 发射波长在470 nm和520 nm处荧光强度的比值, 用于表征腐殖质的来源；HIX表示激发波长为254 nm时, 发射波长在435~480 nm与300~345 nm区域之间的荧光强度积分的比值, 用来衡量DOM腐熟程度, HIX值越大, 表示腐熟程度越高；BIX表示激发波长为310 nm时, 发射波长在380 nm与430 nm处荧光强度比值, 用于表征水中微生物生物活性, 衡量DOM的生物源与外源相对贡献程度(郑利兵等, 2020).
PARAFAC分析是基于三线分解理论、采用交替最小二乘法的一种应用于三维及多维数据解析的数学方法(张广彩等, 2019).PARAFAC建模采用MATLAB 2016a中的DOMFluor工具箱进行, 在PARAFAC初步应用后, 采用校正散射(瑞利散射和拉曼散射)检验筛选残差和杠杆值, 将较高的观测值归类为离群值并从数据集中剔除, 最终经过重复迭代确定合适的DOM组分数.
2.2.2 ¹H-NMR光谱分析取约600 μL经过SPE(Bong Elut-PPL, Agilent, USA)固相萃取富集后的水样于核磁测试管中, 所使用溶剂为重水(D₂O, 99.95%D, Sigma-Aldrich).¹H-NMR核磁共振波谱使用核磁共振微成像仪Bruker AVIII 500WB (瑞士布鲁克公司)在400 mHz ¹H频率下获得.实验设定参数采用90个激发脉冲(采集时间为3.2 s, 弛豫延迟为2 s, 100个扫描).所得图谱利用MestReC软件进行傅立叶变换、相位校正和积分处理.
2.3 致病菌基因定量检测荧光定量PCR(qPCR)测试均采用ABI荧光定量PCR检测仪(ABI StepOneplus, USA).阳性对照中所使用的目标基因选择5种典型致病菌基因(ecfX、mcr1、gltA、tcpA和23S rDNA).ecfX常用于检测铜绿假单胞菌, 该菌是条件致病菌, 植物也有机会性感染.mcr1常存在于一些可能引发流行病的菌株中, 在常见细菌之间会发生转移(如大肠杆菌和克氏杆菌之间的转移).gltA是细菌体内谷氨酸代谢的重要基因, 常用于检测克雷白氏肺炎杆菌.tcpA是霍乱弧菌协同调节菌毛亚单位A基因.23S rDNA常用于临床常用病原菌的鉴定, 如肠球菌等(Brooks et al, 2016).qPCR混合体系使用SYBR Premix Ex TaqTM荧光定量试剂盒(T LiRnaseH Plus, TAKARA).定量PCR操作体系及仪器参数参照文献(Brooks et al., 2016).
2.4 数据处理与分析平均值和标准偏差及荧光指数积分计算和制图采用Origin 8.0(OriginLab, USA).采用SPSS 19.0(IBM, USA)对不同位点及干湿季节不同致病菌基因相对丰度进行Spearman相关分析.相关性网络图采用Cytoscape3.8(NRNB, USA)进行绘制.
3 结果与讨论(Results and discussion)3.1 再生水的DOM分子量分布特征如图 2所示, 旱季清河和沙河再生水厂出水口及其上下游水样中的DOM分子量(MW)集中分布在700~45000 Da, 且存在较多的吸收峰, 说明水质较为复杂.清河和沙河再生水补充河道第一个峰均出现在低于1000 Da的位置, 主要为亲水中性有机物(多糖、醛类、酮类、低分子量烯丙醇等有机物)((Brezinski et al., 2019).大多数吸收峰出现在1000~3500 Da范围内, 代表难/非生物降解的有机组分(Lee et al., 2004), 分别占清河和沙河再生水补充河道中DOM种类的79.26%~91.91%和84.85%~90.16%.其次腐殖酸等大分子量有机物主要分布在MW>10000 Da范围(Brezinski et al., 2019), 清河占比为8.08%~17.77%, 沙河占比为2.60%~12.45%.雨季清河和沙河再生水厂出水口及其上下游水样中的DOM分子量吸收峰集中出现在中低分子量区域, 其中, 清河再生水的DOM分子量以800~4200 Da范围内为主, 沙河再生水的DOM分子量集中在900~4500 Da.如图 2c结果所示, 降雨对清河DOM分子量影响不明显, 清河出水口及其上下游DOM分子量未表现出明显的迁移.但如图 2d所示, 雨季沙河水库上下游位点水样中的DOM分子量出现了明显的迁移, 说明降雨对缓滞水体(沙河水库)的DOM组分扰动较大.Wu等(2003)研究发现, DOM存在分子量从大到小的降解路径, 表明水体中不同来源有机质存在相互转化的关系.因此, 经过降雨后, 清河和沙河再生水厂出水口及其上下游水样中的DOM分子量吸收峰从中高分子量区域向中低分子量区域迁移, 可能是由于大分子生物源有机质分解转化成小分子有机质, 结果与早期研究结果(Wu et al., 2003)相一致.
图 2(Fig. 2)

图 2 清河和沙河水库水样中DOM的分子量分布 Fig. 2HP-SEC responses of dissolved organic matter of reclaimed water in Qing River and Sha River

3.2 DOM的荧光组分和来源通过PARAFAC分析, 清河和沙河水库所有样点的三维荧光光谱分别包括5个和4个荧光组分.在旱季, 清河再生水中DOM的组分C1(λ_Ex/λ_Em=265/315 nm)是溶解性微生物代谢产物(Stedmon et al., 2003), 组分C3(λ_Ex/λ_Em=230/345 nm)主要为类色氨酸芳香族蛋白质.已有研究表明, 类色氨酸是通过微生物和细菌降解代谢产生, 可以是游离或结合的蛋白质或氨基酸(牛天浩等, 2016).组分C4(λ_Ex/λ_Em=240/410 nm)指示紫外光区富里酸区域, 主要是由相对分子质量较大、相对稳定的有机物产生(张广彩等, 2019), 其组成可能与DOM中羰基和羟基有关(李帅东等, 2017).C2和C5组分(λ_Ex/λ_Em=200/305 nm；λ_Ex/λ_Em=200/295 nm)分别指示芳香蛋白质类物质和类酪氨酸类有机质, 两组组分通常也与微生物产物相关.C5的发射波长相对于C2组分发生蓝移, 从305 nm向295 nm转移, 因此, 相对于C2, C5具有更小的分子量和更少的芳香性(Yang et al, 2018).李昀等(2019)研究表明, 酪氨酸物质主要来源于生活污水, 表征了分解程度小、较为新鲜的类蛋白.刘丽贞等(2018)的研究也证明水体中溶解态类酪氨酸比类色氨酸更容易光降解, 不易长时间保存于水环境.经过降雨后(雨季), PARAFAC分析结果表明, 清河的DOM未有新组分出现, 尽管C1(微生物代谢产物)和C4(类富里酸)组分的荧光峰F_max比旱季均有升高, 分别升高0.017%和0.060%, 但并不显著(p > 0.05).袁冬海等(2019)对雨水有机质进行了PARAFAC分析, 发现雨水中有机质可分离成类腐殖酸和类蛋白类两类有机质, 这可能是造成雨季清河水样的类富里酸和类蛋白荧光强度升高的原因, 但清河水文条件(如流速)的限制等并没有造成类富里酸和类蛋白组分的持续升高.
在旱季, 沙河水样中DOM分离出4个组分, 依据清河旱季中DOM划分组分来看, 分别为C1(λ_Ex/λ_Em =270/315 nm)属于溶解性微生物代谢产物、C2(λ_Ex/λ_Em=200/305 nm)属于芳香蛋白质类物质、C3(λ_Ex/λ_Em=230/340 nm)属于类色氨酸芳香族蛋白质、C4(λ_Ex/λ_Em=240/415 nm)属于类富里酸有机质.而在雨季, 沙河水样的DOM组分类别发生了较大的变化, 分别为C2(λ_Ex/λ_Em=205/325 nm)为芳香蛋白质类物质、C3(λ_Ex/λ_Em=235/345 nm)为类色氨酸蛋白质、C4(λ_Ex/λ_Em=250/415 nm)为类富里酸有机质和C5(λ_Ex/λ_Em=200/290 nm)为类酪氨酸类有机质.经过降雨, 沙河出现了雨水中典型有机质腐殖酸和类蛋白类有机质, 说明相对于较为开放的清河, 相对封闭的沙河DOM组分更易受到降雨的干扰.经过降雨后, 沙河芳香类蛋白质荧光峰F_max降低了61.38%, 但类色氨酸类有机质F_max升高13.5%, 这说明雨季沙河水库水样中DOM的变化既来自于雨水的输入, 又有自身微生物类蛋白质类有机质之间的相互转化, 但其转化机制还需进一步研究.综上所述, 旱季条件下, 清河和沙河为以类蛋白质为主要DOM组成类型、类富里酸次之的复合型再生水补充水体；随着降雨伴有类腐殖酸类有机质输入, 这一结果也与刘丽贞等(2018)关于鄱阳湖不同水文时期DOM动态变化分析结果相一致.
图 3(Fig. 3)

图 3 清河和沙河水库水样中DOM的荧光特征组分 Fig. 3Various components identified by the EEM-PARAFAC analysis for reclaimed water in Qing River and Sha River

为进一步探究清河和沙河再生水补给河道中DOM的来源和腐殖化程度, 采用荧光指数FI、腐殖化参数HIX和生物源参数BIX对比分析清河和沙河出水口及其上下游河道的DOM来源特征.如表 1可知, 所有样点FI值均大于1.9, 旱季清河、沙河和雨季清河、沙河FI值分别为2.22~2.65、2.11~2.53、2.13~2.56和2.07~2.39, 说明清河和沙河出水及其再生水补充河体DOM主要来自于微生物分解的内源性代谢产物.且旱季清河和沙河FI指数平均值(FI_AVG-qing=2.42, FI_AVG-sha=2.41)均高于雨季清河和沙河FI指数平均值(FI_AVG-qing=2.35, FI_AVG-sha=2.23), 说明旱季中由微生物活动产生的腐殖质含量较高.生物源指数BIX表现出相反的趋势, 雨季清河和沙河的BIX平均值(BIX_AVG-qing=1.47, BIX_AVG-sha= 1.35)均高于旱季清河和沙河的BIX平均值(BIX_AVG-qing=1.31, BIX_AVG-sha=1.30), 且BIX指数均高于0.8, 说明雨季清河和沙河再生水补充河道DOM主要由微生物近期自身活动产生(刘健等, 2019).同时, 雨季清河和沙河排水口出水BIX指数显著升高(p＜0.05), 说明再生水源的DOM主要为生物处理过程中微生物的近期自由活动所产生.HIX指数可以用于估计DOM腐殖化程度, HIX指数越高则腐殖化程度越高, 芳香性越强(刘丽贞等, 2018).如表 1所示, 雨季清河和沙河的HIX平均值(HIX_AVG-qing=0.92, HIX_AVG-sha=1.22)均显著高于旱季清河和沙河的HIX平均值(HIX_AVG-qing=0.27, HIX_AVG-sha=0.38).Huguet等(2009)研究表明, 当HIX＜4时, DOM的腐殖化程度较低.而Zhang等(2010)研究表明, 当HIX＜1.5时则表明DOM具有生物自生源特征.本研究中清河和沙河HIX指数均小于1.5, 说明清河和沙河整体腐殖化程度较弱, 生物活性较强, 这与FI和BIX指数结论相一致.雨季的HIX指数升高, 雨季清河和沙河出水HIX指数均低于其上下游河道, 说明HIX指数平均值的升高是由于降雨导致的外源性腐殖质类物质的输入造成的.综上所述, 光谱指数(FI、BIX和HIX)对清河和沙河中DOM的来源及腐殖化程度具有较好的指示性.清河和沙河再生水及其补给河道DOM来源以自生源为主, 且微生物活性较高(FI>1.9, BIX>0.8), 而腐殖化程度较低(HIX＜1.5).雨季DOM腐殖化程度主要受到外源雨水输入的贡献, 这一结果与平行因子分析结果相一致.
表 1(Table 1)

表 1 干湿季节下清河和沙河水样中DOM的荧光参数变化 Table 1 Fluorescence index of Qing River and Sha River in dry and wet seasons

表 1 干湿季节下清河和沙河水样中DOM的荧光参数变化 Table 1 Fluorescence index of Qing River and Sha River in dry and wet seasons 位点名称 旱季 雨季 FI HIX BIX FI HIX BIX 清河上游1000 m 2.44 0.21 1.34 2.56 0.92 1.26 清河上游500 m 2.31 0.20 1.34 2.21 0.90 1.32 清河出水口 2.31 0.31 1.33 2.46 0.89 1.91 清河下游500 m 2.60 0.29 1.27 2.50 1.00 1.50 清河下游1000 m 2.65 0.30 1.37 2.13 0.88 1.44 清河下游2000 m 2.22 0.30 1.25 2.22 0.95 1.41 沙河上游1000 m 2.53 0.32 1.25 2.27 1.70 1.16 沙河上游500 m 2.43 0.36 1.30 2.35 1.60 1.22 沙河出水口 2.48 0.78 1.31 2.07 0.54 1.63 沙河下游500 m 2.50 0.29 1.34 2.11 1.19 1.37 沙河下游1000 m 2.42 0.26 1.32 2.18 1.08 1.38 沙河下游2000 m 2.11 0.26 1.29 2.39 1.23 1.36

3.3 DOM分子的¹H-NMR分析DOM具有高化学活性, 其表面富含羧基、羟基、甲氧基、羰基等高活性官能团, 对环境中重金属、有机污染物物质甚至微生物、致病菌等的吸附、解吸、迁移、生物毒性、微生物活性、营养物质有效性等具有重要的调节作用(郭彦芬等, 2017).相对于其它光谱研究手段, NMR分析具有深入探测物质内部且能够准确、快速地对复杂样品进行分析等优点(梁向晖等, 2017).因此, 本研究采用¹H-NMR方法分析各采样点DOM化学组成, 通过对谱图积分定量分析样品中含氢核的关键有机组分的相对含量.本研究中将水样进行SPE固相萃取富集后, 以D₂O为溶剂溶解DOM进行NMR氢谱测试.图 4为干湿两季清河和沙河再生水厂出水口及其上下游补给河道12个位点DOM的¹H-NMR图谱, 所有图谱均表现为广泛的叠加NMR共振峰, 该谱图符合经过处理的河流有机质的典型特征(Kamjunke et al., 2019).如图所示, 获得的光谱包含主链质子, 而溶剂(D₂O)残留质子位置主要集中在4.7~5.5 ppm, 进行组分相对含量积分处理时扣除该范围对目标组分积分的影响.在清河和沙河水样DOM的¹H-NMR谱图中, 6个共振峰的峰面积与对应的氢核之间存在定量关系, 可计算出相对应组分的含量, 利用下列组分对光谱进行整合(表 2), 0~1.15 ppm：甲基(CH₃—)；1.15~1.90 ppm：亚甲基(CH₂—)；1.90~2.05 ppm：次甲基(CH—)；2.05~3.20 ppm：位于α位置上的羧基或芳香环中碳连接的质子(X-CαH, X为—COOH、COOR、C_Ar)；3.2~4.5 ppm：烷氧基和脂肪族羟基、胺和酰胺(CHO/N)；6.0~7.0 ppm(H_p)：多肽、氨基酸；7.0~10.0 ppm：芳香和酚类质子(C_ArH、C_ArOH).总体来看, 旱季清河和沙河水样DOM以CHO/N(72.43%和47.26%)和非功能性脂肪族基团(CH₃—, 14.62%和32.14%)为主要组成组分, 其次为X-CαH和C_ArH, 而H_p占比最低, 分别仅占总含量的0.08%和0.69%.结构多样性较低的开链脂肪族基团产生了相对尖锐的NMR共振(δ_H：0~2.05 ppm)(图 4a和4b), 这部分尖锐共振峰表现为上游比下游更为丰富, 该结果也与已有研究相一致(Kamjunke et al., 2019).
图 4(Fig. 4)

图 4 清河和沙河水库水样中DOM的1H-NMR图 Fig. 41H-NMR spectra of dissolved organic matter of reclaimed water in Qing River and Sha River

表 2(Table 2)

表 2 清河和沙河水库水样中DOM的核磁共振氢谱中各峰归属及其相对含量 Table 2 Spectral intensity of 1H NMR of the DOM samples acquired in D2O for Qing River and Sha River

表 2 清河和沙河水库水样中DOM的核磁共振氢谱中各峰归属及其相对含量 Table 2 Spectral intensity of 1H NMR of the DOM samples acquired in D2O for Qing River and Sha River 时期 位点名称 CH3—(0~1.15 ppm) CH2—(1.15~1.9 ppm) CH—(1.9~2.05 ppm) CH-α(2.05~3.2 ppm) CHO/N(3.2~4.5 ppm) Hp(6.0~7.0 ppm) HAr(7.0~10.0 ppm) 旱季 清河上游1000 m 1.14% 1.51% 0.04% 0.93% 0.35% 0.01% 0.03% 清河上游500 m 1.01% 0.14% 0.07% 0.62% 9.14% 0.00% 0.02% 清河出水口 0.90% 0.34% 0.08% 0.14% 2.38% 0.00% 0.16% 清河下游500 m 4.05% 1.09% 0.12% 2.00% 32.59% 0.04% 0.12% 清河下游1000 m 1.05% 0.10% 0.03% 0.04% 4.87% 0.02% 0.00% 清河下游2000 m 1.90% 1.25% 0.10% 0.14% 2.68% 0.01% 0.12% 沙河上游1000 m 10.12% 3.76% 0.24% 0.26% 5.40% 0.07% 0.36% 沙河上游500 m 1.10% 0.34% 0.04% 0.17% 1.31% 0.00% 0.03% 沙河出水口 1.12% 1.07% 0.05% 0.08% 1.57% 0.01% 0.11% 沙河下游500 m 0.99% 0.29% 0.07% 0.36% 4.28% 0.01% 0.00% 沙河下游1000 m 0.94% 0.19% 0.03% 0.79% 3.99% 0.00% 0.05% 沙河下游2000 m 21.70% 10.07% 1.21% 1.56% 36.32% 0.04% 1.10% 雨季 清河上游1000 m 1.05% 0.13% 0.01% 3.19% 0.51% 0.01% 0.11% 清河上游500 m 3.71% 1.24% 0.09% 3.14% 1.89% 0.04% 0.88% 清河出水口 1.04% 0.39% 0.06% 4.28% 0.97% 0.00% 0.27% 清河下游500 m 0.93% 0.69% 0.05% 0.15% 6.07% 0.00% 0.11% 清河下游1000 m 11.68% 5.24% 0.18% 56.10% 7.79% 0.01% 2.00% 清河下游2000 m 1.01% 1.18% 0.16% 0.26% 6.54% 0.00% 0.84% 沙河上游1000 m 0.97% 0.26% 0.00% 9.63% 0.07% 0.00% 0.07% 沙河上游500 m 20.88% 5.91% 0.88% 1.18% 18.30% 0.07% 1.79% 沙河出水口 9.17% 4.17% 0.09% 39.89% 15.74% 0.05% 2.91% 沙河下游500 m 1.01% 0.03% 0.03% 7.77% 3.06% 0.01% 0.10% 沙河下游1000 m 0.99% 0.37% 0.07% 0.29% 18.13% 0.01% 0.13% 沙河下游2000 m 0.98% 0.21% 0.01% 1.52% 0.22% 0.00% 0.06% *注：CH3—：甲基；CH2—：亚甲基；CH—：次甲基；CH-α：与电子消除基团相连接质子, 即富羧基脂环基团或芳香族基团；CHO/N：烷氧基和脂肪族羟基、胺和酰胺；Hp：多肽、氨基酸等；HAr：芳香类和酚类质子.

雨季清河和沙河水样DOM的各组分相对含量发生了变化, CH-α成为优势组分, 分别占总组分含量的54.11%和36.08%；羧基或芳香环中碳连接的质子含量升高, 这可能是由于降雨导致的外源腐殖酸物质输入导致.清河水样DOM的各优势组分依次为CH-α(54.11%)>CHO/N(19.17%)>CH₃—(15.68%)> CH₂—(7.16%)>H_Ar(3.39%)>CH—(0.44%)>H_P(0.05%), 其中CH-α、CH₃—、CH₂—、CH—、H_Ar的相对含量显著高于旱季.沙河水样DOM的各优势组分依次为CH-α(35.72%) > CHO/N(33.24%)> CH₃—(20.37%)> CH₂—(6.57%)>H_Ar(3.02%)> CH—(0.65%)>H_P(0.07%), 其中, CH-α、CHO/N、H_Ar的相对含量显著高于旱季.综上所述, 地理环境对组分的影响相对较弱, 降雨使清河和沙河的有机物组分发生转变, 由烷氧基和脂肪族羟基、胺和酰胺(δ_=H：6.0~7.0 ppm)优势共振峰转化为位于α位置上的羧基或芳香环中碳连接的质子(δ_=H：3.2~4.5 ppm)NMR优势共振峰, 这种转变可能对水体环境中污染物的迁移转化具有重要意义.
3.4 致病菌的相对丰度及其与DOM质量相关性分析如图 5所示, 在旱季, 清河上游河道中ecfX相对丰度较高而在出水口相对丰度降低随后表现出逐渐升高趋势.gltA仅在出水口及下游500 m以及tcpA仅在出水口有检出, 在出水口相对丰度分别为8.17×10^-5和1.67×10^-6.mcr1和23S rDNA相对丰度受出水口再生水缓冲出现降低, 随着水流向下游流动其相对丰度逐渐升高(p＜0.05).在旱季沙河再生水出水口及其上下游河道中, gltA仅在上游环境中有检出, 而ecfX在下游环境中检出率较高.mcr1、ecfX和tcpA相对丰度均表现为下游高于上游.23S rDNA相对丰度在出水口处最高, 为1.91×10^-3.雨季中清河和沙河再生水补给河道中致病菌相对丰度均高于旱季中两个典型再生水补给河道中的检测丰度(p＜0.05).除ecfX没有检出之外, 其余致病菌基因均在清河和沙河的雨季水样中有检出.清河再生水补给河道中, tcpA仅在下游环境中有检出, gltA在6个检测样点中均有检出, 但相对丰度随上游到下游逐渐升高；mcr1和23S rDNA在出水口中相对丰度显著高于上游及下游环境, 出水口处相对丰度分别为1.91×10^-3和2.24×10^-3.沙河再生水补给河道中gltA、23S rDNA和tcpA相对丰度显著高于清河(p＜0.05).其中, gltA和tcpA相对丰度从上游到下游逐渐降低, 出水口处mcr1和23S rDNA的相对丰度显著升高, 分别为2.93×10^-3和1.09×10^-3.结果发现, 清河和沙河再生水厂出水口中均表现出23S rDNA的相对丰度显著高于其上下游河道, 这可能是由于再生水厂中生活污水为主要污水来源以及受到再生水厂生物处理的影响.
图 5(Fig. 5)

图 5 清河和沙河水库水样的致病菌基因相对丰度 Fig. 5Relative abundance of pathogen genes in Qing River and Shahe Reservoir in dry and wet seasons

为了进一步研究DOM对再生水中致病菌丰度的潜在影响, 进行了致病菌基因相对丰度与有机质特征组分的Spearman相关性分析.基于¹H-NMR积分定量的6个有效特征组分, 旱季清河和沙河水样中致病菌基因与有机质组分相关性较弱, 清河表现为H_Ar(δ=H：7.0~10.0 ppm)与gltA和ecfX相对丰度呈负相关(p＜0.05), 沙河DOM中CH-α(δ_=H：3.2~4.5 ppm)组分与ecfX相对丰度呈正相关, 与23S rDNA相对丰度呈负相关(p＜0.05).但由于旱季清河和沙河水样的H_Ar和CH-α相对开链脂肪族基团含量较低, 因此, 具有H_Ar和/或CH-α特征组分的DOM不易于吸附致病菌而造成其远距离迁移或积累于沉积物中.雨季相关性分析结果显示, 清河水样的有机物特征组分未发现具有相关性, 这可能是由于汛期降雨显著提高了河流流速, 而清河的地理环境相对开放从而不利于致病菌的富集.但沙河表现出相关性较强, 相关性分析结果表明, gltA相对丰度与CH₃、CH、CHO/N、H_Ar和H_p呈显著正相关, 23S rDNA相对丰度与CH-α相对含量呈显著正相关(p＜0.05), tcpA相对丰度与CH₃、CH、CHO/N、H_Ar和H_p呈显著负相关(p＜0.05).已有文献也证明细菌的丰度和活性与不饱和有机组分呈负相关, 而与更多的脂肪族组分(H/C>1)呈正相关(Kamjunke et al., 2019).上述研究结果表明, 雨季清河和沙河水样的DOM以CHO/N和CH-α基团为主, 而地理环境相对封闭的沙河中DOM更利于结合如含有gltA、23S rDNA基因的致病菌等, 增加其在环境中迁移转化的风险.综上所述, 应加强雨季再生水补给河流DOM的有效控制和去除, 以减少对环境污染物如致病菌的迁移转化.
为了进一步研究DOM对再生水中致病菌丰度的潜在影响, 进行了致病菌基因相对丰度与有机质特征组分的Spearman相关性分析.基于¹H-NMR积分定量的6个有效特征组分, 旱季清河和沙河水样中致病菌基因与有机质组分相关性较弱, 清河表现为H_Ar(δ=H：7.0~10.0 ppm)与gltA和ecfX相对丰度呈负相关(p＜0.05), 沙河DOM中CH-α(δ_=H：3.2~4.5 ppm)组分与ecfX相对丰度呈正相关, 与23S rDNA相对丰度呈负相关(p＜0.05).但由于旱季清河和沙河水样的H_Ar和CH-α相对开链脂肪族基团含量较低, 因此, 具有H_Ar和/或CH-α特征组分的DOM不易于吸附致病菌而造成其远距离迁移或积累于沉积物中.雨季相关性分析结果显示, 清河水样的有机物特征组分未发现具有相关性, 这可能是由于汛期降雨显著提高了河流流速, 而清河的地理环境相对开放从而不利于致病菌的富集.但沙河表现出相关性较强, 相关性分析结果表明, gltA相对丰度与CH₃、CH、CHO/N、H_Ar和H_p呈显著正相关, 23S rDNA相对丰度与CH-α相对含量呈显著正相关(p＜0.05), tcpA相对丰度与CH₃、CH、CHO/N、H_Ar和H_p呈显著负相关(p＜0.05).已有文献也证明细菌的丰度和活性与不饱和有机组分呈负相关, 而与更多的脂肪族组分(H/C>1)呈正相关(Kamjunke et al., 2019).上述研究结果表明, 雨季清河和沙河水样的DOM以CHO/N和CH-α基团为主, 而地理环境相对封闭的沙河中DOM更利于结合如含有gltA、23S rDNA基因的致病菌等, 增加其在环境中迁移转化的风险.综上所述, 应加强雨季再生水补给河流DOM的有效控制和去除, 以减少对环境污染物如致病菌的迁移转化.
为了进一步研究DOM对再生水中致病菌丰度的潜在影响, 进行了致病菌基因相对丰度与有机质特征组分的Spearman相关性分析.基于¹H-NMR积分定量的6个有效特征组分, 旱季清河和沙河水样中致病菌基因与有机质组分相关性较弱, 清河表现为H_Ar(δ=H：7.0~10.0 ppm)与gltA和ecfX相对丰度呈负相关(p＜0.05), 沙河DOM中CH-α(δ_=H：3.2~4.5 ppm)组分与ecfX相对丰度呈正相关, 与23S rDNA相对丰度呈负相关(p＜0.05).但由于旱季清河和沙河水样的H_Ar和CH-α相对开链脂肪族基团含量较低, 因此, 具有H_Ar和/或CH-α特征组分的DOM不易于吸附致病菌而造成其远距离迁移或积累于沉积物中.雨季相关性分析结果显示, 清河水样的有机物特征组分未发现具有相关性, 这可能是由于汛期降雨显著提高了河流流速, 而清河的地理环境相对开放从而不利于致病菌的富集.但沙河表现出相关性较强, 相关性分析结果表明, gltA相对丰度与CH₃、CH、CHO/N、H_Ar和H_p呈显著正相关, 23S rDNA相对丰度与CH-α相对含量呈显著正相关(p＜0.05), tcpA相对丰度与CH₃、CH、CHO/N、H_Ar和H_p呈显著负相关(p＜0.05).已有文献也证明细菌的丰度和活性与不饱和有机组分呈负相关, 而与更多的脂肪族组分(H/C>1)呈正相关(Kamjunke et al., 2019).上述研究结果表明, 雨季清河和沙河水样的DOM以CHO/N和CH-α基团为主, 而地理环境相对封闭的沙河中DOM更利于结合如含有gltA、23S rDNA基因的致病菌等, 增加其在环境中迁移转化的风险.综上所述, 应加强雨季再生水补给河流DOM的有效控制和去除, 以减少对环境污染物如致病菌的迁移转化.
图 6(Fig. 6)

图 6 清河和沙河水库的致病菌相对丰度与有机质特征组分相关性分析 Fig. 6Correlations of relative abundance of pathogen of reclaimed water in Qing River and Sha River with spectral characteristic of six components

4 结论(Conclusions)1) 三维荧光光谱和PARAFAC分析结果表明, 清河和沙河水样中DOM分别为5个和4个荧光组分, 且干湿季均未有新组分产生.清河和沙河再生水出水口及其上下游河道水样中DOM以微生物代谢产物、蛋白质类有机物为主.光谱指数分析结果表明, 清河和沙河的DOM以自生源为主, 而微生物活性较高, 腐殖化程度较低.降雨对沙河DOM组分具有较大的干扰, 有腐殖酸类物质的输入.
2) ¹H-NMR分析结果表明, 在旱季, 清河和沙河水样的DOM以非功能性脂肪族基团为主, 且上游DOM比下游更为丰富；在雨季, 受降雨影响, 清河和沙河水样的DOM在α位置上的羧基或芳香环中碳连接的质子基团转化为优势组分.
3) 在旱季, 清河和沙河水样中DOM特征组分与致病菌基因(ecfX、mcr1、gltA、tcpA和23S rDNA)相对丰度的相关性较弱.在雨季, 降雨对相对封闭的沙河水库DOM影响较为明显, gltA和23S rDNA与DOM各组分相关性较强.因此, 应加强雨季再生水补给河流DOM的有效控制和去除, 以减少致病菌传播的风险.

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