, 耿金菊
, 沈国宸, 任洪强南京大学环境学院, 污染控制与资源化研究国家重点实验室, 南京 210023
收稿日期: 2020-03-12; 修回日期: 2020-04-13; 录用日期: 2020-04-13
基金项目: 江苏省自然科学基金（No.BK20180010）；国家自然科学基金（No.21677071，51978327）
作者简介: 吴刚(1992-), 男, E-mail:wugang19920513@126.com
通讯作者（责任作者）: 耿金菊, E-mail:jjgeng@nju.edu.cn
摘要：非甾体抗炎药（Nonsteroidal anti-inflammatory pharmaceuticals，NSAIDs）是污水中高频检出的新兴污染物.污水处理厂对其去除效果不佳，出水中的NSAIDs会对水生生态系统造成潜在不利影响.移动床生物膜反应器（Moving bed biofilm reactors，MBBRs）是一种去除污水中新兴污染物极有潜力的生物处理技术.MBBRs中填料的比表面积对NSAIDs去除影响较大.本研究选用3组不同比表面积的填料（S填料：460 m2·m-3，M填料：800 m2·m-3，L填料：1200 m2·m-3），采用实验室规模的MBBRs运行150 d去除环境浓度（50 μg·L-1）的NSAIDs—双氯芬酸（Diclofenac，DCF）、萘普生（Naproxen，NPX）和布洛芬（Ibuprofen，IBP），考察了填料比表面积对MBBRs中NSAIDs去除的影响及其潜在的影响机制.结果表明，填料的比表面积对NPX、IBP的去除具有显著影响（p < 0.05），对DCF去除效果影响不明显.S、L填料有利于提高生物膜的活性（ATP浓度和脱氢酶活性），而ATP浓度和脱氢酶活性与NPX和IBP的去除呈正相关.门水平上的变形菌门及属水平上的Steroidobacter、Acinetobacter的相对丰度随比表面积增加而提高，且变形菌门及Steroidobacter、Acinetobacter的相对分度与NPX、IBP去除规律一致.本研究揭示了MBBRs中填料比表面积通过影响微生物活性及群落结构从而影响NSAIDs去除的潜在机制，为MBBRs对新兴污染物的去除提供了参考.
关键词：非甾体抗炎药移动床生物膜反应器填料比表面积去除
Effect of specific surface area of biofilm carriers on the removal of nonsteroidal anti-inflammatory pharmaceuticals in moving bed biofilm reactors
WU Gang
, GENG Jinju, SHEN Guochen, REN HongqiangState Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, School of the Environment, Nanjing University, Nanjing 210023
Received 12 March 2020; received in revised from 13 April 2020; accepted 13 April 2020
Abstract: Nonsteroidal anti-inflammatory pharmaceuticals (NSAIDs), as a kind of emerging contaminants, were detected frequently in wastewater. NSAIDs cannot be removed efficiently during wastewater treatment process, and the remains of NSAIDs in effluent would cause ecosystem risks toward downside water bodies. Moving bed biofilm reactors (MBBRs) are a promising technology to remove emerging contaminants in wastewater. The specific surface area of biofilm carriers could affect the removal of contaminants in MBBRs. To investigate the effects of specific surface area of biofilm carriers on NSAIDs removal, three laboratory scale MBBRs filled with different specific surface area of biofilm carriers (S carrier: 460 m2·m-3, M carrier: 800 m2·m-3 and L carrier: 1200 m2·m-3) were carried out to remove three NSAIDs-diclofenac (DCF), naproxen (NPX) and ibuprofen (IBP) at the influent concentration of 50 μg·L-1. The removal of three NSAIDs, biofilm characteristics, microorganism activity and microbial community in MBBRs was investigated. Results indicated that the specific surface area of biofilm carriers significantly affected the removal of NPX and IBP, while not enough to affect the removal of DCF. S and L carrier was beneficial to the enhancement of bioactivity according to the analysis of ATP concentration and TTC-DHA activity. The removal of NPX correlated positively with both the ATP concentration and the TTC-DHA activity. The relative abundance of both Proteobacteria at phyla level and Steroidobacter and Acinetobacter at genus level correlated positively with the specific surface area of biofilm carriers. Proteobacteria, Steroidobacter and Acinetobacter may contribute to the removal of NPX and IBP. Present study revealed that the specific surface area of biofilm carriers affected the NSAIDs removal through altering the microorganism activity and community, which provides insights into the removal of emerging contaminants in MBBRs.
Keywords: nonsteroidal anti-inflammatory pharmaceuticalsMBBRsbiofilm carriersspecific surface arearemoval
1 引言(Introduction)非甾体抗炎药(Non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)是一类广受关注的新兴污染物, 其中, 双氯芬酸(Diclofenac, DCF)、布洛芬(Ibuprofen, IBP)、萘普生(Naproxen, NPX)使用最频繁.有研究表明, 3种NSAIDs在污水中的检出浓度为ng·L-1~μg·L-1级别(Verlicchi et al., 2012；Liu et al., 2017；沈国宸等, 2019), 这可能会对生态环境及人体健康造成不利影响(Stuer-Lauridsen et al., 2000；Oaks et al., 2004；张春秋等, 2019).污水处理厂(Wastewater treatment plants, WWTPs)是消除NSAIDs对下游水体不利影响的关键设施.然而, 现有的WWTPs对NSAIDs等新兴污染物的去除效果不佳(Ashfaq et al., 2017).因此, 应该采取适当的措施提高NSAIDs在WWTPs中的去除.
移动床生物膜反应器(Moving bed biofilm reactors, MBBRs)因其灵活性、紧凑性和性能稳定性而受到广泛关注.有研究表明, MBBRs在去除包括NSAIDs在内的新兴污染物方面效果良好(Falas et al., 2012).Falas等(2013)研究了MBBRs对7种药物的去除, 发现MBBRs对DCF的去除效果较活性污泥好3倍.Tang等(2017)发现DCF和NPX在MBBRs中的半衰期显著低于活性污泥中的半衰期.然而, 尽管MBBRs对NSAIDs去除效果较好, 经MBBRs处理后残留的NSAIDs仍有一定生态毒性(Falas et al., 2018).因此, 进一步提高NSAIDs的去除是削减其生态风险的可行措施.
生物膜填料是MBBRs的重要组成部分, 它可以影响MBBRs中污染物的去除.研究表明, 生物膜的生长在较大程度上取决于生物膜的固-液界面间营养物的质量传质(Young et al., 2016).生物膜填料类型影响营养物及溶解氧(DO)等的传质(Horn et al., 1995), 传质的差异将进一步导致生物膜形态如生物膜厚度、生物膜密度、生物膜孔结构等的差异.这在一定程度上会影响附着在填料上的微生物的生理生化活性和群落结构(Liu et al., 2018).例如, 较薄的生物膜有利于硝化过程, 而生物膜厚度与膜上微生物的多样性呈正相关(Torresi et al., 2016).研究表明, 生物膜填料比表面积作为一种可调控的填料参数, 可以影响污水中氮的去除(Liu et al., 2018).这表明填料比表面积可能作为提高MBBRs中NSAIDs去除的潜在操作参数.然而, 至今关于MBBRs填料比表面积对NSAIDs去除的影响研究较少.
基于此, 本研究运行了3组填充不同比表面积生物膜填料(S填料：460 m2·m-3、M填料：800 m2·m-3、L填料：1200 m2·m-3)的MBBRs(150 d).在反应器运行稳定阶段, 对不同MBBRs中NSAIDs去除、生物膜形态、微生物生理生化活性、微生物群落结构进行了研究.阐明填充不同比表面积填料的MBBRs对NSAIDs去除的差异, 揭示MBBRs中填料比表面积影响NSAIDs去除差异的潜在机制, 为更好的设计有利于NSAIDs去除的合适比表面积生物膜填料提供了指导.
2 材料和方法(Materials and methods)2.1 试验材料双氯芬酸钠(Diclofenac sodium salt)、NPX、IBP为分析纯(纯度≥98%), 购自美国Sigma公司.甲醇、氨水均为色谱纯, 购自德国Merck公司.其他常规化学试剂均为分析纯, 购自南京化学试剂有限公司.固相萃取小柱(HLB, 60 mg, 3 mL)购自上海安普公司.3种填料均为高密度聚乙烯材质, 高和直径规格分别为10 mm和25 mm, 亲水性指标接触角均为53°, 拉伸强度为35 MPa, 密度为0.95 g·cm-3.填料内部的小孔数分别为19个(S填料)、25个(M填料)、41个(L填料), 内部小孔数目不同使得填料的比表面积不同, 比表面积分别为：S填料(460 m2·m-3)、M填料(800 m2·m-3)、L填料(1200 m2·m-3).
实验室接种活性污泥取自南京市某市政污水处理厂, 该厂采用氧化沟生物处理工艺.在反应器接种前将活性污泥曝气24 h, 混合液悬浮固体为3200 mg·L-1, 污泥沉降指数(SVI)为110~120 mg·L-1.
2.2 反应装置及运行条件将S、M和L生物膜填料分别置于工作体积为7 L的圆柱形反应器中, 其填充比为25%.取曝气24 h的活性污泥于各反应器至6 L.反应器启动24 h后, 排去反应器中的活性污泥.反应器每天运行两个周期, 每个周期由进料(15 min)、反应(11.5 h)、排水(15 min)组成.利用曝气泵和转子流量计控制DO浓度为4.0~5.0 mg·L-1.通过添加适量的Na2CO3维持pH值为7.2~7.5.COD和营养物质去除稳定后(30 d), 添加NSAIDs至进水中使3组反应器中3种NSAIDs的初始浓度均为50 μg·L-1.
2.3 检测指标及方法COD、TN等基础指标的检测参照国标法(国家环境保护局, 2002), DO、pH的检测由溶氧仪(SG6, METTLER TOLEDO Inc., USA)和pH计(FE20, METTLER TOLEDO Inc., USA)完成.3种NSAIDs的样品前处理方法及液相色谱质谱检测方法参考Jiang等(2017)的方法.三磷酸腺苷(ATP)采用BacTiter-GloTM reagent试剂盒测定(Velten et al., 2007).脱氢酶活性(TTC-DHA)的测定方法参考Zhang等(2019)的方法.生物膜厚度及生物量的检测方法参照Wang等(2018)的方法.生物膜的电镜检测方法参照Yu等(2018)的方法, 即2.5%戊二醛溶液固定2~4 h, 用梯度浓度的乙醇溶液脱水(50%、70%、80%、95%), 冷冻干燥机冻干24 h, 对生物膜喷金进行电镜检测.
活性污泥微生物DNA使用Fast DNATM Spin Kit土壤试剂盒提取, 根据试剂盒的步骤提取污泥DNA.测定样品的浓度与纯度(260/280)后将DNA样品放置-80 ℃冰箱中保存.将DNA样品送至江苏中宜金大分析检测有限公司进行Illumina Miseq高通量测序和分析.使用Sickle软件来去除数据的低质量序列, 后通过Mothur程序进行降噪处理.降噪后的数据使用RDP classifier进行比对分析, 使用R语言来绘制热图.
2.4 数据分析所有样品至少分析3次, 结果以平均值表示.使用Origin 9.0软件对数据进行可视化.使用R语言对微生物属水平群落结构绘制热图.使用SPSS statistics 22.0对数据进行统计学方差分析(ANOVA), 当p＜0.05时, 认为样品间存在显著性差异.
3 结果与讨论(Results and discussion)3.1 MBBRs运行根据运行状态的稳定程度, 将反应器运行周期分为3个阶段.阶段1：启动阶段(1~30 d).阶段2：适应阶段(31~120 d).阶段3：稳定阶段(121~150 d).在稳定阶段, COD去除率为89%~92%.NH4+-N去除率为89%~93%, TN去除率为55%~61%.COD、NH4+-N和TN的去除效果表明反应器运行良好.
填料内部小孔数量的差异导致了填料比表面积的不同(图 1a), S、M及L填料的比表面积分别为460、800、1200 m2·m-3.生物膜形成阶段, 填充S、M及L填料的MBBRs中COD去除率分别为70%、75%、76%, NH4+-N去除效果分别为54%、56%、74%(第11 d).更大比表面积的填料(L)有利于生物膜形成阶段污染物的去除, 这是由于MBBRs中填料比表面积不同导致生物膜形成速度不同.生物膜形成过程主要分为4个阶段：大分子物质的粘附过程、细菌的粘附过程、生物膜发展过程、生物膜成熟过程(Huang et al., 2017).较大的比表面积填料会提供大分子及细菌更多的粘附位点, 有利于细菌在膜表面的生长, 快速形成更多的生物量, 从而有利于生物膜形成阶段COD及NH4+-N等污染物的去除.
图 1(Fig. 1)
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| 图 1 不同比表面积填料实物图(a); MBBRs运行稳定阶段生物膜的厚度(b)生物量(c)及不同比表面积填料上生物膜成熟阶段电镜图 (50 μm)(d)(*p＜0.05表示具有显著性差异) Fig. 1The picture of biofilm carriers of different specific area (a); the biofilm thickness during steady stage on different biofilm carrier (b) the biomass (c) and the SEM of biofilm during stable stage for bio-carriers of different specific area (50 μm) (d)(* p < 0.05) |
反应器运行稳定阶段, S、M和L填料上生物膜的厚度分别为(132±25)、(116±32)和(90±20) μm(图 1b).生物膜的厚度随着生物膜比表面积的增加而减小.S、M和L填料上的生物量分别为(12.46±0.20)、(9.77±0.10)和(4.77±0.30)g·m-2(图 1c).不同填料上生物量的显著性差异表明, 更大的比表面积(L)抑制了填料上微生物的附着.这可能是由于较大比表面积的填料具有较小的填料内部孔体积, 不利于DO及营养物质的传质, 从而不利于微生物的大量生长(Li et al., 2016; Torresi et al., 2016).另外, 由不同填料上的生物膜成熟阶段电镜图(图 1d)可以看出, S填料上生物膜较其他两组填料上的生物膜更加密实.这与填料上生物膜厚度及生物量的分布特征结果一致.
3.2 填料比表面积对NSAIDs去除影响填充S、M和L填料的MBBRs中, DCF的去除率为34.2%~46.3%, NPX的去除率为67.5%~74.7%, IBP的去除率为70.3%~76.0%.去除率结果表明, 不同填料上的生物膜对DCF的生物降解效果较差, 对NPX和IBP去除效果较好.填充S、M、L填料的MBBRs中的总体生物量分别为8.62、11.31、8.47 g.这与NSAIDs在3个MBBRs中的去除率规律类似, 表明反应器中的生物量对整体去除率起积极作用.通过计算单位生物量的NSAIDs去除速率常数(kbio, L·g-1·d-1)来比较3种填料附着生物膜对NSAIDs去除效果的影响.如图 2所示, S、M和L填料上的生物膜对NPX和IBP的kbio显著高于DCF的kbio, 这与DCF在3个MBBRs中去除率较低的结果一致, 进一步证实了3种填料上的生物膜对DCF的生物降解能力有限.之前的研究表明, DCF作为一种难降解的新兴污染物, 其结构性质使其难以生物转化.DCF分子结构中含有两个氯原子, 一般苯环上连接氯原子的化合物会使得该分子生物降解性能较差(Tran et al., 2017).如Liu等(2017)调研了中国12座市政污水处理厂发现DCF的去除率为20%±30%, Lu等(2019)通过逐步驯化室内反应器发现DCF的去除率低于45%.鉴于DCF在3种填料的MBBRs中生物降解效果均较差, 且与NPX和IBP的去除规律不一致, 后述填料比表面积对NSAIDs去除影响的分析中, 对DCF不进行讨论.对于NPX、IBP在MBBRs中的去除, S填料和L填料中NPX和IBP的kbio显著高于M填料中两种NSAIDs的kbio, 其中L填料上NPX及IBP的kbio较大, 这表明L填料上的微生物对NPX和IBP去除能力更强.
图 2(Fig. 2)
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| 图 2 不同比表面积填料的MBBRs运行稳定阶段NSAIDs的单位生物量去除数率常数 Fig. 2The biomass-normalized removal rate constants in MBBRs filled with different biofilm carriers during the steady stage |
3.3 填料比表面积对NSAIDs去除效果影响机制3.3.1 微生物活性ATP是微生物在生长代谢过程中能量储存的指示物(Efremenko et al., 2005).TTC-DHA在微生物以脱氢的方式降解污染物的过程中起重要作用, 并指示了微生物的生长代谢状况(Burdock et al., 2011).为了探究不同比表面积填料对NSADIs去除差异的原因, 测定了S、M及L填料上生物膜成熟阶段的微生物活性指标ATP及TTC-DHA.如图 3所示, S、M和L填料上生物膜的ATP浓度分别为(35.70±2.30)、(32.30±1.80)和(44.80±4.10)μg·g-1.L填料上生物膜的ATP浓度显著高于(p < 0.05)M填料上生物膜的ATP浓度.S、M和L填料上生物膜的TTC-DHA分别为90.71、67.58和98.0 mg·g-1·h-1.S和L填料上生物膜的TTC-DHA显著高于M填料生物膜上的TTC-DHA.进一步分析不同填料上微生物活性指标和NPX、IBP去除的关系, 发现NPX、IBP的去除和ATP浓度及TTC-DHA活性变化规律一致, 其中TTC-DHA与NPX和IBP的单位生物量去除速率常数呈显著正相关(p ＜ 0.05).这表明微生物活性是影响NPX和IBP在不同比表面积填料上去除性能差异的潜在机制.
图 3(Fig. 3)
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| 图 3 不同比表面积填料的MBBRs运行稳定阶段ATP浓度(a)及TTC-DHA活性(b)(p＜0.05表示具有显著性差异) Fig. 3ATP concentrations of microorganism in MBBRs filled with different biofilm carriers during the steady stage(a) and TTC-DHA (b) |
本研究中, 不同比表面积的填料通过影响微生物的活性从而进一步影响了NPX和IBP的去除.填料比表面积影响生物活性方面, 有研究表明, 更厚的生物膜一般具有更显著的层理特征, 这限制了内层微生物对DO及营养物质的获取, 从而对生物活性产生不利影响(Torresi et al., 2016; Torresi et al., 2017).如Ni等(2008)利用数学模型模拟了生物膜不同厚度处的DO浓度, 发现生物膜内部的DO浓度随着膜厚度的增加急剧下降.Torresi等(2016)指出, 更厚的生物膜限制了内部微生物对营养物质的获取, 这会使得硝化细菌等微生物的活性降低.本研究中, M填料上的生物膜较L填料更厚, 这使得其生物活性(ATP浓度、TTC-DHA)显著低于L填料上的微生物活性.另外, 更小的填料内部小孔体积对物质的传质产生不利影响(Li et al., 2016; Torresi et al., 2016).这些不同比表面积填料生物膜的形态特征及生物量的差异使S及L填料上生物膜活性较高.研究表明, 生物废水处理系统中微生物的活性对污染物去除起至关重要的作用(Burdock et al., 2011).Bordel等(2006)指出, 在纯菌降解污染物的体系中, 甲苯的去除与ATP浓度呈显著正相关.在木质素废水处理系统中, ATP及TTC-DHA的活性增强对木质素的去除效果起到积极作用(Zhang et al., 2019).对于酚类污染物的去除, 当微生物活性较高时, 其去除效果也更好(Fang et al., 1996).这表明, 微生物的生理生化活性对含有苯环的难降解污染物去除起到积极作用, 当前的研究中, 3种NSAIDs均具有苯环结构, 因此MBBRs中微生物活性可以影响NPX和IBP的去除.
3.3.2 微生物群落结构污水处理系统中, 污染物的去除一般由多种功能不同的微生物共同完成, 微生物群落结构对污染物的去除起至关重要的作用.为了探究不同比表面积填料对NSAIDs去除差异的潜在机制, 分析了S、M及L填料上生物膜的微生物群落结构.门水平上(图 4a), Proteobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria是3种填料上生物膜的优势菌.随着填料比表面积的提高, Bacteroidetes的相对丰度从5.70%提高到13.23%.这是由于生物膜填料比表面积差异所导致.Wang等(2018)指出, Bacteroidetes在生物膜密度较大的生物膜中丰度更高.在本研究中, 填料内部的空间体积随着填料比表面积的提高而减小, 这导致比表面积大的填料上生长的生物膜更加密实, 这一结果也可以从电镜结果中得到验证(图 1d).比较NSAIDs的去除效果数据可以发现, Proteobacteria的相对丰度与NPX、IBP在3个MBBRs中的去除正相关.这表明Proteobacteria对NPX和IBP的去除起积极作用.Proteobacteria作为污水处理系统中常见的微生物, 具有降解多种污染物的能力(Ferrera et al., 2016; Li et al., 2018).Davids等(2017)指出, 在暴露IBP的生物反应器中, Proteobacteria相对丰度随着IBP暴露浓度的提高而上升.Zhao等(2015)研究了好氧颗粒污泥对药品及个人护理品的去除, 发现Proteobacteri相对丰度与药品及个人护理品的去除呈正相关.这些结果表明, NPX和IBP的去除可能和生物膜中相对丰度较高的微生物正相关, 如Proteobacteria.这与NPX和IBP的去除速率常数与ATP浓度和TTC-DHA这种代表普遍程度上的生物活性指标正相关的结果一致.
图 4(Fig. 4)
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| 图 4 不同比表面积的填料的MBBRs运行稳定阶段微生物群落结构 (a.门水平, b.属水平)(相对丰度＞0.25%) Fig. 4Microbial community in MBBRs filled with different biofilm carriers during the steady stage (a. phyla level, b. genus level) (abundance >0.25%) |
属水平上(图 4b), S、M和L填料的生物膜上, 相对丰度较高的微生物包括Pseudomonas(0.89%、1.11%、0.83%)、Acinetobacter(1.87%、1.36%、1.61%)、Lysobacter(1.53%、1.86%、0.17%)、Bosea(0.31%、0.08%、0.08%)、Zoogloea(3.37%、4.55%、21.84%)、Chlorobium(0.11%、11.31%、0.23%)和Geminicoccus(10.54%、0.13%、0.52%).对于NPX和IBP的去除, 对属水平中的微生物群落相对丰度和NPX、IBP去除间的关系分析可知, 变形菌门中的Steroidobacter和Acinetobacter在S和L填料上富集的量更多, 表明这两种微生物可能参与了NPX、IBP的去除.Kang等(2018)在研究抗生素废水生物处理时发现, Steroidobacter对芳香类的化合物如磺胺甲恶唑具有一定的去除效果, Acinetobacter具有降解磺胺甲恶唑的功能基因.Yang等(2014)指出Steroidobacter可能参与了土壤中双酚A的生物降解.Tao等(2019)的研究表明, Acinetobacter对阿特拉津去除效果良好.与上述报道的污染物类似, 本研究中的3种NSAIDs均为具有苯环结构的较难生物降解的外源化合物, 进一步证实了变形菌门参与了NPX和IBP的降解.
之前的研究中, 研究者们主要从NSADIs的降解产物、微生物活性及微生物群落结构等方面探讨了NSAIDs的生物降解机制.如Salgado等(2020)研究了Patulibacter medicamentivorans纯菌降解IBP途径, 发现了两条主要的降解途径.Murshid等(2019)从降解产物和微生物活性等角度探讨了Alcaligenes faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus and Proteus mirabilis组成的复合菌株对DCF的降解, 发现微生物活性对DCF的去除具有一定影响.Falas等(2018)从降解产物和功能菌株两方面探讨了DCF、NPX和IBP在生物膜中的降解机制, 发现NSAIDs的降解效果差异是由于某些具有降解效果的功能微生物差异所导致.本研究在此基础上, 从可能对NSAIDs去除效果具有影响的微生物生理生化活性及群落结构等指标入手, 探讨了不同比表面积填料的生物膜反应器中NSAIDs的去除差异, 揭示了填料比表面积可以通过影响微生物的生理生化活性和群落结构进而影响NSAIDs去除这一潜在机制.
4 结论(Conclusions)本研究通过考察MBBRs中填料比表面积(S填料：460 m2·m-3, M填料：800 m2·m-3, L填料：1200 m2·m-3)对NSAIDs去除的影响, 发现填料比表面积对NPX、IBP去除效果影响较大, 对DCF去除影响不明显.填料比表面积是通过影响微生物活性及微生物群落结构来影响NSAIDs的去除.不同比表面积填料的MBBRs中NPX、IBP去除率与微生物活性指标ATP浓度和TTC-DHA活性正相关, 变形菌门中Steroidobacter和Acinetobacter的相对丰度与NPX、IBP去除规律一致.研究表明, L填料有利于MBBRs对NPX和IBP的去除.
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