, 任宏宇, 曹广丽, 孟佳, 刘冰峰
哈尔滨工业大学环境学院, 城市水资源与水环境国家重点实验室, 哈尔滨 150090
收稿日期: 2020-09-01; 修回日期: 2020-09-15; 录用日期: 2020-09-15
基金项目: 国家重点研发计划(No.2019YFD1100300);城市水资源与环境国家重点实验室(哈尔滨工业大学)项目(No.2020DX06)
作者简介: 温汉泉(1991-), 男, 博士, E-mail:wenhanquanhit@163.com
通讯作者（责任作者）: 刘冰峰(1981—), 男, 教授, 博士生导师, 主要研究方向为：废水处理与生物能源化. E-mail:lbf@hit.edu.cn
摘要：21世纪被誉为氢能世纪.光发酵制氢作为绿色可持续生物制氢方式的一种，可以利用独特的光合系统固定太阳能，并利用有机物产生清洁能源氢气，因而受到广泛关注.但光发酵细菌凝集力差、底物转化效率和光能利用率低导致产氢效能下降，从而阻碍了光发酵制氢的发展.光发酵细菌可以通过形成生物膜而被有效固定，进而增加反应器内光发酵细菌的生物持有量，提高光发酵细菌对不利环境的抵抗力；同时，光发酵细菌形成生物膜后可以调控产氢细菌新陈代谢和生理活性使其更利于产氢.其中，光发酵生物膜反应器的设计尤为重要，尤其是反应器内光源的均匀分配对于光发酵制氢是一项关键因素，需要对光源设计、空间摆放和遮光性进行综合分析和设计；其次，需要考虑载体性质和载体安装以充分吸附光发酵细菌并形成生物膜；同时，结合未来可持续绿色发展的需求，光发酵生物膜反应器设计需要逐步过渡到以室外环境作为常规环境和太阳作为光源.尽管光发酵生物膜制氢前景良好，但目前对于光发酵生物膜反应器和制氢机制的研究仍然不够充分，需要更加深入地探索和优化以突破光发酵制氢的瓶颈，推动氢能行业的发展.
关键词：光发酵制氢生物膜反应器设计胞外聚合物
Research status and prospect of photo-fermentative hydrogen production with biofilm formation
WEN Hanquan
, REN Hongyu, CAO Guangli, MENG Jia, LIU BingfengState Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, School of Environment, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090
Received 1 September 2020; received in revised from 15 September 2020; accepted 15 September 2020
Abstract: Twenty-first century will be the century of hydrogen energy. Photo-fermentative hydrogen production is one green and sustainable alternative for biological hydrogen production. It can fix solar energy, degrade organic matters and generate hydrogen via the unique photosystem, thus it draws amounts of attention. However, development of photo-fermentative hydrogen production is facing the bottleneck because of the low hydrogen production and light utilization efficiency due to the poor flocculation and substrate utilization ability. Biofilm can stimulate the photo-fermentative hydrogen production through the increased biomass due to the fixation. Besides, biofilm could regulate photo-fermentative bacteria in reactor to possess better hydrogen production ability and higher resistance to unbenefited environment. At the same time, design of photo-fermentative biofilm reactor requires special consideration. Firstly, the uniform distribution of light in the reactor is a key factor for photo-fermentative hydrogen production. Therefore, light source, space distribution and shading need to be considered comprehensively. Then the carrier properties and the introduction of carrier should support absorption of bacteria and biofilm formation. Last, basing on the sustainable green development in the future, photo-fermentative biofilm reactors need to be designed for outdoor environment with sun as the light source. Although photo-fermentative biofilm expresses superior properties for hydrogen production, the referenced research on inner mechanism is still sparse. Further researches are needed to break through the bottleneck of photo-fermentative hydrogen production and promote the development of hydrogen energy industry in China.
Keywords: photo-fermentative hydrogen productionbiofilmreactor designextracellular polymeric substances
1 引言(Introduction)能源是社会发展的基石, 其中, 氢能作为一种绿色可再生能源受到广泛关注.氢气的燃烧产物为水, 燃烧热值高(122 kJ · g-1), 且自身的强还原性使其具有极高的工业价值(张锐, 2020).氢能作为未来社会的主要能源形式, 以此开展的能源革命也必将带来重大的社会改变(Armor, 1999, 张全国等, 2006).目前, 氢能逐渐成为世界能源体系的重要组成部分, 国际能源署(IEA)在2019年6月提出“将会逐步提升氢气地位并取代天然气参与国际贸易”(IEA, 2019), 国际氢能委员会认为2050年氢能将占据全球能源的20%, 届时将涉及3000万工作岗位和2.5万亿美元的市场份额.
目前, 世界各国对氢能的关注持续上升.例如, 美国一直十分重视氢能的开发与利用, 早于20世纪70年代就提出“氢经济”的概念, 之后随着石油危机的爆发和环境污染的加剧, 氢能在美国能源结构中的比例逐步上升, 2001年《为美国未来提供可靠、可负担得起、环境友好型能源(Reliable, Affordable, and Environmentally Sound Energy for America′s Future)》一书提出氢能是“未来能源的供给源”, 2002年发布了《国家氢能发展路线图》(A Plan For Action).此后, 美国各届政府都对氢能行业的研究与利用提供了大量支持(王彦雨等, 2015).欧盟则是制定了长期氢能与燃料电池发展计划, 将氢能视为维系经济繁荣的必要手段并拟投资近10亿欧元.日本更是将氢能与燃料技术上升到国家战略层面, 确立了氢能产业发展路线图, 并制定了到2040年的三阶段发展战略(毛宗强, 2016).
我国当前也正逐渐加强对氢能的利用与开发.虽然我国氢能产业起步较晚, 但发展迅速, 尤其是近几年, 从中央到地方对氢能的认可和投入持续上升.2016年, 中国能源局在《能源技术革命创新行动计划(2016-2030年)》正式下达了“氢能与燃料电池技术创新”任务；2018年, 成立了中国氢能联盟, 实现跨学科、跨专业、跨部门的人才筹备和资源整合以推动我国氢能行业发展；2019年, 在《2019年国务院政府工作报告》中明确指出“推进充电、加氢等设施建设”；2020年, 中国国家能源局于4月10日发布的《中华人民共和国能源法(征求意见稿)》中, 第一次从法律层面上将氢能被列为能源范畴.预计到2050年, 氢能可占据我国终端能源体系的10%~15%, 并将带来几十万亿产值的新兴产业, 因此, 人们认为21世纪将会是一个氢能世纪(干勇, 2020).
尽管氢能行业已成为热门能源领域, 但当前的氢能行业发展仍受制于氢气的获得方式.现阶段氢能按照能源获取方式分为：依靠石油、煤炭化工生产过程中制得的“灰氢”；石油、天然气制备过程中捕获二氧化碳排放进行碳中和的“蓝氢”；利用风能、太阳能、生物质能等可再生能源生产的“绿氢”.其中, 带来环境污染最小并可持续发展的“绿氢”是未来氢能发展方向(孙程, 2020).
2 生物制氢(Biological hydrogen production)在绿氢中, 生物制氢反应条件温和、生物质能来源广泛、产氢效能稳定、对环境友好, 是未来氢能生产的重要方式(Boodhun et al., 2017).生物制氢是依赖微生物自身新陈代谢活动将太阳能或储存于有机物中的化学能转化为氢能的生物技术(Wang et al., 2019).生物制氢按照微生物种类和制氢条件一般分为光解水制氢(Mona et al., 2020)、光发酵(Ren et al., 2009)、暗发酵(Guo et al., 2009)和暗光耦合发酵(Liu et al., 2010).其中, 光解水制氢依靠微藻裂解水产生氢气, 虽然方式最为简洁, 但微藻产氢过程中产生的氧气会对产氢酶产生极大的抑制, 导致光解水制氢效能不高；暗发酵制氢可处理高浓度有机废水并具有高的产氢速率, 但暗发酵细菌存在代谢障碍, 对底物降解不彻底, 会产生大量的小分子有机酸类物质, 形成反馈抑制, 同时产氢纯度低, 需要后续产物处理过程和氢气纯化.与其他类型产氢相比, 光发酵制氢适应范围广, 环境抵抗力强, 可以利用宽泛的光谱；产氢过程中无副产物氧气的产生, 避免了氧气抑制；作用底物范围广泛, 能利用多种小分子有机酸；产物为二氧化碳和氢气, 产氢纯度高；理论产氢率接近100%；生物质利用充分, 排出液几乎无污染.光发酵制氢可将氢能产生、太阳能利用和污染物治理同步结合, 被认为是最具潜力的制氢方式之一(Chen et al., 2011, Zhang et al., 2018).
但相比于高等植物3%~4%的太阳能转化率, 由于光发酵细菌光合磷酸化中高的能量壁垒(Harwood et al., 2008), 导致光发酵细菌只有1%~5%的太阳能转化率(Nath et al., 2004).同时, 光发酵制氢pH耐受率低, 受水力条件影响严重, 使得光发酵制氢为了达到一定的产氢效能需要相当大的占地面积(Hallenbeck et al., 2002).这些缺点造成光发酵制氢技术反应条件要求高, 产氢效能和太阳能转化率低, 成为光发酵制氢的瓶颈.当前针对光发酵制氢可分为两个主要方向：①基于光发酵制氢内在机制以期突破光发酵制氢的内在缺点和劣势；②高效光发酵制氢反应器的开发.在高效光发酵制氢反应器中, 固定化是一种重要手段, 因为其可以提高反应器内生物量, 同时便于进行反应器设计以充分利用光能及进行生化反应.但随着研究的深入, 固定化除了利于高效光发酵制氢反应器的开发外, 也被发现可以调控光发酵制氢内部机制.
3 生物膜法光发酵制氢(Photo-fermentative hydrogen production with biofilm)3.1 光发酵细菌存在形态光发酵制氢的产氢主体是光发酵细菌, 其属于光合细菌中能够固定太阳能、以氢酶和固氮酶为主进行催化产氢的种类.而光合细菌是地球上出现最早、自然界中普遍存在、具有原始的光能系统的原核生物.光发酵细菌菌体粒径小、Zeta电位高, 在实际运行中多呈现悬浮态, 这可能与光发酵细菌便于利用光能有关, 虽然悬浮态有利于细菌充分利用光能和底物, 但在反应器实际运行中, 存在如下问题：悬浮态光发酵细菌对环境冲击的抵抗力弱, 承受进水负荷低；光发酵细菌易受水力剪切影响, 随出水损失严重, 使得反应器内生物浓度减小, 致使产氢速率降低；出水水质不达标, 运行过程中底物很大部分转化到菌体增殖而不是制造氢气, 造成了能源和物质损失；与此同时, 为了维持一定的反应速率, 需要扩大反应器体积, 从而增大了占地面积和运行成本.为了减少上述问题, 增强光发酵制氢能力, 实现工业化生产, 光发酵细菌的固定化成为一个良好的解决办法；同时, 固定化可以灵活调整细菌方向及空间位置, 以便充分利用太阳能, 便于能源分配(温汉泉, 2016).
对于光发酵细菌及所有微生物来说, 其通常具有两种存在形态：游离态(悬浮态)和固定态(生物膜态).前期对微生物的观察并没有刻意区分两者的区别, 而且对于细菌生长和性能主要基于游离态进行研究.但随着研究的深入, 生物膜被认为是微生物存在的主要且最符合微生物生长情况的模式, 也是能发挥微生物特定功能的存在形式, 而游离态主要发挥着细菌扩散和迁移功能(Costerton et al., 1995).尽管光发酵细菌菌体尺寸较小、Zeta电位高导致难以絮凝(Xie et al., 2015), 但生物膜作为微生物的主要存在方式之一, 光发酵细菌可以通过产生一定量的胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances, EPS), 从而经过一定的手段和时间仍然可以进入生物膜状态(Prachanurak et al., 2019；Wen et al., 2017).
3.2 光发酵细菌与生物膜生物膜是微生物群体在分泌的EPS的连接和支撑下, 形成的空间和功能上相互连接的、能够展现出一定群体特性的复合微生物群体.随着对生物膜研究的逐渐深入, 研究内容逐渐从单独微生物特性逐渐发展到以生物膜群体为主.随着对微生物生存形态尤其是生物膜态研究的逐渐深入, 观点从原来以为生物膜只是简单的机械和偶然堆积发展到后来发现生物膜是微生物特定识别及程序组建的微生物群体；从认为生物膜是微生物膜层状结构发展到认为生物膜是微生物及EPS有机构建, 呈复杂立体内涵水道、空穴的三维结构(Costerton et al., 2001)；从微生物是无意识只有基质和产物竞争的群体发展到认为生物膜是微生物有意识、特异性识别环境与自身生理生化特性的指挥群体(Fulsundar et al., 2015, McDermott et al., 2019)；从以游离态作为微生物主要存在形式发展到游离态是微生物生物膜态发展中迁徙的组成部分(Houot et al., 2008).生物膜是微生物能够表现出卓越群体智慧, 通过分子水平信息传递, 能够有意识地自我调控、调控环境以更好地生存和繁衍的常规生理生化状态.
EPS是构成生物膜的必要组分, 起到联结、支撑生物膜的重要作用, 并发挥屏障和保护的作用, 如阻碍或者降解毒性物质(如抗生素、溶解素)及螯合重金属等(Donlan et al., 2002).同时, 生物膜状态下菌体之间相互连接, 产生基因交换现象, 大大加速了微生物有利变异的积累速度(Wei et al., 2012).EPS按照成分可分为蛋白质、多糖、DNA、鞭毛、纤毛、腐殖质及复合物质如脂多糖、脂蛋白、糖蛋白等.随着研究的逐渐深入和手段的逐步升级, 针对EPS的理解越来越精准和定量化, 例如, 探究相关组分在生物膜功能发挥中的重要作用, 确定信息和能量传递的具体机制, 同时确定相关基因合成和调控流程的通路变化.EPS中的蛋白质作为生物活性大分子, 是生物膜实行大部分活性功能的主要中介, 发挥着识别、固定、调控、电子传递、防护等诸多重要功能.例如, R28蛋白(St?lhammar-Carlemalm et al., 2010)、Mus20(Espinosa-Urgel et al., 2000)、Espfm(Lund et al., 2003)、Lsp(Walter et al., 2005)分别与人、种子、真核、胃上皮细胞接触相关.一些蛋白质组分会影响和调控生物膜的形成, 如Bap(Cucarella et al., 2001)、Esp(Toledo-Arana et al., 2001)、LapA(Hinsa et al., 2010)、Yeej(Roux et al., 2005)等.部分特定结构蛋白质(Shimazaki et al., 2012)发挥着抑制甚至降解细菌生物膜的功效.蛋白质还可以作为中介调控细胞进程, 包括微生物特定功能的实现和发挥、增殖、变形及衰亡, 尤其是衰亡, 这一细胞程序性死亡可以释放营养物质及在生物膜内形成空穴, 帮助生物膜形成复杂三维富含通道的成熟结构.Cucarella等(2001)通过基因手段发现, Bap(Biofilm-associated protein)蛋白分布在多种细菌表面, 确定了其在生物膜形成中的重要作用.多糖作为结构性EPS的重要组分, 是大多数生物膜形成的重要基质(Guo et al., 2020).尽管多糖总量可能有所区别, 但多糖结构是影响生物膜态和悬浮态细菌EPS的重要因素(Felz et al., 2016).DNA也是EPS的一种重要组分, 因为其长链可提供架桥结构, 疏水基团可以相互缠绕及捕获其余菌体, 所以DNA也是生物膜的重要结构与组成部分.但同时有些DNA却有些特定结合位点, 反而会抑制生物膜形成, 使得生物膜分解(Berne et al., 2010).腐殖质、糖蛋白、脂多糖也起着重要的生物活性功能, 或作为物质贮存库, 或者分泌一些毒素、信号分子参与微生物生理活动等.同时, 也有研究发现EPS中还含有细胞色素、氧化还原辅因子等电子载体以帮助进行电子传递(Rittmann, 2018；Sun et al., 2020).
生物膜中分子水平机制研究已经确定了成膜关键蛋白(如Bap、Lap等), 确定了群体感应系统的调控性能, 如酰基高丝氨酸内酯及c-di-GMP对于同种及异种属微生物相关生理活动的调节.逐步发展的多样化EPS提取技术：物理技术如高温、超声、搅拌、阳离子交换树脂, 化学手段如酸、碱、甲酰胺处理, 生物法如酶处理等使得EPS提取越来越便捷迅速；针对EPS精确检测技术如CLSM、OCT、STORM、单分子拉曼光谱也不断发展和成熟, 此外, 还有生物膜商品化工具如微孔板法, 以及卡尔加里生物膜设备的出现, 使得生物膜研究越来越细致、精确, 生物膜模型和机理的研究也越来越细化与透彻.
Wen等(2017)使用Rhodopseudomonas sp. nov. strain A7作为实验菌株, 通过添加硅胶片作为载体以吸附光发酵细菌形成生物膜并进行批次产氢实验, 发现生物膜的形成可以极大地促进光发酵制氢效能(提升约75%).该研究中并没有使用载体形成生物膜达到固定细菌的目的, 主要是利用细菌形成生物膜后发挥特定功能并调节其余游离细菌的原理.在生物膜的影响下, 反应器中所有细菌(生物膜细菌和游离细菌)的蛋白通路发生了改变, 固氮酶产氢关键酶活性得到提升, 直接促进了光发酵产氢效能, 同时游离细菌光合系统活性下降, 能量传递系统和细胞运动系统活性上升, 这就使得光能在整体反应器内更加均匀地分配.除此之外, 受生物膜影响, EPS含量降低, 将底物和太阳能更多地从EPS合成转移到氢气生产中(Wen et al., 2020).光发酵细菌生物膜的出现利于光发酵制氢反应器整体效能的提升.减少EPS合成是一个重要的方向, 因为EPS可以占据微生物50%~80%的生物质, 所以微生物增殖的很大部分能量和还原力都被用于EPS合成上(Wu et al., 2020).尽管EPS是微生物的重要组成部分, 但减少EPS的合成可以节约能量和还原力, 部分研究利用乙醇减少EPS分泌从而提高了产氢效能(Kim et al., 2014).
但生物膜本身结构复杂和所处环境呈现不同特性的特点导致了生物膜研究结果出现众多复杂性.各种因素对生物膜均有影响, 如营养条件、pH、载体、水力条件、环境中的其余微生物等, 甚至初始边界条件都会影响和决定着最终生物膜的形式(Kanavillil et al., 2015).同时, 一般针对微生物生物膜机制研究时, 模式微生物几乎全是不具备光能系统的细菌、真菌等, 尽管生物膜的EPS中含有细胞色素、导电纤毛或其他氧化还原性物质帮助进行电子传递, 但针对具有光能系统的微生物生物膜的研究却鲜见报道.因此, 仍需进行大量的研究以解决光影响下的生物膜系统活性和代谢变化问题, 以便突破光发酵制氢的瓶颈, 推动生物制氢产业发展.
3.3 光发酵细菌成膜方式现阶段光发酵细菌的固定方法可分为包埋法(Song et al., 2011)、结合法和吸附法(Tekucheva et al., 2011；Tian et al., 2010), 这些固定方式基于固定光发酵细菌、减少光发酵细菌受水力条件影响等目的, 采用空间位阻(包埋)、表面作用力(结合法-化学吸附, 吸附法-物理吸附)等手段.其中, 只有采取物理吸附固定光发酵细菌并让细菌聚集成群体且自由生长的方式才是生物膜法.
包埋法是利用琼脂、海藻酸盐等半透性物质将菌体固定在反应器内部, 使得菌体与反应液分离, 构造较高的微生物浓度, 并能允许光照和小分子物质通过, 是一种主流的细胞固定方法.固定化可以大幅度减少微生物对底物的需求, 减少微生物增殖, 将微生物存活时间从10~20 d延长至60~80 d(Elkahlout et al., 2017; 2019), 极大地提高了反应器运行周期, 减少了运行成本.但材料和固定的细胞生物量遮光性需要考虑在内, 因为这两者产生的遮光效应会极大地降低光利用效率.同时, 包埋基质的存在会对大分子底物的进出产生阻碍, 限制细菌的增殖空间, 导致死亡菌体无法及时排出, 使微生物更新率近乎停止, 同时填料会对光照产生阻碍作用, 减少光能利用率.尽管包埋法可以延长菌体存活时间及运行周期, 但反应器微生物需要在菌体活性丧失时进行更换, 微生物不能随进水和运行需求改变微生物浓度, 减少了调控的灵活性和稳定性.
结合法原理介于包埋法和物理吸附法之间, 其一方面使用化学手段不可逆地结合微生物与载体表面, 微生物受水力剪切影响小；另一方面, 结合法使细菌固定在载体表面, 允许微生物与反应液充分结合, 便于反应物和产物的及时交换, 也减少了载体对于光照的遮蔽作用.但结合法操作复杂、反应激烈, 尽管结合法能够紧密固定微生物, 但固定总量小于包埋法, 同时不可逆固定手段往往会对微生物产氢主体造成损伤, 减少反应活性；另外, 尽管载体表面微生物能够充分与反应液接触, 但由于化学吸附的手段干扰和阻碍了微生物正常的新陈代谢活动, 新形成的微生物也会扩散到反应液内, 造成微生物随出水损失.
吸附法主要依靠微生物的自发生理活动, 微生物首先凭借水力条件的被动移动或者鞭毛纤毛的主动移动接触载体表面, 然后增加分泌胞外聚合物(EPS), 将菌体本身进行固定.吸附法是利用微生物自身的能力吸附到载体表面(Tsygankov et al., 2014), 反应条件温和, 载体表面微生物与反应液可以自由进行能量和物质交换, 不影响菌体对光的吸收利用；同时, 吸附法允许微生物进行增殖和菌体更新, 以适应不同条件下的反应和进水条件.相比于包埋法和结合法, 吸附法具有一个最重要的优点, 就是载体表面能够自由生长并形成生物膜, 从而表现和拥有生物膜的独特调控性能, 对反应器整体产氢活性进行调控, 这是高效产氢的最佳途径之一(Guo et al., 2011).但吸附法反应较慢, 表面微生物容易受水力剪切条件影响发生脱落, 造成菌体随出水损失和物质能量浪费.因此, 如何快速吸附光发酵细菌并形成生物膜已经成为一个关键性的科学问题.加强成膜可以从两方面进行优化：①对载体进行优化.根据Xie等(2012a)的研究, 通过采用一种活性炭纤维作为流体化固体载体固定化R. faecalis RLD-53, 氢气产率在最优条件下可以达到3.08 mol · mol-1乙酸；在接下来的研究中, Xie等(2012b)利用不同浓度硝酸氧化改性活性炭纤维, 并发现合适的处理手段可以大幅度提高表面粗糙度和改变官能团从而增强细菌粘附能力, 进而使得光发酵过程可以在低水力停留时间和高有机负载率下进行.Zagrodnikd等(2013)使用三甲氧基硅烷进行改性从而在多孔玻璃表面引入胺基并增强了细菌在多孔玻璃载体固定量.而Tsygankov等(1994)通过硅烷偶联剂对玻璃表面进行正电荷修饰以吸附带负电荷的光合细菌从而增强了固定效果.②对投加后的运行条件进行调控, 研究了光波长、光照强度、温度、pH和底物浓度对投加载体吸附光发酵细菌成膜和反应器运行的影响.Tian等(2010)发现进水葡萄糖浓度为0.12 mol · L-1时产氢率最好, 当浓度大于0.12 mol · L-1时, 会产生底物抑制.此外, 不合适的水力条件如SRT、HRT和搅拌速率等会使得生物膜受到损伤并产生脱落, 极大地抑制了产氢性能(Wu et al., 2007；Zhang et al., 2008).
固定化技术不仅保障和提高了光发酵技术的产氢效能, 同时固定化尤其是生物膜能够极大地提高光发酵细菌对不利环境和理化变化的耐受性(Tiang et al., 2020)(表 1).Zagrodnik等(2015)证实了提供多孔玻璃板作为载体形成生物膜后, Rhodobacter sphaeroides O.U.001产氢效能提高了1倍左右.Wen等(2019b)发现添加载体后, 生物膜的形成能够减少光发酵细菌对于营养元素L-半胱氨酸的需求浓度, 同时大幅度提高产氢性能.Zhu等(1999)观察到即使存在铵离子这一极大抑制固氮酶活性的不利因素时, 固定化仍然能够稳定和提高产氢率.因此, 固定化技术可以保障光发酵制氢技术与其他技术的耦合, 如光暗发酵、微藻-光发酵耦合.
表 1(Table 1)
| 表 1 固定化对光发酵细菌氢气产率的提升(Wen et al., 2017) Table 1 The improvement of hydrogen yield by immobilization | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 1 固定化对光发酵细菌氢气产率的提升(Wen et al., 2017) Table 1 The improvement of hydrogen yield by immobilization
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4 光发酵生物膜反应设计(Design of photo-fermentative hydrogen production biofilm reactor)吸附法的固定方式主要是为了形成致密生物膜以固定细菌, 因此, 吸附法和生物膜的相关机制一致.但现阶段对于吸附法固定和生物膜法的研究并没有统一, 两种方法分别从手段和微生物存在形式的角度进行研究, 这里将两者进行合并整理.对于吸附法反应器/生物膜反应器, 主要是进行载体改性、反应器和光源设计, 以便增强反应器内生物膜持有量, 提高细菌对不利条件的抵抗力, 使光发酵细菌充分地利用底物、光能及进行氢气收集, 达到提高产氢性能和利用率的目的.这些研究都默认了生物膜有利于光发酵制氢的实现(Guevara-López et al., 2015), 却对生物膜调控机理讨论较少, 尤其是光发酵制氢这一涉及光能系统的生物膜形成及其机制研究更加少见.
4.1 光发酵制氢与光源设计光强是影响光发酵制氢的最重要因素之一, 因为光发酵制氢的能量来源和电子驱动均来自于太阳能的固定, 光是光磷酸化电子传递的唯一能量来源.因此, 光发酵制氢过程和相关反应器都要依据光能分布进行设计, 以达到最好的光能利用.光发酵菌种和反应条件的不同使得光发酵制氢对光强需求不一致, 最佳光照强度从2500~8000 lx不等(Akroum-Amrouche et al., 2011; Androga et al., 2014; Assawamongkholsiri et al., 2015).搅拌速率、溶液、其他生物质干扰会阻碍光的传递, 导致光发酵要求更高的光照强度(Androga et al., 2012；Laurinavichene et al., 2018).但室外太阳光强度可达到60000~100000 lx, 在常规运行过程中, 光发酵细菌一般处于过度光照条件下, 此时细菌会产生一定的氧化态物质, 反而会极大地抑制产氢性能.同时, 光发酵细菌光合色素会导致菌体本体对光的吸收, 使得反应器内整体光照分布不均, 光照吸收下降, 所以也有研究证明通过减少光合色素的合成以便进行光照的分配(Chao et al., 2012a; 2012b;Ding et al., 2016).提高光照强度和减少光合细菌色素合成并不矛盾, 其共同目的是为了增强深层光合细菌对光照的吸收, 即光照的均匀分配, 提高光能利用率, 减少部分细菌的光过饱和现象.
光发酵细菌的固定会带来额外的遮蔽情况, 这就往往要求固定化后的光发酵制氢需要更高的光照强度和更全面的光照覆盖, 也就对光发酵制氢光源和反应器设计提出了更高的要求.例如, 对于琼脂包埋后光发酵反应器, 光照从双侧光照改变到单侧光照时, 反应器氢气产量从4.40 L降低到3.85 L, 减少12.5%, 氢气速率更是从1.08 mmol · L-1 · h-1下降到0.52 mmol · L-1 · h-1, 减少了51.9% (Elkahlout et al., 2019).Wen等(2019a)使用硅胶作为载体, Rhodopseudomonas sp. nov. strain A7作为实验菌株时发现, 最少数量和最大比表面积的载体产氢效能最好, 该研究推测是由于此时载体能提供最大生物膜附着面和带来最少载体摩擦及遮蔽, 证明了良好光照和成熟稳定的生物膜是高效光发酵制氢的有效保障.但与固定反应器要求一定的光源设计相对的是, 固定化便于对光合细菌空间位置排列和摆放进行调控, 有利于光发酵制氢对光源吸收的灵活调整, 尤其是室外太阳能条件下的光能利用.比如在清晨、傍晚增大反应器与太阳光垂直照射夹角以增强光照, 正午时分减少角度以避免光抑制, 这对于光发酵制氢的实际应用具有十分重要的意义(Oncel et al., 2014).
4.2 反应器构型光发酵反应器主要保证3个条件：光照、厌氧和纯菌环境(尤其是甲烷菌, 会将产生的氢气转化为二氧化碳), 这些条件对反应器的构型提出了很高的要求(Adessi et al., 2014).现在反应器构型主要分为平板、管状、环形、槽型和上流管式；按照运行环境分为室内环境(人工环境)与室外环境(人工环境)；按照运行方式分为序批式、连续流、半连续流.各种类型反应器中, Palamae等(2018)将管状反应器与柱状和矩形状反应器进行对比, 在相同光强和总工作容积为1 L的环境下, 尽管柱状反应器累计产氢量略高于管状反应器, 但管状反应器可获得比柱状和矩形状反应器高约34%的最大产氢速率, 这可能是因为管状光发酵反应器拥有最大的比表面积.而平板反应器由于具有较高的比表面积, 相比于其他类型反应器具备较高的光合效率, 同时, 反应器的构型使得平板反应器同时具备对气体压力环境的良好控制性和建造与运行的经济性.同时, 相比于管式反应器要求表面积与占地面积1 : 1, 平板反应器能够达到8 : 1的高效占比, 能够极大地减少占地空间(Gebicki et al., 2010, Oncel et al., 2014).但对于一般悬浮态, 其搅拌能力是制约应用化的瓶颈, 固定态无疑能够解决搅拌问题，同时也能具有平板反应器的优势.环形反应器具有良好的比表面积、温度控制和气体交换等优点, 但反应器成本较高、承受压力大, 且环形反应器要求光源设计在周围及中心, 不适用于室外太阳光环境(Basak et al., 2014).
4.3 载体改性光发酵生物膜反应器除了进行光源设计、构型设计的研究外, 另一个主要研究方向是进行载体改性.载体是决定生物膜法处理废水的关键因素, 所以人们针对载体进行各种改性试验, 理想的目标载体需要具有比表面积大、吸附性能好、特异性吸附、便于分离、微生物友好、经济等优点, 除此之外, 为了满足光发酵制氢的需求, 还需要具备透光率良好、易于吸附光发酵细菌的特点.同时, 人们也研究最佳投放时间地点与水力水质条件, 建立动态在线监测模型.
许多研究对载体种类和性质进行了探讨, 发现光发酵细菌可以在诸多载体表面形成生物膜.例如, Chen等(2006a)使用活性炭、硅胶和黏土作为载体吸附菌体形成生物膜, 此外, 还有研究者利用玻璃珠(Tian et al., 2010)、玻璃纤维(Laurinavichene et al., 2006)等材料作为载体.同时, 也有****对载体进行改造, 以增加载体对光发酵细菌的吸附性能(张川等, 2015).例如, Wang等(2019)使用硅烷偶联剂对聚甲基丙烯酸甲酯网格进行疏水改性并作为载体固定在透明玻璃平板上, 从而加强平板反应器对光发酵细菌的吸附能力, 增强附着效果.Zhang等(2010)使用添加沟槽的PMMA平板反应器加强光发酵细菌的固定化并达到3.816 mmol · m2 · h-1的高效产氢效能, Zhang等(2019)还通过在反应器表面增加凹槽固定光发酵细菌, 并获得了57.6 mL · h-1 · L-1的产氢效能.此外, 反应器设计和固定化技术、照明策略要综合应用.比如, 针对光发酵反应器中不同混合方法、水力停留时间和反应器类型等参数对光发酵制氢影响的研究中, 装有LED的锯齿形挡板既被用于反应器基本构造, 也被用于内部照明, 获得了最高的累积产氢量(Zhang et al., 2015).改性成粗糙表面的光纤既可以提供光照, 又可以充当载体用于固定光发酵细菌, 以便解决扩大化反应器中光路传播的问题(Guo et al., 2011).
5 结论(Conclusions)光发酵制氢可持续、可再生的绿色制备氢能的方式具有巨大的应用前景, 但目前光发酵制氢受限于较低的产氢效能和光能利用率.为了解决这一瓶颈, 需要从内在机制上进行研究和优化.固定化是提升光发酵制氢的一种有效途径, 可增强反应器内生物持有量和对不利环境的抵抗力, 众多研究对光发酵生物膜反应器光源设计、构型和载体改性进行了探讨, 在光发酵生物膜反应器中, 载体吸附生物膜生物量和光源均匀分配是相互影响的关键因素, 反应器设计要同时满足这两种参数需求.同时, 从可持续和经济角度, 未来光发酵生物膜反应器设计要考虑到室外环境和太阳能的利用, 而生物膜要便于进行光发酵细菌空间排列.在机理研究方面发现除了生物膜可以吸附固定微生物外, 生物膜的形成还可以调控光发酵细菌生理生化特性, 使得反应器内光发酵细菌整体呈现利于产氢的代谢通路、酶活性变化, 部分研究还推测生物膜的出现有助于调控能量和物质代谢, 使得光发酵制氢整体朝着有利于产氢的方向倾斜.光发酵生物膜制氢可充分利用光发酵细菌同步环境治理、太阳能生产和氢能获得的优点, 并通过生物膜古老形态以期克服光发酵制氢光能转化率低、产氢效能小的缺点, 从而推动光发酵制氢的发展.但综合来看, 现在对于生物膜法的改进集中在反应器类型改变和载体改性方面, 已经进入了瓶颈期, 如果不能针对基本机理进行改进, 很难产生巨大的飞跃.尽管生物膜作为微生物的主要存在形式, 过去常常被忽视, 现有对生物膜尤其是光合微生物的生物膜机制研究还是不足.需要从机制和反应器设计两方面对光发酵生物膜制氢进行进一步的挖掘和优化, 推动我国氢能行业的发展.
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