雷璠¹, 李崇尧¹, 彭旗¹, 王曼², 唐帆², 姚蕾², 吴永亮², 敖紫淳², 马萍²
1. 湖北科技学院药学院, 咸宁 437100;
2. 湖北科技学院基础医学院, 环境-免疫与神经系统疾病实验室, 咸宁 437100
收稿日期: 2020-03-17; 修回日期: 2020-04-19; 录用日期: 2020-04-19
基金项目: 湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队计划项目（No.T201717）；咸宁市科技计划项目（No.2019KJ11）
作者简介: 雷璠(1995-), 女, E-mail:leifan0827@163.com
通讯作者（责任作者）: 马萍, E-mail:mping68@126.com

摘要：为了研究增塑剂邻苯二甲酸二异壬酯（diisononyl phthalate，DINP）致Allergic March的作用机制，以雄性BALB/c小鼠为受试动物，随机分为5组，包括空白对照组（生理盐水）、20 mg·kg^-1 DINP组、OVA组、20 mg·kg^-1 DINP+OVA组和4-苯基丁酸（4-PBA）拮抗组（20 mg·kg^-1 DINP+OVA+4-PBA），染毒周期为47 d.以肺组织匀浆测定活性氧（reactive oxygen species，ROS）、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和一氧化氮（nitric oxide，NO）.采用ELISA试剂盒检测血清中总免疫球蛋白E（T-IgE）、OVA特异性免疫球蛋白E（OVA-IgE）和白细胞介素-33（IL-33）评价机体的炎症因子，并同时观察肺组织的病理变化结果.与生理盐水组比较，OVA组的肺功能、Th2免疫系统功能亢进的分子、氧化应激指标和肺组织病理学损伤都有所加重.与OVA组比较，20 mg·kg^-1 DINP+OVA组的肺功能、Th2免疫系统功能亢进的分子、氧化应激指标和肺组织病理学损伤同样也有所加重.而4-PBA拮抗组（20 mg·kg^-1 DINP+OVA+4-PBA）与20 mg·kg^-1 DINP+OVA组相比较，其各项指标都有了明显的减轻.实验结果表明，20 mg·kg^-1的DINP能加重小鼠的Allergic March，内质网应激拮抗剂4-PBA可使Allergic March症状减轻，对小鼠肺组织起保护作用，说明内质网应激通路可能通过调节氧化应激介导了DINP所致的Allergic March.
关键词：邻苯二甲酸二酯异壬酯活性氧还原型谷胱甘肽儿童持久过敏症内质网应激氧化应激
Mediating effect of endoplasmic reticulum stress and oxidative stress pathways on allergic march induced by DINP
LEI Fan¹, LI Chongyao¹, PENG Qi¹, WANG Man², TANG Fan², YAO Lei², WU Yongliang², AO Zichun², MA Ping²
1. College of Pharmacy, Hubei University of Science and Technology, Xianning 437100;
2. Laboratory of Environment-immunological and neurological diseases, School of Basic Medical Sciences, Hubei University of Science and Technology, Xianning 437100
Received 17 March 2020; received in revised from 19 April 2020; accepted 19 April 2020
Abstract: In order to investigate the action mechanism of plasticizer diisononyl phthalate (DINP) on Allergic March. Male BALB/c mice were randomly divided into 5 groups, including blank control group (normal saline), 20 mg·kg^-1 DINP group, OVA group, 20 mg·kg^-1 DINP + OVA group, and 4-PBA antagonist group (20 mg·kg^-1 DINP + OVA + 4-PBA), with a exposure period of 47 days. Lung tissue homogenate was used to measure reactive oxygen species (ROS), glutathione (GSH), malondialdehyde (MDA), and nitric oxide (NO). ELISA kits were used to detect T-IgE, OVA-IgE and IL-33 in serum to evaluate the body's inflammatory factors, and at the same time to observe the results of lung tissue pathological changes. Compared with the saline group, lung function, molecules of Th2 immune system hyperfunction, indicators of oxidative stress, and lung histopathological damage all increased in the OVA group. Compared with the OVA group, the 20 mg·kg^-1 DINP + OVA group also exacerbated lung function, molecules of Th2 immune system hyperfunction, oxidative stress indicators and lung histopathological damage. However, compared with the 20 mg·kg^-1 DINP + OVA group, the 4-PBA antagonist group, its indicators were significantly reduced. The experimental results show that 20 mg·kg^-1 of DINP can aggravates Allergic March in mice. Endoplasmic reticulum stress antagonist 4-PBA can reduce the symptoms of Allergic March and protect the lung tissue of mice, and it is demonstrated that the endoplasmic reticulum stress pathway may mediates the allergic march induced by DINP via regulating oxidative stress.
Keywords: diisononyl phthalatereactive oxygen speciesglutathioneallergic marchendoplasmic reticulum stressoxidative stress
1 引言(Introduction)Allergic March是近年国际上广受关注的一种环境相关性免疫疾病综合征, 比较准确的中文翻译为“儿童青少年持久性多种Ⅰ型超敏反应综合征”, 通俗病名为“儿童持久过敏症(Persistent Allergic Symptoms in Children)”(马萍等, 2017).英国过敏协会(Allergy UK)将Allergic March释义为(Barberio et al., 2008)：“易患过敏的儿童在他们的童年时期经常会持续发生过敏, 这些过敏症经常相互叠加, 致使儿童在某一时期患有一种以上过敏症, 或者出现一种过敏症消退而另一种过敏症又开始的情况”.
邻苯二甲酸酯(phthalic acid esters, PAEs)也被称为酞酸酯.其主要用作增塑剂, 也就是说, 它们主要用于添加到聚合物中以增强材料的柔韧性和拉伸性能.PAEs作为增塑剂被广泛应用于建筑材料, 食品包装、服装、玩具、儿童产品、血袋、静脉输液袋和输液器以及其他医疗设备(Huber et al., 1996).新型增塑剂邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)因其低毒性的特点, 作为增塑剂被广泛应用(Zota et al., 2014).由于日常生活中大量食物容器中都含有邻苯二甲酸酯, 因此人们很容易被食物摄入.人体主要通过饮食摄入而暴露于DINP(Shen et al., 2017).由于含有DINP的儿童产品种类繁多, 因此儿童比成人具有更高的暴露风险(Calafat et al., 2008；Wittassek et al., 2008)
由于PAEs有一定的挥发性, 所以人们的居住和工作环境中都有很高浓度的PAEs存在, 其潜在的健康威胁已经受到众多****的关注.本课题组研究发现(Ma et al., 2014), 氧化应激的积累可能是PAEs致肝脏损伤和毒理作用的重要分子机理.Kang等(2014)发现邻苯二甲酸二异壬酯通过激活NF-κB加剧了过敏性皮炎.Qin等(2018)表明, 邻苯二甲酸二异癸酯会加剧氧化应激并激活p38 MAPK, 从而加剧Th2和Th17介导的哮喘.有研究表明(Kim et al., 2015)在过敏性哮喘, 特别是严重哮喘的发展过程中, 内质网应激信号正在成为炎症和免疫反应的重要调节剂.Kim等(2013)发现内质网应激通过激活NF-κB影响哮喘的发病机理.
Bornehag等的流行病学研究(Bornehag et al., 2004)发现了儿童持久过敏症(即Allergic March)除了与家族遗传背景具有明显的关系之外, 还与环境邻苯二甲酸酯的暴露具有密切的联系.但国内对于邻苯二甲酸二异壬酯对儿童持久过敏症作用机制还有待研究, 因而本实验以雄性BALB/c小鼠为实验材料, 4-PBA为拮抗剂, 测定不同DINP剂量作用下肺组织匀浆中氧化应激水平生物标志物ROS、GSH、MDA和NO的含量, 采用ELISA试剂盒检测血清中T-IgE、OVA-IgE和IL-33的含量评价机体的炎症因子, 并同时观察肺组织的病理变化结果, 探究增塑剂DINP是否通过内质网应激通路调节氧化应激从而加重儿童持久过敏症的作用机制, 以期为全面评估DINP的毒性效应及分子机制提供参考.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 实验动物SPF级雄性BALB/c小鼠, 6周龄, 体重16 g左右, 购买自湖北省实验动物研究中心.
2.2 主要仪器与试剂主要仪器：酶标仪(ELx800, 美国Bio-Tek), 多功能荧光酶标仪(Hide Chameleon V, 芬兰Hidex), 低温冷冻离心机(5424R, 德国Eppendorf), 三用电热温水箱(HH-42, 北京长源), 显微镜(DP73, 日本Olympus), 动物肺功能分析系统(AniRes 2005, 北京贝兰博), 医用雾化器(402 A type, 中国鱼跃).
主要试剂：邻苯二甲酸二异壬酯(DINP, >99%, Sigma), 4-Phenylbutyric acid(4-PBA, ≥99%, Sigma), 二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA, >99.9%, Sigma), 蛋白酶K(Sigma), 硫代巴比妥酸(TBA, 国药集团), Folin-酚试剂盒(北京鼎国昌盛), 还原型谷胱甘肽试剂盒(南京建成), 一氧化氮试剂盒(南京建成), T-IgE ELISA试剂盒(酶联生物), OVA-IgE ELISA试剂盒(酶联生物), IL-33 ELISA试剂盒(酶联生物).
2.3 动物分组、染毒及“儿童持久过敏症”小鼠模型的构建65只雄性BALB/c小鼠, 随机分为5组, 包括1个空白对照组(生理盐水), 1个20 mg·kg^-1 DINP染毒组, 1个OVA组, 1个OVA+20 mg·kg^-1 DINP染毒组, 1个OVA+20 mg·kg^-1 DINP+4-PBA拮抗组, 每组13只.根据课题组前期的研究(Li et al., 2020), 选择DINP优先暴露剂量是20 mg·kg^-1·d^-1, 以生理盐水稀释成2 mg·mL^-1的使用液, 稀释过程中加与DINP等量的吐温80(量很小, 对生物体无毒无副作用)助溶(Dimitrov et al., 2011).稀释液现用现配, 使用前在旋涡混悬仪上充分混匀.OVA皮肤暴露溶液的配置方法为：将200 μg OVA固体粉末溶于20 μL生理盐水中.4-PBA的暴露剂量为80 mg·kg^-1, 具体配制方法为：经过计算, 按照8 mg·mL^-1的浓度配置所需体积的4-PBA.DINP与4-PBA均为经口灌胃, 灌胃量为10 mL·kg^-1.每只小鼠每次背部涂抹20 μl OVA皮肤暴露溶液.
参考Leyva-Castillo等(2013)实验研究, “儿童持久过敏症”小鼠模型的构建方法是：在小鼠幼年阶段使用过敏原OVA作为过敏性皮炎成模剂, 通过多次背部涂抹诱导产生过敏性皮炎；再通过过敏原OVA的多次背部涂抹致敏和雾化激发, 在小鼠成年阶段诱导产生过敏性哮喘, 完整的模拟了儿童持久过敏症全过程.具体方案是1~11 d OVA皮肤暴露, 每2 d一次, 共6次；14~39 d DINP暴露(口饲), 27~33 d再次进行OVA皮肤暴露, 共4次, 41~47 d OVA雾化一周, 48 d处死小鼠, 测量数据.
2.4 血清和肺组织匀浆的制备47 d染毒结束后, 小鼠腹腔注射戊巴比妥纳, 用酒精棉球擦拭胸腔皮肤, 打开胸腔, 暴露出心脏所在位置的肌肉, 然后用1 mL医用注射器缓慢的从心脏抽取0.8~1 mL左右的血液, 注射入1.5 mL离心管, 在室温下静置30 min后, 在25 ℃, 3000 r·min^-1条件下离心10 min, 取上清分装置于-80 ℃冰箱中.
对小鼠进行心脏取血后, 取出完整的肺组织, 在冷的PBS(PH7.5)中洗净, 用吸水纸吸干水分, 将左肺放入玻璃匀浆器中并加入冷的PBS制成10%的组织匀浆, 在4 ℃下以10000 r·min^-1离心10 min, 取上清分装置于-80 ℃冰箱.
2.5 肺组织切片的制备取出右肺并用固定剂充胀.在室温下用4%多聚甲醛固定, 然后将肺按常规方式包埋在石蜡中, 并使用切片机将石蜡样品连续切片至4 μm的厚度.随后, 进行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining, H & E)和马松三色染色(Masson, MT)方法对肺组织进行染色.在光学显微镜下检查染色的肺组织.
2.6 肺功能分析最终雾化后24 h内进行气道高反应性测量.通过腹膜内注射戊巴比妥钠麻醉小鼠.在小鼠进入深度麻醉状态后, 小心切开颈部皮肤暴露气管.将气管插管插入气管, 并迅速连接到计算机控制的呼吸机.根据AniRes 2005肺功能系统(Bestlab, 2.0版, 中国), 呼吸/吸气比预设为1.5:1, 实际呼吸频率预设为每分钟90次呼吸.在运行AniRes2005软件时, 使用注射器针头通过固定的气管插管以5 min的间隔将50 μL的乙酰甲胆碱(MCH)注入颈静脉.一共注射4次, 浓度为0.025、0.05、0.1和0.2 mg·kg^-1.该软件实时记录了吸气阻力(Ri), 呼气阻力(Re)和肺动力顺应性(Cldyn).R区域表示在MCH分散后300 s内Ri或Re的峰值与基线之间的封闭区域, 以及最低的Cldyn以定量评估肺顺应性.
2.7 ROS含量的测定通过DCFH-DA荧光测定法测定肺上清液中的ROS水平.用PBS将肝组织匀浆稀释100倍, 并将荧光染料DCFA-DA按1:1000稀释.然后再加入100 μL的稀释匀浆液与100 μL稀释的荧光染料DCFA-DA于酶标板中, 轻微摇匀, 37 ℃中避光反应5 min, 用荧光酶标仪检测激发波长485 nm、激发波长528 nm处的荧光强度.
2.8 GSH含量和蛋白质含量的测定严格按照GSH试剂盒说明书来测定其含量, 按照Folin-酚法来测定蛋白含量.
其含量计算方法为：GSH含量(μmol·g ^-1)=[(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)]×标准管浓度×样本稀释倍数÷待测匀浆蛋白浓度(g·L^-1)
2.9 MDA含量的测定取200 μL 0.6% TBA置于1.5 mL试管中, 再加入50 μL的上清液, 沸水浴15 min, 然后10000 r·min^-1离心5 min.取上清100 μL于酶标板中排列, 用全波长酶标仪检测, 分别在450、532、600 nm波长下测定吸光值(以加PBS的为参照), 按照公式计算MDA浓度(μmol·L^-1)=6.45(A₅₃₂-A₆₀₀)-0.56A₄₅₀, A为吸光度.
2.10 NO含量的测定NO对于氧化应激的标志至关重要.严格按照制造商的说明使用测定NO含量的试剂盒.
2.11 ELISA测定使用ELISA试剂盒测量小鼠血液中T-IgE、OVA-IgE和IL-33的水平.所有程序均按照试剂盒说明进行.
2.12 统计分析使用GraphPad Prism 5.0软件进行统计图生成.采用SPSS 18.0统计分析软件进行统计分析, 多组间均数用比较实用单因素方差分析(ANOVA), 然后使用最小显著性差异法(LSD)检测两组间均数的差异性, p < 0.05, p < 0.01表示差异有统计学意义.
3 结果(Results)3.1 小鼠血液中Th2免疫系统功能亢进的分子标志物检测结果图 1显示, 小鼠血液中Th2免疫系统功能亢进的分子标志物检测结果.IgE是介导过敏性疾病的主要抗体.根据对图 1a和1b所示的T-IgE和OVA-IgE分析, 与生理盐水组比较, OVA组、20 mg·kg^-1 DINP+OVA组、20 mg·kg^-1 DINP+OVA+4-PBA组的含量明显增多, 均有显著性差异(p < 0.01)；与OVA组比较, 20 mg·kg^-1 DINP+OVA组的含量同样显著增多, 有显著性差异(p < 0.01)；20 mg·kg^-1 DINP+OVA+4-PBA组与20 mg·kg^-1 DINP+OVA组比较含量明显下降, 有显著性差异(p < 0.01).
图 1(Fig. 1)

图 1 不同处理组小鼠血清T-IgE、OVA-IgE和IL-33的含量(*：p < 0.05, **：p < 0.01, 与对照组相比；##：p < 0.01, 与OVA组相比；δδ：p < 0.01, 与20 mg·kg-1 DINP+OVA组相比, 下同) Fig. 1T-IgE, OVA-IgE ang IL-33 content in mouse serum of different groups(*:p < 0.05, **:p < 0.01 compared with the control group; ##: p < 0.01, compared with the OVA group; δδ: p < 0.01, compared with the 20 mg·kg-1 DINP+OVA group, the same below)

IL-33是与Th2炎症相关的过敏反应的重要信号. 图 1c表明, 与生理盐水组相比, OVA组、20 mg·kg^-1 DINP+OVA组、20 mg·kg^-1 DINP+OVA+4-PBA组的含量明显增多, 均有显著性差异(p < 0.01)；与OVA组比较, 20 mg·kg^-1 DINP+OVA组的含量同样显著增多, 有显著性差异(p < 0.01)；20 mg·kg^-1 DINP+OVA+4-PBA组与20 mg·kg^-1 DINP+OVA组比较含量明显下降, 有显著性差异(p < 0.05).
3.2 小鼠气道高反应性(AHR)的检测结果为了研究DINP暴露对过敏性哮喘小鼠气道高反应性的影响, 本研究在每组小鼠中以不同浓度的乙酰甲胆碱测试了吸气阻力(Ri)、呼气阻力(Re)和肺顺应性(Cldyn).如图 2所示, 随着乙酰甲胆碱浓度的增加, Ri和Re值(图 2a和2b)逐渐增加, 而Cldyn(图 2c)逐渐减少.与生理盐水组相比, OVA组的Ri和Re显著增加, 而Cldyn显著下降.与OVA组相比, 20 mg·kg^-1 DINP+OVA组的Ri和Re显著增加, 而Cldyn显著下降.加入拮抗剂4-PBA后, 与20 mg·kg^-1DINP+OVA组比较, 20 mg·kg^-1 DINP+OVA+4-PBA的Ri和Re显著下降, 而Cldyn显著上升.当乙酰甲胆碱的浓度为0.2 mg·kg^-1时, 20 mg·kg^-1 DINP+OVA组与OVA组之间的Ri、Re与Cldyn值存在显著差异(p < 0.05, p < 0.01).20 mg·kg^-1 DINP+OVA组和20 mg·kg^-1 DINP+OVA+4-PBA组之间的Re值存在显著差异(p < 0.05), 同时Ri的值有下降, Cldyn的值有上升, 但是没有显著性差异.
图 2(Fig. 2)

图 2 小鼠气道高反应性测定结果图 Fig. 2Measurement results of airway hyperresponsiveness in mice

3.3 小鼠肺组织H & E染色的病理学分析图 3观察到与哮喘有关的气道结构改变的典型病理特征：支气管周围和血管周围区域炎性细胞浸润(H & E染色)；这些特征出现在OVA组(3c)的小鼠中.与OVA组(3c)比较, 20 mg·kg^-1 DINP+OVA组(3d)显示管腔变窄, 气管壁变厚和起皱.与20 mg·kg^-1 DINP+OVA组(3d)比较, 20 mg·kg^-1 DINP+OVA+4-PBA组(3e)显示管腔和气管壁的损害得到了明显减轻.
图 3(Fig. 3)

图 3 不同处理组小鼠肺切片图(10×20, H & E染色)(N:正常组织；M：中度变化；V:重度变化) Fig. 3Microscopic images of lung slices of different groups (10×20, H & E stains)

3.4 小鼠肺组织Masson染色的病理学分析图 4观察到与哮喘有关的气道结构改变的典型病理特征：胶原在支气管周围沉积(MT染色).所有这些特征均在OVA攻击的小鼠中观察到.与OVA组(4c)比较, 20 mg·kg^-1 DINP+OVA组(4 d)显示胶原细胞纤维化更加严重.与20 mg·kg^-1 DINP+OVA组(4d)比较, 20 mg·kg^-1 DINP+OVA+4-PBA组(4e)显示胶原纤维化程度明显减轻.
图 4(Fig. 4)

图 4 不同处理组小鼠肺切片图(10×20, Masson染色)(红色箭头表示蓝色胶原纤维化) Fig. 4lung slices of different groups (10×20, Masson stains)

3.5 小鼠肺组织氧化应激指标的检测图 5显示肺组织氧化应激指标的检测.对图 5a、5c和5d的ROS、MDA和NO进行分析, 与生理盐水组比较, OVA组、20 mg·kg^-1 DINP+OVA组、20 mg·kg^-1 DINP+OVA+4-PBA组的含量明显增多, 均有显著性差异(p < 0.05, p < 0.01)；与OVA组比较, 20 mg·kg^-1 DINP+OVA组的含量同样显著增多, 有显著性差异(p < 0.05, p < 0.01)；20 mg·kg^-1 DINP+OVA+4-PBA组与20 mg·kg^-1 DINP+OVA组比较含量明显下降, 有显著性差异(p < 0.05, p < 0.01). 图 5b为GSH含量的测定, 与生理盐水组比较, OVA组、20 mg·kg^-1 DINP+OVA组、20 mg·kg^-1 DINP+OVA+4-PBA组的含量明显减少, 均有显著性差异(p < 0.01)；与OVA组比较, 20 mg·kg^-1 DINP+OVA组的含量同样显著减少, 有显著性差异(p < 0.01)；20 mg·kg^-1 DINP+OVA+4-PBA组与20 mg·kg^-1 DINP+OVA组比较含量明显上升, 有显著性差异(p < 0.05, p < 0.01).
图 5(Fig. 5)

图 5 不同处理组小鼠肺组织中氧化应激的含量 Fig. 5Content of oxidative stress in lung tissue of mice in different treatment groups

4 讨论(Discussion)本研究所建立的儿童持久过敏症模型, 是通过皮肤涂抹患过敏性皮炎, 最终的表现形式是过敏性哮喘.哮喘患者患有慢性呼吸道疾病, 从而导致喘息、呼吸急促、胸闷和咳嗽.哮喘的特征是气道高反应性(AHR)增加, 气道发炎和气道重塑.AHR和气道炎症是过敏性哮喘的重要临床特征, 是哮喘病理过程的持续结果(Kim et al., 2013).本研究的结果表明, DINP可以加重气道高反应性的程度并引起病理性气道损害.气道高反应性是慢性气道炎症的标志, 是过敏性哮喘的典型特征(Hollingsworth, 2015).刺激气道时, 会发生异常的过度反应.通过分析Ri、Re和Cldyn的数据, 可以得出结论, 在小鼠中观察到的AHR是由OVA致敏诱导的, 并且DINP暴露会导致严重加剧.仅与OVA暴露组相比, 20 mg·kg^-1 DINP+OVA组明显升高, 有显著性差异.说明OVA暴露诱导了气道高反应性的发生, 而DINP的暴露对气道高反应性造成了进一步加重.
病理学图片结果显示, 在HE切片中, 与生理盐水组比较, OVA组气道壁显示有一些增厚, 炎性细胞浸润增加.20 mg·kg^-1 DINP+OVA与OVA比较, 气道壁增厚明显, 炎性细胞浸润变得更加严重.另外, 在Masson切片中, 与生理盐水组比较, OVA组的胶原纤维化程度得到增加.同时, 与OVA组比较, 20 mg·kg^-1 DINP+OVA组的胶原纤维化程度明显增加.以上所有数据表明, DINP的暴露加重了OVA诱导所引起的病理学改变, 包括气道壁增厚, 炎症细胞因子浸润与胶原纤维化的增多.
T-IgE、OVA-IgE和IL-33是Th2免疫应答的关键生物标志物.这些细胞因子在过敏性哮喘的发病机理中起着关键作用, 与气道炎症的发生和发展密切相关(Karaulov et al., 2018).IgE是血浆中最不常见的免疫球蛋白, 但在变应性疾病中起重要作用(Ishizaka et al., 2016).IL-33介导IL-1受体ST2, 激活NF-κB和MAP激酶, 并从体外极化的Th2细胞产生相关的细胞因子.本研究结果表明, 当小鼠仅暴露于OVA中时, T-IgE, OVA-IgE和IL-33的水平显着增加, 而当小鼠暴露于20 mg·kg^-1 DINP+OVA中时, T-IgE、OVA-IgE和IL-33的水平较OVA组有更大的上升, 表明OVA致敏的小鼠随着DINP的暴露免疫反应像Th2型反应一样进行, 并加重小鼠的过敏性哮喘.
内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是指细胞受到刺激时, 调节内质网的蛋白质发生错误折叠, 改变了蛋白质的平衡状态, 此时细胞会采取相应的变化, 缓解内质网压力, 促进内质网功能恢复正常(韩欣洁等, 2019).许多研究表明内质网应激与氧化应激之间存在着密切联系, 比如氧化应激引起内质网应激、内质网应激诱发氧化应激和氧化应激与内质网应激通过多条通路相互作用(邱艳丽等, 2016).ROS的产生与内质网密切相关, ROS可在内质网在内的多个细胞器中产生, 而内质网是ROS产生的主要部位之一(Tu et al., 2002；Mracek et al., 2009).而ROS在氧化应激中起重要的作用, 是氧化应激中最重要的指标.在本研究的实验中, 通过使用内质网应激拮抗剂4-PBA, 测定一系列的氧化应激指标, 从而反映内质网应激与氧化应激在儿童持久过敏症中的关系.应激被认为在发病机理中起重要作用, 尤其是ROS在包括哮喘在内的许多呼吸系统疾病中被证明具有重要作用(Zuo et al., 2013).氧化应激是由ROS的积累所引起的, ROS可能导致不同程度的组织损伤(Ray et al., 2012).由于GSH是ROS的主要清除剂, 因此体内氧化损伤的程度可以由GSH反映(Birben et al., 2012).脂质过氧化可能是由于过量的ROS所引起的, 而脂质过氧化作用的主要代谢产物是MDA. NO不仅是重要的生物信使分子, 而且在各种疾病的发病机理中也起着重要而广泛的毒性作用.过量的一氧化氮会介导和放大氧化应激并损害人体(Snyder et al., 1992).本研究的研究结果表明, 当小鼠暴露于20 mg·kg^-1 DINP+OVA中时, ROS、MDA和NO的含量较OVA组有更大的上升, GSH则有一定程度的下降.表明OVA致敏的小鼠随着DINP的暴露机体内氧化应激水平显著上升, 从而造成氧化损伤.
4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid, 4-PBA)是一种低分子脂肪酸, 外形呈白色晶状, 可防止蛋白质的错误折叠从而减少内质网应激的发生.4-PBA对很多疾病有广阔的治疗前景.有研究表明, 内质网应激造成的细胞损伤可由4-PBA通过调节未折叠蛋白反应减轻(Hwang et al., 2010).对20 mg·kg^-1 DINP+OVA组添加拮抗剂4-PBA, 与20 mg·kg^-1 DINP+OVA组相比, 小鼠体内Th2免疫应答标志物T-IgE、OVA-IgE和IL-33水平得到了明显下降, 气道高反应性与肺组织病理损伤也得到了减轻；同时小鼠肺组织的ROS、MDA和NO含量均显著下降, GSH含量显著上升.说明DINP暴露加重了OVA致敏的小鼠儿童持久过敏症, 可加入4-PBA拮抗剂通过内质网应激通路调节氧化应激得到改善.
5 结论(Conclusions)1) OVA致敏可以成功的构建儿童持久过敏症小鼠模型.
2) 20 mg·kg^-1DINP暴露加重了小鼠的儿童持久过敏症, 内质网应激通路可能通过调节氧化应激介导了DINP所致的儿童持久过敏症.

参考文献

Barberio G, Pajno G B, Vita D, et al. 2008. Does a 'reverse' atopic march exist?[J]. Allergy, 63: 1630-1632. DOI:10.1111/j.1398-9995.2008.01710.x

Birben E, Sahiner U M, Sackesen C, et al. 2012. Oxidative stress and antioxidant defense[J]. World Allergy Organization Journal, 5(1): 9-19. DOI:10.1097/WOX.0b013e3182439613

Bornehag C G, Sundell J, Weschler C J, et al. 2004. The association between asthma and allergic symptoms in children and phthalates in house dust:A nested case-control study[J]. Environmental Health Perspect, 112(14): 1393-1397. DOI:10.1289/ehp.7187

Calafat A M, Ye X, Lee-Yang W, et al. 2008. Exposure of the u.s. population to bisphenol a and 4-tertiary-octylphenol:2003-2004[J]. Environmental Health Perspect, 116(1): 39-44.

Dimitrov M, Nikolova I, Benbasat N, et al. 2011. Acute toxicity, antidepressive and mao inhibitory activity of mangiferin isolated from hypericum aucheri[J]. Biotechnology and Biotechnological Equipment, 25(4): 2668-2671. DOI:10.5504/BBEQ.2011.0099

韩欣洁, 汪建新. 2019. 内质网应激与相关呼吸系统疾病研究进展[J]. 解放军医学院学报, 40(12): 1188-1191.

Hollingsworth J W. 2015. Retraction:hyaluronan activation of the nlrp3 inflammasome contributes to the development of airway hyperresponsiveness[J]. Environmental Health Perspect, 123(7): A172.

Huber W W, Grasl-Kraupp B, Schulte-Hermann R. 1996. Hepatocarcinogenic potential of di(2-ethylhexyl) phthalate in rodents and its implications on human risk[J]. Critical Reviews in Toxicology, 26: 365-481. DOI:10.3109/10408449609048302

Hwang M S, Baek W K. 2010. Glucosamine induces autophagic cell death through the stimulation of ER stress in human glioma cancer cells[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 399(1): 110-116.

Ishizaka K, Ishizaka T. 2016. Identification of IgE[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 137: 1646-1650. DOI:10.1016/j.jaci.2015.12.1343

Kang J, Song J, Shen S, et al. 2016. Diisononyl phthalate aggravates allergic dermatitis by activation of NF-κB[J]. Oncotarget, 7(51): 85472-85482. DOI:10.18632/oncotarget.13403

Karaulov A, Garib V, Garib F, et al. 2018. Protein biomarkers in asthma[J]. International Archives of Allergy and Immunology, 175: 189-208. DOI:10.1159/000486856

Kim K H, Jahan S A, Kabir E. 2013. A review on human health perspective of air pollution with respect to allergies and asthma[J]. Environment International, 59: 41-52. DOI:10.1016/j.envint.2013.05.007

Kim S R, Kim D I, Kang M R, et al. 2013. Endoplasmic reticulum stress influences bronchial asthma pathogenesis by modulating nuclear factor κB activation[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 132: 1397-1408. DOI:10.1016/j.jaci.2013.08.041

Kim S R, Lee Y C. 2015. Endoplasmic reticulum stress and the related signaling networks in severe asthma[J]. Allergy Asthma & Immunology Research, 7(2): 106-117.

Leyva-Castillo J M, Hener P, Jiang H, et al. 2013. TSLP produced by keratinocytes promotes allergen sensitization through skin and thereby triggers atopic march in mice[J]. Journal of Investigative Dermatology, 133(1): 154-163.

Li CY, Song P, Lei F, et al. 2020. The synergistic or adjuvant effect of DINP combined with OVA as a possible mechanism to promote an immune response[J]. Food and Chemical Toxicology, 140: 111275. DOI:10.1016/j.fct.2020.111275

Ma P, Yan B, Zeng Q, et al. 2014. Oral exposure of Kunming mice to diisononyl phthalate induces hepatic and renal tissue injury through the accumulation of ROS. Protective effect of melatonin[J]. Food and Chemical Toxicology, 68: 247-256. DOI:10.1016/j.fct.2014.03.027

马萍, 杨旭. 2017. TSLP和TRPV1通路对邻苯二甲酸酯诱发Allergic March的介导作用[J]. 公共卫生与预防医学, 28(2): 1-5.

Mracek T, Pecinova A, Vrbacky M, et al. 2009. High efficiency of ROS production by glycerophosphate dehydrogenase in mammalian mitochondria[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 481(1): 30-36. DOI:10.1016/j.abb.2008.10.011

Qin W, Deng T, Cui H, et al. 2018. Exposure to diisodecyl phthalate exacerbated th2 and th17-mediated asthma through aggravating oxidative stress and the activation of p38 mapk[J]. Food and chemical toxicology:an international journal published for the British Industrial Biological Research Association, 114: 78. DOI:10.1016/j.fct.2018.02.028

邱艳丽, 李巧稚, 郑亚琴, 等. 2016. 内质网应激与氧化应激:恶性循环还是双刃剑?[J]. 实用药物与临床, 19(8): 1037-1041.

Ray P D, Huang B W, Tsuji Y. 2012. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling[J]. Cell Signal, 24(5): 981-990. DOI:10.1016/j.cellsig.2012.01.008

Shen S, Li J, You H, et al. 2017. Oral exposure to diisodecyl phthalate aggravates allergic dermatitis by oxidative stress and enhancement of thymic stromal lympho-poietin[J]. Food and chemical toxicology:an international journal published for the British Industrial Biological Research Association, 99: 60-69. DOI:10.1016/j.fct.2016.11.016

Snyder S H, Bredt D S. 1992. Biological roles of nitric oxide[J]. Scientific American, 266(5): 68-77.

Tu B P, Weissman J S. 2002. The FAD-and O-2-dependent reaction cycle of Ero1-mediated oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum[J]. Molecular cell, 10(5): 983-994. DOI:10.1016/S1097-2765(02)00696-2

Wittassek M, Angerer J. 2008. Phthalates:metabolism and exposure[J]. International Journal of Andrology, 31(2): 131-138. DOI:10.1111/j.1365-2605.2007.00837.x

Zota A R, Calafat A M, Woodruff T J. 2014. Temporal trends in phthalate exposures:findings from the national health and nutrition examination survey, 2001-2010[J]. Environmental Health Perspect, 122(3): 235. DOI:10.1289/ehp.1306681

Zuo L, Otenbaker N P, Rose B A, et al. 2013. Molecular mechanisms of reactive oxygen species-related pulmonary inflammation and asthma[J]. Molecular Immunology, 56: 57-63. DOI:10.1016/j.molimm.2013.04.002