张泽钰, 李茹莹
天津大学环境科学与工程学院, 天津 300350
收稿日期: 2019-06-25; 修回日期: 2019-09-12; 录用日期: 2019-09-12
基金项目: 国家水体污染控制与治理科技重大专项（No.2017ZX07106004）；天津市科技计划项目（No.16YFZCSF00320）
作者简介: 张泽钰(1995-), 女, E-mail:lxtxcty@tju.edu.cn
通讯作者（责任作者）: 李茹莹(1977—), 女, 副研究员, 博士生导师, 主要研究方向为厌氧生物能源技术、废水生物处理、水污染控制技术.E-mail:liruying@tju.edu.cn

摘要：研究了不同方法制作的固定化微生物颗粒对于河水的脱氮效果，实验证明，采用聚乙烯醇-活性炭包埋法制作的固定化微生物颗粒（IMPⅠ）与聚乙烯醇-聚乙二醇包埋法制作的固定化微生物颗粒（IMPⅡ）的脱氮效果较好，但由于包埋材料在河水中的溶出造成COD急剧升高，会对河水造成二次污染.利用载体结合法制作的固定化微生物（IMPⅢ）进行5个周期的河水净化实验，结果发现，COD的去除率维持在75%~95%，氨氮的去除率为45%~95%，硝酸盐氮的去除率维持在95%~100%，亚硝酸盐氮的去除率为70%~99%，总氮的去除率保持在55%~80%.研究表明，载体结合法制作的固定化微生物颗粒稳定性好、强度高、微生物活性良好，颗粒可多次重复使用，在河水净化方面有良好的应用前景.
关键词：脱氮固定化微生物包埋法载体结合法
Study on the nitrogen removal in river water by immobilized microorganisms
ZHANG Zeyu, LI Ruying
School of Environment Science and Engineering, Tianjin University, Tianjin 300350
Received 25 June 2019; received in revised from 12 September 2019; accepted 12 September 2019
Abstract: In this paper,the nitrogen removal efficiencies of immobilized microbial particles prepared by different methods for surface river water were studied. The experimental results showed that although the immobilized microbial particles prepared by polyvinyl alcohol-activated carbon embedding method (IMPⅠ) and the immobilization microbial particles prepared by polyvinyl alcohol-polyethylene glycol embedding method (IMP Ⅱ) had good nitrogen removal capacities,a sharp increase of COD concentration would bring secondary pollution to the river due to the dissolution of the embedded materials. Besides,five cycles of river water purification experiments were carried out with immobilized microbial particles (IMP III),which were made by carrier binding method. The removal efficiencies of COD,ammonia nitrogen,nitrate,nitrite and total nitrogen were 75%~95%,45%~95%,95%~100%,70%~99% and 55%~80%,respectively. Results showed that the immobilized microbial particles prepared by carrier binding method had good stability,high strength and good microbial activity,and could be reused for many times,which showed a good application potential in river water purification.
Keywords: nitrogen removalimmobilized microorganismsentrapment methodcarrier binding method
1 引言(Introduction)我国50000多条流域面积大于100 km²的河流中, 大部分河流受到了不同程度的污染(曹枫等, 2017).氨氮是河流中常见的污染物之一, 利用硝化与反硝化微生物完成氨氮-硝酸盐氮-氮气的转化过程, 可有效降低水中总氮的浓度.而有无微生物载体是影响水处理效果的重要因素.若向水体中投加游离状态的生物菌剂, 存在菌体易流失、投加量大、易受水利条件影响等缺陷(Cheng et al., 2011).相比之下, 固定化微生物法具有操作简单、长期运行、反应易控、对环境耐受性强等优点(Yuan et al., 2010).
固定化微生物技术是20世纪60年代从固定化酶技术发展而来的一种新技术, 包括包埋固定法、交联固定法与载体结合法.其原理为通过物理或化学反应, 将游离菌种固定在固定剂的空间内并保持微生物活性(Tanaka et al., 1996).微生物固定化技术是一种实用高效的污水处理和水质净化技术, 目前, 固定化微生物在河水处理方面多为实验室内研究, 实际工程应用案例较少(于鲁冀等, 2016；代小丽等, 2017).这是因为水体中的微生物、动植物种类繁杂, 这种复杂的河水环境对微生物的生长与污染去除能力有所影响(李廷梅等, 2015), 并且固定化微生物本身尚存在一些技术缺陷.史佳媛(2015)利用聚乙烯醇包埋法制作固定化微生物进行河水处理的模拟实验, 30 d后, 固定化微生物对上覆水体中氨氮、总氮的去除率分别为78.30%、68.03%, 但处理初期COD大幅升高, 最终固定化颗粒与底泥融为一体.唐海芳(2017)通过实验证明从美国Bio-cleaner公司购买的以轻质陶粒为载体制作的固定化微生物对湖塘上覆水体有较好的净化效果, 水质从劣Ⅴ类上升到Ⅲ类.Gomez等(2007)发现, 海藻酸钠作为包埋材料能保证较高的生物活性, 但在磷酸盐浓度或K⁺、Na⁺浓度较高的溶液中载体的机械强度降低、稳定性变差.由此可见, 我国目前固定化微生物技术存在一些尚未弥补的缺陷, 在河水水质净化方面的应用还具有很大的研究空间.
基于此, 本文通过比较不同方法制作的固定化微生物颗粒对河水中总氮及COD的去除效果, 探究包埋法制作的固定化微生物在降解河水中污染物时带来的二次污染问题, 并探讨载体结合法制作的固定化微生物颗粒对河水中污染物的去除能力及重复利用性能, 以确定最适用于河水脱氮的微生物固定化方法.
2 实验材料和方法(Materials and methods)2.1 菌种来源及实验用水实验所用脱氮菌是多种异养硝化-好氧反硝化菌组成的混合脱氮菌, 均由天津大学环境工程实验室筛选富集得到, 经前期试验得出混合脱氮菌的最适生长温度为25 ℃、pH=7.0.脱氮菌培养基组分为：柠檬酸钠6 g、(NH₄)₂ SO₄ 1 g、KNO₃ 2 g、K₂HPO₄ 1 g、KH₂PO₄ 0.8 g、MgSO₄ ·7H₂O 0.2 g, 补充蒸馏水至1 L, pH=7.0.实验用河水取自天津市月牙河.
2.2 固定化微生物颗粒的制备方法本实验选取3种不同的方法制作固定化微生物, 分别为聚乙烯醇-活性炭包埋法、聚乙烯醇-聚乙二醇包埋法、载体结合法, 前两种方法是在传统聚乙烯醇-海藻酸钠包埋法的基础上加入添加剂制备固定化微生物颗粒, 载体结合法是利用载体吸附微生物, 再进行表面处理, 以达到微生物固定化的目的.
2.2.1 聚乙烯醇-活性炭包埋法固定化材料包括凝胶剂与交联剂两部分.经前期实验探究, 10%聚乙烯醇(PVA)、0.25%海藻酸钠(SA)与5%粉末活性炭(PAC)制成的凝胶剂效果最佳, 在凝胶剂中加入离心后的混合脱氮菌(凝胶剂:菌液=10:1, 体积比), 搅拌均匀并静置3~4 h.交联剂为2%CaCl₂的饱和硼酸溶液, 用Na₂CO₃将pH调至6.将凝胶剂滴加入交联剂中并缓慢搅拌, 4 ℃交联24 h后将固定化颗粒取出, 用生理盐水洗净, 制得聚乙烯醇-活性炭固定化微生物颗粒(IMPⅠ), 其微生物负载量为4.12 g·kg^-1(以干细菌计).
2.2.2 聚乙烯醇-聚乙二醇包埋法经多次实验得出凝胶剂的最佳配比为6%聚乙烯醇(PVA)、4%聚乙二醇(PEG)与0.5%海藻酸钠(SA)水浴加热, 充分溶解后冷却至室温, 加入脱氮功能菌(凝胶剂与菌液体积比为10:1), 搅拌均匀后静置3~4 h.交联剂为4%CaCl₂的饱和硼酸溶液, 用Na₂CO₃将pH调至6.将凝胶剂滴加入交联剂中并缓慢搅拌, 4 ℃交联24 h后将固定化颗粒取出, 生理盐水洗净, 制得聚乙烯醇-聚乙二醇固定化微生物颗粒(IMPⅡ), 其微生物负载量为4.14 g·kg^-1(以干细菌计).
2.2.3 载体结合法对比活性炭、沸石、陶粒、硅藻土等吸附材料, 最终选择吸附性能最佳的沸石吸附脱氮功能菌后, 进行表面处理以提高微生物的附着稳定性, 制得载体结合法固定化微生物(IMPⅢ), 其微生物负载量为18.50 g·kg^-1(以干细菌计).
2.3 固定化微生物颗粒性能测试方法2.3.1 颗粒强度测定方法利用KY-20数显颗粒强度测定仪对颗粒施加一定的压力, 利用颗粒不会发生塑性形变的临界承受压力来表示其强度大小.颗粒随机选取, 做3次平行实验.
2.3.2 颗粒稳定性测定方法颗粒稳定性以溶涨性来表征, 将10 g颗粒置于河水中持续曝气, 20 d后观察颗粒的大小与状态.颗粒随机选取, 做3次平行实验.
2.4 水质分析方法总氮(TN)、氨氮(NH₄⁺-N)、硝氮(NO₃^--N)、亚硝氮(NO₂^--N)等均参照标准方法测定(国家环境保护总局, 2002), NH₄⁺-N测定采用纳氏试剂分光光度法, NO₃^--N测定采用紫外分光光度法, NO₂^--N测定采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法, TN测定采用碱性过硫酸钾消解-紫外分光光度法；COD测定采用哈希COD管消解法.所有指标检测均取3个平行样.
3 结果与分析(Results and analysis)3.1 固定化微生物颗粒性能3.1.1 颗粒强度颗粒强度是固定化微生物颗粒的一个重要物理指标.因为工程应用中会在河水中大量投放固定化微生物, 如果颗粒强度过低则在底层无法承压, 在尚未发挥作用时变形破碎, 不但无法发挥固定化微生物的作用, 而且会对河水造成二次污染.3种固定化微生物颗粒的强度如表 1所示.
表 1(Table 1)

表 1 3种固定化微生物使用前后颗粒强度 Table 1 Strength of three kinds of immobilized microbial particles

表 1 3种固定化微生物使用前后颗粒强度 Table 1 Strength of three kinds of immobilized microbial particles 固化微生物 颗粒强度/N 颗粒使用前 颗粒使用后 IMPⅠ 12 5 IMPⅡ 17 6 IMPⅢ ＞500 ＞500

由表 1可见, 包埋法制作的固定化微生物颗粒IMPⅠ和IMPⅡ, 承压能力远远小于载体结合法制作的IMPⅢ.3种颗粒分别投入河水中进行河水脱氮实验, 5 d后IMPⅠ与IMPⅡ的弹性减弱, 容易破碎且无法恢复.相比之下, IMPⅢ承压能力达到颗粒强度测试仪的最大值, 颗粒强度极佳.
3.1.2 颗粒稳定性包埋法制作的固定化微生物颗粒IMPⅠ和IMPⅡ在刚投入河水中时, 颗粒圆润有弹性.经过稳定性测试实验, IMPⅠ和IMPⅡ失去弹性, 略有破碎, 其中IMPⅡ如图 1所示, 并且搅动河水后有泡沫产生, 测量河水中的COD＞150 mg·L^-1.此现象说明包埋法制作的固定化微生物颗粒在水中有大量溶出, 包埋材料本身的溶出导致河水中有机物浓度升高, 带来二次污染, 因此, 包埋法制作的固定化微生物不适宜用于实际河水净化.IMPⅢ的稳定性较好, 保持原状.
图 1(Fig. 1)

图 1 IMPⅡ稳定性测试前(a)和测试后(b)对比图 Fig. 1Appearance of IMP Ⅱ before stability test (a) and after stability test (b)

包埋法制作的固定化微生物在河水中稳定性较差, 近年来的多篇文献中均提及此问题, 研究人员尝试通过添加无机材料(史佳媛, 2015；刘元坤等, 2016)、改变材料配比(尹莉等, 2016；Zhang et al., 2018)等方法提高颗粒的稳定性, 但并未从根源上解决这一问题.实验发现, 在实验室配水中颗粒的稳定性可勉强维持1~2个月, 但在河水中颗粒在半个月后就会溶涨、失去弹性, 进而破碎.推测出现该现象的原因有二：一是河水中存在大量种类繁多的土著微生物, 对包埋材料如海藻酸钠、聚乙烯醇、聚乙二醇有摄取分解作用, 导致固定化颗粒被分解；二是河水中环境复杂并存在各种无机离子, 长期处河水环境中会导致包埋载体机械强度降低, 稳定性变差, 这与Gomez等(2007)的研究结论一致.因此, 包埋法制作的固定化微生物颗粒目前不适于运用在河流污染治理中, 而载体结合法制作的固定化微生物机械强度大、稳定性高, 有较好的应用潜力(刘庆禄, 2008；宋超鹏等, 2012).
3.2 固定化微生物颗粒对TN及COD的去除效果将24.27 g IMPⅠ、24.15 g IMPⅡ和5.41 g IMPⅢ分别投加到1 L河水中, 使得3种固定化微生物颗粒中所包埋(结合)的脱氮功能菌质量相同, 换算成河水中干细菌的投加量为0.10 g·L^-1.为排除河水自身所含微生物对实验结果的干扰, 用0.45 μm滤膜过滤掉河水中的土著微生物, 减少河水自净所带来的影响, 可以更好地证明固定化微生物对河水的净化效果.3种固定化微生物颗粒对河水中TN和COD的去除效果如图 2所示.
图 2(Fig. 2)

图 2 3种固定化微生物颗粒对TN(a)和COD(b)的去除效果 Fig. 2TN(a) and COD(b) removal by three kinds of immobilized microorganism particles

如图 2a所示, 3种固定化微生物颗粒对河水中的氮元素都有一定的去除效果.利用聚乙烯醇-活性炭包埋法制作的颗粒IMPⅠ投入河水后的前4 d, 总氮浓度从2.85 mg·L^-1降至1.57 mg·L^-1, 第5 d总氮浓度稍有回升为1.64 mg·L^-1, 截至第5 d总氮去除率为42.51%.利用聚乙烯醇-聚乙二醇包埋法制作的颗粒IMPⅡ投入河水后, 在第2 d中总氮下降速率较快, 从2.49 mg·L^-1降至1.40 mg·L^-1, 后续3 d浓度缓慢降低, 基本平稳, 在第5 d时总氮浓度降低至1.14 mg·L^-1, 去除率为60.15%.载体结合法制作的颗粒IMPⅢ投入河水后, 在前3 d总氮浓度持续降低, 第3 d降低至0.96 mg·L^-1, 第4~5 d总氮浓度缓慢下降趋于平稳, 第5 d总氮浓度降低至0.90 mg·L^-1, 总氮去除率为68.40%.综合分析, IMPⅡ对总氮的去除速率在前2 d优于IMPⅠ与IMPⅢ, 但前5 d的总氮去除率为IMPⅢ高于IMPⅡ和IMPⅠ, 因此, 3种固定化微生物颗粒中, 载体结合法制作的IMPⅢ对河水的脱氮性能最佳.
如图 2b所示, 3种固定化微生物颗粒对河水中的有机污染物去除效果差异较大.利用聚乙烯醇-活性炭包埋法制作的颗粒IMPⅠ处理河水, 在前2 d COD由34 mg·L^-1降低至18 mg·L^-1, 而后持续升高, 在第5 d结束时升高至71 mg·L^-1, 并有继续升高的趋势.利用聚乙烯醇-聚乙二醇包埋法制作的颗粒IMPⅡ处理河水, COD波动较大, 第1 d COD从34 mg·L^-1略微升高至38 mg·L^-1, 在第2 d时急剧下降至13 mg·L^-1, 在接下来的3 d中COD持续升高, 第5 d升至50 mg·L^-1, 并有继续升高的趋势.载体结合法制作的IMPⅢ可对COD持续稳定去除, 5 d中COD从34 mg·L^-1降低到5 mg·L^-1, 去除率为85.29%, 去除效果较好.
实验发现, 聚乙烯醇-活性炭包埋法与聚乙烯醇-聚乙二醇包埋法制作的固定化微生物颗粒, 对于河水中COD去除的总体规律类似, 都是先降低后升高, 且升高的数值较大, 高于河水初始COD值.这一规律说明包埋法制作的固定化微生物颗粒在前期对COD有一定的去除效果, 但它对COD的去除速度不及包埋材料自身溶出释放COD的速度, 因为包埋材料中聚乙烯醇、海藻酸钠和聚乙二醇自身就是有机物, 溶出后会造成河水COD升高, 造成二次污染.这一实验规律与稳定性测试中IMPⅠ与IMPⅡ稳定性不佳、包埋材料自身溶出的结果相符.
3.3 载体结合法制作固定化微生物颗粒的重复利用性能将5 g载体结合法制作的固定化微生物颗粒IMPⅢ投加到1 L河水中, 以4 d为一周期, 重复5个周期.在每一周期结束后将这5 g固定化微生物颗粒投加进新的被污染的1 L河水中, 考察IMPⅢ的重复利用性能, 结果如图 3所示.IMPⅢ对河水中COD的去除率维持在75%~95%, 每一周期结束时COD＜15 mg·L^-1, 去除效果较为稳定.氨氮的去除率为45%~95%, 第一周期去除效率最高为92.75%, 后4个周期去除效果较第一周期有所下降, 推测由于异养菌与硝化细菌的竞争作用, 固定化载体的氨氮去除能力会受到影响(邵勇等, 2017).硝酸盐氮的去除率维持在95%~100%, 亚硝酸盐氮的去除率为70%~99%, 并且后4个周期较第1周期的去除率有所提高, 说明反硝化菌在河水中具有一定的优势, 能够保持较好的生物活性与反硝化性能.各个周期总氮的去除率保持在55%~80%, 去除效果受氨氮浓度影响较大.
图 3(Fig. 3)

图 3 IMP Ⅲ在不同周期对污染物的去除效 Fig. 3Removal of pollutants by IMP Ⅲ for five cycles

综合分析各周期的污染物去除效果, 氮类污染物及COD去除率在一定范围内波动, 说明载体结合法制作的固定化微生物颗粒在5个周期内对氮类污染物及COD能进行有效的去除, 并且使用该方法制作的固定化微生物颗粒中微生物与载体的结合较为稳定, 具有长期稳定处理河水的潜力.
4 结论(Conclusions)1) 聚乙烯醇-活性炭包埋法与聚乙烯醇-聚乙二醇包埋法制作的固定化微生物颗粒强度与稳定性较差, 无法满足净化河水的要求并且会带来有机物的二次污染.载体结合法制作的固定化微生物颗粒强度大、稳定性好.
2) 聚乙烯醇-活性炭包埋法、聚乙烯醇-聚乙二醇包埋法、载体结合法制作的固定化微生物, 三者对河水中总氮的去除率分别为42.51%、60.15%和68.40%；前两者使得河水中COD不降反升, 在投加固定化微生物的5 d中COD从34 mg·L^-1分别升高到71 mg·L^-1和50 mg·L^-1, 载体结合法制作的固定化微生物将河水中COD降至5 mg·L^-1, 去除率为85.29%.综合分析, 载体结合法制作的固定化微生物对氮类污染物及COD的去除效果优于包埋法制作的固定化微生物.
3) 对载体结合法制作的固定化微生物进行5个周期的河水净化实验结果表明, COD的去除率维持在75%~95%, 氨氮的去除率为45%~95%, 硝酸盐氮的去除率维持在95%~100%, 亚硝酸盐氮的去除率为70%~99%, 总氮的去除率保持在55%~80%, 证明载体结合法制作的固定化微生物颗粒有较好的重复利用性能, 在河水净化方面有一定的应用前景.

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