, 代彬彬2, 严亚11. 贵州省水利科学研究院, 贵阳 550001;
2. 贵州省水利水电勘测设计研究院, 贵阳 550001
收稿日期: 2019-04-01; 修回日期: 2019-07-09; 录用日期: 2019-07-09
基金项目: 贵州省2018年水利科技经费项目（No.KT201817）；贵州省2016年水利科技经费项目（No.KT201604）
作者简介: 朱晓萌(1988—), 女, 工程师, E-mail:xiaomeng.zhu.china@gmail.com
通讯作者（责任作者）: 朱晓萌
摘要: 研究了南明河贵阳城区段中沉积物的5种残留医用抗生素对沉积物反硝化潜势的影响，并采用荧光定量PCR及高通量测序方法检测了5种反硝化过程中的关键功能基因丰度以及编码nirS基因的细菌群落结构，探讨了抗生素残留影响反硝化潜势的微生物学机制.结果表明，南明河沉积物中5种目标抗生素中，诺氟沙星（norfloxacin，NFX）的浓度最高（（537.13±212.69）ng·g-1），并且对沉积物中反硝化潜势有显著抑制效果（p < 0.05）.进一步分析表明，NFX对反硝化潜势的抑制作用主要是通过抑制编码nirS细菌主导的亚硝酸盐还原阶段而实现的.本研究揭示了城市河道沉积物中的残留抗生素可能会削弱河道的反硝化脱氮能力从而加重河流氮污染状况，为评估抗生素污染的微生态效应提供了依据.
关键词:抗生素污染城市河道反硝化作用沉积物反硝化细菌nirS
The inhibition effects of residual antibiotics on denitrification in the urban river sediments
ZHU Xiaomeng1
, DAI Binbin2, YAN Ya1 1. Guizhou Water Conservation Science and Research Institute, Guiyang 550001;
2. Guizhou Survey&Design Research Institute for Water Resources and Hydropower, Guiyang 550001
Received 1 April 2019; received in revised from 9 July 2019; accepted 9 July 2019
Abstract: This study investigated the effects of five typical antibiotics on denitrification rates in the sediments of Nanming River in Guiyang city. Through the quantitative Real-time PCR and high-throughput sequencing technologies, abundances of five key denitrifying genes and nirS encoding bacterial communities were also characterized to explore the antibiotics effects on denitrification. Among the five targeting antibiotics, the average concentration of the norfloxacin (NFX) is the highest (537.13±212.69) ng·g-1, and it significantly inhibited denitrification rates in the sediments. The NFX was able to strongly inactivated nirS carrying bacteria which dominated the nitrite reduction process, leading to the decrease of denitrification rates. In general, this study sheds light on the impacts of residual antibiotics on denitrification that may deteriorate the nitrogen pollution in urban rivers. These findings lay a foundation for further research concerning micro-ecological risks of antibiotics pollution.
Keywords: antibiotics pollutionurban riverdenitrificationsedimentdenitrifying bacterianirS
1 引言(Introduction)自1930年人类发现抗生素以来, 大量的抗生素被用于医疗、畜牧和农业领域中.2013年, 中国的抗生素使用量高达92700 t, 仅西南地区就使用了18300 t(Zhang et al., 2015a).这些抗生素多数以原型或者次级代谢物的形式被排出体外, 并随着污水或雨水进入各种水生生态系统(Zhou et al., 2011).广泛分布于各种水生生态系统中的残留抗生素会导致环境中抗性基因的扩散(Pruden et al., 2006), 并对微生物主导的相关生态系统功能造成影响(Brandt et al., 2015; Roose-Amsaleg et al., 2016).
反硝化作用是一系列微生物主导的酶促反应的总称, 是水生生态系统中氮循环的重要环节之一.近20年来, 抗生素对反硝化作用及其相关微生物的影响逐渐得到关注(Hou et al., 2015).早期许多室内模拟实验发现抗生素对反硝化作用的抑制浓度通常大于1000 ng·g-1, 然而自然水体的沉积物中残留抗生素浓度通常低于100 ng·g-1(Conkle et al., 2012；DeVries et al., 2016), 因此一些****认为沉积物中残留抗生素对反硝化作用的影响可以忽略不计(Roose-Amsaleg et al., 2013; Yan et al. , 2013).但是实际上, 由于环境中抗生素的种类、浓度和暴露时间等条件和室内实验之间有很大差异, 相关结果并不一定适用于野外实际情况(Roose-Amsaleg et al., 2016).
近些年的一些研究表明, 由于长期受到生活、医疗废水和污水厂尾水的污染, 城市河道沉积物中的残留医用抗生素浓度远高于其他自然水体(Rodriguez-Mozaz et al., 2015).与此同时, 许多城市河道也面临氮负荷超标的环境问题(Zhang et al., 2015b), 而表层沉积物的反硝化作用是城市河道脱氮的主要自然途径.因此, 相比其他自然水环境, 城市河道沉积物中反硝化过程和脱氮潜力受到高浓度残留抗生素抑制的生态风险更高.
南明河为长江流域乌江水系支流清水河的上游源头, 全长118 km, 其中流经贵阳市境内的河段约为100 km, 是城市径流和生活污水的主要接纳水体.贵阳城区南明河段污水汇入截污沟后, 绝大部分送至新庄和小河污水处理厂进行处理, 但仍有大量污水溢流汇入或直接排入南明河.刘虹等(2009)发现南明河沉积物中残留的抗生素可高达400~800 ng·g-1.南明河也有总氮超标的水质问题(李力等, 2018), 是同时受到抗生素污染和总氮超标影响的典型城市河道生态系统.因此, 本文选取南明河贵阳河道沉积物中残留抗生素为研究对象, 调查了5种典型医用抗生素的残留浓度, 并且同时测定了沉积物的反硝化潜势, 揭示了城市河道中抗生素污染对反硝化存在的抑制作用.在此基础上, 本文进一步测定了反硝化细菌的功能基因丰度和群落结构, 探讨了抗生素抑制反硝化过程的微生物学机制, 以期为科学评价抗生素污染的生态效应提供参考.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 样品采集及分析本文的采样区域为南明河的城区河段(青山—新庄), 于2013年7月进行采样.如图 1所示, 本研究共设7个采样点：NM1为新庄污水处理厂排水口下游50 m；NM2~NM6主要为与贵阳市城区河道, 其中NM4~NM6位于核心城区, NM2~NM3位于近郊城区；NM7为小车河汇入南明河的河口下游100 m处.每个点位分别用彼得逊采泥器采集3个(半径10 m内)表层沉积物平行样品, 保存于灭菌的聚丙烯采样瓶中.采样后, 样品均立即送回实验室进行部分理化指标的测定.首先称取一定质量的新鲜沉积物, 于105 ℃温度下烘干至恒重后测定含水率(质量分数).随后取一定量沉积物冻干、酸熏并水洗至中性后用元素分析仪测定总有机碳(Sedimental total organic carbon, STOC)和总氮(Sedimental total nitrogen, STN).沉积物中的NO3-和NO2-的测定参考前文所用方法(Huang et al., 2011).剩余新鲜沉积物样品, 除部分用于反硝化潜势的测定(4 h内), 其余均置于-20 ℃温度下冷冻保存.
图 1(Fig. 1)
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| 图 1 南明河采样点位分布图 Fig. 1Sampling sites of sediments in Nanming River |
2.2 试剂及仪器本文选取的5种典型医用抗生素代表了5大类抗生素：属于磺胺类的磺胺甲噁唑(sulfadmethoxazole, SMX), 四环素类的四环素(tetracycline, TC), 喹诺酮类的诺氟沙星(norfloxacin, NFX), β-內酰胺类的阿莫西林(amoxicilin, AMX)和大环内酯类的红霉素(erythromycin, ETM).由于后续固相萃取是在偏酸性条件下进行, 而ETM在酸性条件下容易脱去一个水分子(Fan et al., 2009), 因此选择ETM-H2O作为检测物.同时, 选择了3种氘代抗生素作为内标物, 分别为SMX-D4、NFX-D4和AMX-D4.上述抗生素标准品均购置于德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司.甲醇、乙腈和甲酸均为色谱纯, 购自美国Merck公司.柠檬酸钠、柠檬酸、硝酸钠、盐酸和Na2EDTA为分析纯, 购于上海国药集团公司.
实验中使用的主要仪器和耗材包括：配有三重四极杆检测器的液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS, Agilent 1200-6410, 美国)；Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱(2.1 mm × 150 mm, 3.5 μm)；Oasis HLB固相萃取小柱(500 mg, 6 mL, Waters, 美国)；Agilent 5890 Series Ⅱ气相色谱仪(Agilent, 美国)；Centrifuge 5424 R冷冻离心机(Eppendorf, 德国)；Nano-drop分光光度计(Nano-Drop, 美国)；Thermal Cycler DiceTM Real Time System(TaKaRa, 日本)；PowersoilTM DNA Isolation Kits试剂盒(MO Bio, 美国)；BSA124S分析天平(Sartorius, 德国).
2.3 抗生素的萃取及测定沉积物中抗生素的萃取及富集：参照Yang等(2010)和Dinh等(2011)的研究方法, 本文采取超声辅助萃取及固相小柱富集来提取沉积物中的抗生素.具体步骤如下：称取2 g冻干的沉积物样品到玻璃离心管中, 加入100 μL含有内标物(浓度为1.0 mg·L-1)的甲醇-水溶液(1:9, V/V), 4 ℃避光静置8 h或过夜, 直至甲醇完全挥发.加入5 mL的0.2 mol ·L-1柠檬酸钠缓冲液(pH=3)和5 mL乙腈, 振荡10 min后, 超声20 min.在3200 r·min-1下离心5 min后, 将上清液转移至鸡心瓶中.以上步骤重复3次, 将鸡心瓶中液体于55 ℃下旋蒸, 直到上清液体积浓缩至2 mL左右, 然后用超纯水稀释到200 mL.富集前, 先依次用10 mL的甲醇和超纯水对固相小柱进行活化.同时, 在样品稀释液中加入0.2 g的Na2EDTA并充分混匀, 以螯合样品中的金属离子.将样品按照5 mL·min-1中的流速载入HLB固相柱中, 直到全部载入后通入10 mL的超纯水进行清洗, 随后真空干燥30 min.富集的抗生素用6 mL甲醇洗脱, 40 ℃下氮气吹干.用含0.1%甲酸的甲醇-水溶液(1:9, V/V)稀释到0.5 mL, 经0.2 μm膜过滤后等待上机测试.
液相色谱-串联质谱分析：样品进样量均为5 μL, 流动相流速为0.5 mL·min-1, 柱温为35 ℃.流动相A为0.1%甲酸水溶液, B为0.1%甲酸乙腈溶液.采用梯度洗脱程序：0~2.0 min, 10% B；2.0~4.0 min，25% B; 4.0~7.0 min，35% B; 7.1~10.1 min, 100% B, 然后平衡2.4 min.质谱选择电喷雾离子源(ESI), 工作方式为正离子模式；干燥气温度350 ℃、流速为5 L·min-1；喷雾针压力为35 psi, 碰撞气为99.99%氮气；采用多离子反应监测模式(MRM).表 1为各目标抗生素的母离子、定量子离子的质荷比及碰撞能等参数.
表 1(Table 1)
| 表 1 目标抗生素的MRM参数 Table 1 The parameters of targeting antibiotics in MRM mode | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 1 目标抗生素的MRM参数 Table 1 The parameters of targeting antibiotics in MRM mode
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质量保证与质量控制：在2 g空白沉积物(采自花溪水库)中添加200 ng不同抗生素标品, 于室温中避光放置过夜, 随后进行萃取并计算回收率.采用内标法进行定量, 配置一系列浓度梯度(50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、50000 ng·L-1)以计算标准曲线.检出限(Limitation of detection, LOD)、定量限(Limitation of quantification, LOQ)分别为3倍和10倍信噪比(S/N).表 2为各目标抗生素的回收率及检出限等参数.
表 2(Table 2)
| 表 2 沉积物中5种典型医用抗生素的回收率、检测限及定量限 Table 2 Recovery, limit of detection and limit of quantification of five typical therapeutic antibiotics in sediment | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 2 沉积物中5种典型医用抗生素的回收率、检测限及定量限 Table 2 Recovery, limit of detection and limit of quantification of five typical therapeutic antibiotics in sediment
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2.4 反硝化作用潜势分析本研究采用乙炔抑制法进行泥浆培养实验来测量反硝化潜势.培养实验共设两组, 第一组是将40 g(湿重)新鲜沉积物与40 mL超纯水混合同时加入到220 mL棕色玻璃瓶中, 此组测得非修正反硝化潜势(unamended potential denitrification rate, UPDNR).由于高浓度乙炔在抑制N2O还原为N2的同时也会抑制硝化反应, 可能导致由于硝酸盐浓度限制而低估反硝化潜势.因此, 第二组培养实验将在超纯水中加入硝酸钠, 使NO3--N的浓度达到100 mg·L-1, 此组测得修正反硝化潜势(amended potential denitrification rate, APDNR)(Groffman et al., 2006).此外, 每一组实验均设置一个无乙炔添加的空白对照, 其中反硝化反应可正常进行.在培养进行前, 向培养瓶中通高纯氮气(3 min)以制造厌氧环境.随后, 向每个瓶中加入10 mL乙炔(99.99%), 摇匀后于室温下避光静置, 并随机取5 mL顶空气体作为起始样.静置培养2 h后, 取5 mL顶空气体样, 并使用气相色谱进行测定.理论上, 乙炔添加的培养瓶中N2O的产生速率等于对照瓶中N2O和N2产生速率的总和, 两者N2O产生速率的差值即为沉积物的UPDNR或APDNR, 结果以单位沉积物干重氮元素损失速率表示.
2.5 反硝化基因丰度和反硝化细菌群落分析将沉积物冷冻干燥后称取0.2 g按照试剂盒说明提取DNA, 随后用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的片段大小和质量, 并用Nano-drop分光光度计测定DNA的浓度和纯度, 存放于-80 ℃冰箱中备用.本研究选取了一种硝酸盐还原酶基因(narG)、两种亚硝酸盐还原酶基因(nirK、nirS)、一种氧化亚氮还原酶基因(cnorB)和一种一氧化二氮还原酶基因(nosZ)进行定量分析.
narG基因的扩增引物为narG1960m2f (5′-TAYGTSGGGCAGGARAAACTG-3′)和narG2050m2r(5′-CGTAGAAGAAGCTGGTGCTGT-3′)(López-Gutiérrez et al., 2004).nirK基因的扩增引物为NirK1F(5′-GGMATGGTKCCSTGGCA-3′)和NirK5R(5′-GCCTCGATCAGRTTRTGG)(Huang et al., 2011).nirS基因的扩增引物为cd3aF(5′-GTSAACGTSAAGGARACSGG-3′)和R3cd(5′-GASTTCGGRTGSGTCTTGA-3′)(Throb?ck et al., 2004).cnorB基因的扩增引物为cnorB2F(5′-GACAAGNNNTACTGGTGGT-3′)和cnorB6R(5′-GAANCCCCANACNCCNGC-3′)(Braker et al., 2015).nosZ基因的扩增引物为nos2F(5′- CGCRACGGCAASAAGGTSMSSGT-3′)和nosZ2R(5′-CAKRTGCAKSGCRTGGCAGAA -3′)(Jung et al., 2013).荧光定量PCR体系按照SYBR? Premix Ex TaqTM(TakaRa, 日本)说明书进行配置.PCR反应循环条件为：95 ℃预变性30 s, 随后95 ℃变性5 s, 57 ℃退火35 s(nosZ基因的退火温度为60 ℃, cnorB基因的退火温度为54 ℃), 72 ℃延伸30 s, 反应进行40个循环.用已知浓度的质粒进行梯度稀释, 并制作标准曲线.各基因的标准曲线的线性均较好(R2 > 0.99).基因的丰度均使用单位质量沉积物干重表示.
编码nirS细菌高通量测序：引物与定量PCR所用引物相同.PCR体系为20 μL：4 μL FastPfu缓冲液、2 μL dNTPs(5 μmol·L-1)、0.8 μL的正反引物(5 μmol·L-1)、0.4 μL FastPfu聚合酶(1 U·μL-1)和一定量ddH2O.PCR程序为：95 ℃预变性180 s, 随后95 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸60 s, 进行40个循环, 然后72 ℃延伸10 min.将每个位点的沉积物样品的3个平行样的PCR产物混合到一起进行琼脂糖电泳回收.回收纯化的PCR产物经过定量后, 送至上海美吉生物公司, 在Illumina Miseq平台(Illumina, 美国)进行上机测试.本文所用到的原始序列数据均上传至NCBI数据库中(BioProject：PRJNA527655).测序原始序列经过Fast QC软件进行初步质量控制, 并按照FunGenePipeline(http://fungene.cme.msu.edu/FunGenePipeline/)进行处理, 依据88%的氨基酸序列相似度聚类OTU和物种分类鉴定(Bowen et al., 2013).所有的样品序列均按照样品中序列最少的21000条进行随即抽平后进行下游分析.使用FunGene数据库对OTU注释后, 在属的分类水平上依据第二版《伯杰氏系统细菌手册》(Boone et al., 2001)对不同属的革兰氏阴、阳性进行鉴定.
2.6 统计分析本文所有的数据计算及统计分析均基于R语言(version 3.2.2, https://www.r-project.org/)的相关程序包来实现.基于聚类OTU的alpha多样性(Chao1、Shannon diversity (Shannon)、Pielou_evenness(Pielou)、Faith phylogenetic diversity(PD))指数和覆盖度(good′s coverage))均使用Phyloseq(version 1.22.3, https://joey711.github.io/phyloseq/)程序包计算.编码nirS细菌群落结构的空间差异用主成分分析(Principal component analysis, PCA)进行分析, 方差分解(Variation partitioning, VPA)用于分析环境因子矩阵和抗生素浓度矩阵对反硝化潜势以及相关基因的解释率, 上述分析均由vegan程序包(version 2.5-4, https://github.com/vegandevs/vegan)或R语言基本函数完成.层次分解(Hierarchical partitioning analysis, HPA)用于分析反硝化不同阶段关键基因对反硝化潜势变化的相对解释率, 使用hier.part程序包(version 1.0-4, https://cran.r-project.org/web/packages/hier.part/)实现.使用Pearson相关性分析各指标之间的相关性, 显著水平设为p < 0.05, 分析和绘图均使用ggcorrplot程序包(version 0.1.2, http://www.sthda.com/english/wiki/ggcorrplot)实现.
3 结果与分析(Results and analysis)3.1 南明河沉积物基本理化性质采样点沉积物的理化性质如表 3所示.南明河道中沉积物含有较高浓度的NO3-、NO2-和STN, 其平均浓度分别达到了(19.00±10.30) μg·g-1、(695.52±382.11) ng·g-1和(3.48±2.19) mg ·g-1.不同点位之间有较大差异, 其中位于城区中心段的NM4点位的NO2-的浓度(1100.44 ng·g-1), 比浓度最低的NM7(200.08 ng·g-1)高出5倍有余.污水处理厂排污口附近的NM1点的NO3-、NO2-和STN的浓度分别达到了19.76 μg·g-1、783.65 ng·g-1、4.00 mg·g-1, 均超过了平均浓度.南明河沉积物中STOC的平均浓度为(20.74±9.07) mg·g-1, 但是NM7和NM2的STOC浓度偏低.
表 3(Table 3)
| 表 3 沉积物理化性质 Table 3 The physiochemical parameters of the sediments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 3 沉积物理化性质 Table 3 The physiochemical parameters of the sediments
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3.2 沉积物中残留典型医用抗生素浓度和分布如图 2所示, 除了AMX以外, 其他4种目标抗生素均检出.AMX的浓度极低, 均低于LOD或LOQ, 因此不纳入到后续统计分析中.各点位沉积物中抗生素的浓度如图 4所示.4种检出抗生素中, NFX是检出浓度最高的抗生素, 其平均浓度为(537.13±212.69) ng ·g-1也显著大于其他4种抗生素(p < 0.01).NFX浓度的最高值出现在NM1中, 高达(894.40±12.02) ng·g-1, 最低值出现在NM7, 为(234±11.44) ng·g-1.其次是ETM, 平均浓度为(284.20±67.79) ng·g-1.而SMX和TC的检出浓度相对较低, 基本在100 ng·g-1以下.
图 2(Fig. 2)
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| 图 2 沉积物中典型医用抗生素的浓度 (低于检测限为 < LOD, 低于定量限为 < LOQ) Fig. 2Bar plot of concentrations of typical therapeutic antibiotics in sediments (< LOD indicates under LOD, < LOQ indicates under LOQ) |
图 4(Fig. 4)
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| 图 4 沉积物中反硝化相关基因拷贝数(a)及对反硝化潜势的相对重要性(b) Fig. 4The copies of denitrifying genes (a) and their relative contributions on UPDNR (b) |
3.3 沉积物的反硝化潜势南明河不同点位沉积物的反硝化潜势如图 3所示.沉积物中的UPDNR和APDNR的结果较为一致, 平均值分别为(17.02±2.52)和(17.77± 3.67) ng·g-1·h-1.并且两者数值分布具有极好的线性关系(位于1:1线附近), 线性拟合方程为y = 1.04x(R2 = 0.90).但是不同位点沉积物的反硝化潜势有较大的空间差异.其中NM7的反硝化潜势显著高于其他点位(p < 0.05), UPDNR和APDNR分别达到了(32.20±4.32)、(33.53±3.50) ng·g-1·h-1.而NM1的反硝化潜势最低, UPDNR和APDNR分别为(5.9±1.28)、(7.4±3.26) ng·g-1·h-1.其他点位的反硝化潜势比较接近, 基本在10~20 ng·g-1·h-1之间.由于APDNR和UPDNR无显著差异, 说明南明河沉积物中不存在硝酸盐限制导致的反硝化潜势被低估的问题.因此, 在后续统计分析中, 本文均使用UPDNR来代表沉积物中的反硝化潜势.方差分解显示, 环境因子和抗生素一共可以解释73.3%的UPDNR变化, 其中环境因子和抗生素分别可以单独解释12.3%和35.7%, 两者共同解释了25.3%.
图 3(Fig. 3)
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| 图 3 沉积物的UPDNR和APDNR(a)和环境因子与抗生素对UPDNR的方差分解分析(b) (R1、R2和R3为同一位点的平行样) Fig. 3The UPDNR and APDNR of sediments (a) and the proportion variations of UPDNR explained by environmental factors and typical therapeutic antibiotics (b) (R1, R2 and R3 are the tri-replicates in the same site) |
3.4 沉积物中反硝化相关功能基因丰度南明河沉积物中nirS、narG基因平均拷贝数分别为(14.54±7.23)×107和(15.86±4.61)×107 copies·g-1, 高于nirK((3.95±2.03)×107copies· g-1、cnorB((7.04±1.89)×107copies·g-1)和nosZ((2.72±0.55)×107copies·g-1)基因.功能基因丰度的空间差异很大, nirS的最高值(位于NM7)达到了(29.70±4.30)×107 copies·g-1, 次高值出现在NM2点为(18.2±2.49)×107 copies·g-1, 而最低值(位于NM1)仅有(7.20±0.75)×107 copies·g-1.与nirS相反, narG的最小值位于NM7((6.30±3.57)×107 copies·g-1)点.为分析5种反硝化基因与反硝化潜势之间的关系, 本研究进行了层次分解分析.结果表明, 5种基因总体对UPDNR的相对重要性为73%.其中仅nirS的相对重要性为34.7%, 其他4种基因相对重要性相加占14.5%.
3.5 沉积物中编码nirS基因细菌多样性及群落结构由于反硝化潜势主要与nirS基因相关, 为了研究编码nirS基因细菌群落对抗生素的响应以及和反硝化潜势的联系, 本课题对nirS基因进行了高通量测序.测序结果表明, 所有样品的覆盖度均高于98%(表 4), 说明测序的深度足以覆盖大多数的nirS细菌.沉积物中Shannon多样性指数在3.39~4.66之间, Pielou均匀度指数在0.34~0.49, PD系统发育多样性指数在26.99~54.56之间.3种多样性指数的空间分布一致, NM7的nirS细菌多样性最高, 而NM1的多样性最低.
表 4(Table 4)
| 表 4 沉积物中反硝化细菌群落的α多样性分析 Table 4 The alpha diversity analysis of denitrifying bacterial communities in sediments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 4 沉积物中反硝化细菌群落的α多样性分析 Table 4 The alpha diversity analysis of denitrifying bacterial communities in sediments
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为进一步获得nirS细菌的种属信息, 本研究对聚类所得的OTU进行了注释.在纲的分类水平上(图 5), 沉积物中编码nirS细菌群落主要由Alphaproteobacteria(9.65%)、Anaerolineae(2.87%)、Betaproteobacteria(42.76%)、Gammaproteobacteria(3.45%)、unclassified Bacteria(36.55%)和其他低丰度物种(平均丰度 < 0.1%).在属水平上, 反硝化细菌群落则主要由Alicycliphilus(1.19%)、Anaerolinea(2.87%)、Aromatoleum(13.01%)、Bordetella(16.56%)、Dechloromonas(10.73%)、Magnetospirillum(2.68%)、Paracoccus(1.59%)、Pseudomonas(3.45%)、Rhodobacter(5.38%)、Thiobacillus(1.54%)和大量的未注释菌种(36.55%), 其余低丰度物种仅占4.45%.革兰氏鉴定结果表明, 所有可注释的编码nirS细菌属均为革兰氏阴性菌.
图 5(Fig. 5)
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| 图 5 沉积物中反硝化细菌群落在纲(a)和属(b)水平上的物种组成 (-表示该属为革兰氏阴性) Fig. 5The compositions of denitrifying communities in sediments at class (a) and genus (b) level (-indicates this genus is a Gram-negative genus) |
为描述不同位点nirS细菌群落结构的差异, 本研究对编码nirS细菌的主要种属(相对丰度>1%)进行了主成分分析.结果表明, 第1、2主成分分别代表了74.6%和18.4%的总体差异, 累积解释了93.0%的总体差异, 说明这两个主成分已经可以代表不同样点编码nirS的细菌组成特征.如图 6所示, 除了NM1点的nirS细菌群落明显不同, 其他点位之间的nirS细菌群落结构非常相似.NM1中的Aromatoleum和Bordetella丰度明显高于其他点位, 而其他点位Bordetella和unclassified Bacteria的丰度较高.
图 6(Fig. 6)
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| 图 6 沉积物中编码nirS细菌群落结构(属水平)主成分分析 Fig. 6Principal component analysis of nirS encoding bacterial communities′ structure at genus level |
3.6 相关性分析为研究不同参数之间的线性相关关系, 本研究对沉积物中理化性质、抗生素浓度、反硝化潜势、反硝化基因丰度、编码nirS细菌多样性和群落结构进行了相关性分析, 其中群落结构用主成分分析的第1、2主成分代表.结果表明, 4种抗生素中NFX和TC与UPDNR显著负相关, 而SMX和ETM与其无显著相关关系.同时, NFX和nirS基因丰度以及编码nirS细菌多样性指数均成显著负相关.然而, NFX和编码nirS细菌群落结构的主成分轴并无显著相关性, 而SMX和TC则与其显著相关.
图 7(Fig. 7)
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| 图 7 沉积物中理化性质、抗生素浓度、反硝化潜势、反硝化基因丰度、编码nirS细菌多样性和群落结构相关关系分析(图中仅显示相关关系显著 (p < 0.05)的相关系数) Fig. 7Correlations heatmap of physiochemical parameters, concentrations of antibiotics, denitrifying genes abundance, diversity indices and community composition of nirS encoding bacteria in sediments (only the significant correlations′ factors (p < 0.05) were shown in the graph) |
4 讨论(Discussion)4.1 残留抗生素对反硝化潜势的抑制作用抗生素、沉积物的理化性质以及河流的水文气象条件等因素均会影响抗生素在河流沉积物中的吸附解析、水解、光解和微生物降解过程(Manzetti et al., 2014), 导致沉积物中不同抗生素的残留浓度差异很大.南明河沉积物中, 除AMX极易水解导致难以检出, 其余抗生素均在所有样点中检出, 并且浓度基本符合NFX>ETM>TC>SMX的顺序.NFX具有很高的Kd值(230~6310 L· kg-1), 非常容易吸附在沉积物上(Dinh et al., 2017)；另一方面, NFX较难被生物降解, 在环境中的半衰期较长(1155 d), 这些特性使NFX容易积累在沉积物中并达到较高的浓度(DeVries et al., 2016).Li等(2018)发现在珠江流域珠海河道的沉积物中NFX浓度高达444 ng·g-1.Yang等(2010)也发现珠江流域广州市区段的沉积物NFX浓度达到了1120 ng·g-1.这些结果说明, 城市河道中高浓度NFX污染是共性问题.TC和SMX虽然也有较高的Kd值, 但是其在环境中很快就被微生物降解, 所以难以在环境中积累(Chang et al., 2015).而ETM虽然不易生物降解, 但是其Kd值(9.35~309 L·kg-1)较小, 易于随水流迁移扩散, 因此残留浓度比NFX低(Schafhauser et al., 2018).除了抗生素迁移转化因素外, 抗生素的污染来源也会影响抗生素的残留浓度和空间分布.NM7位于核心城区上游, 污染来源主要是雨水和径流, 因此残留抗生素浓度较低.而位于污水处理厂排污口处的NM1, 由于持续的受到含有抗生素的污水、处理厂尾水以及残留污泥的影响, 沉积物中累积的抗生素要高于其他区域.尤其是NM1点的NFX浓度高达(894.40±12.02) ng ·g-1, 如此高的浓度极有可能对反硝化过程产生抑制.
泥浆培养实验表明, NM7的反硝化潜势最大, 近郊、核心城区次之, 而NM1最小.说明随着抗生素浓度升高反硝化潜势有降低趋势.方差分解显示, 仅抗生素即可解释35.7%的UPDNR变化, 并且和环境因子共同解释了25.3%.这些结果表明, 南明河沉积物中残留抗生素是影响反硝化潜势的主要因素.在先前的研究中, 不同浓度范围的NFX、SMX、ETM和TC均被报道过会对反硝化作用产生抑制作用.但大多数研究只研究了某一种抗生素对反硝化作用的抑制, 而多种不同浓度范围的抗生素对反硝化作用的综合影响仍不清楚.在本研究中, 发现4种目标抗生素中仅NFX和TC与UPDNR显著负相关, 而SMX和ETM与UPDNR无显著相关关系.这些结果说明, 并非所有的检出抗生素均会对反硝化作用产生抑制效果, 而是取决于抗生素的浓度大小和对反硝化细菌的抑菌活性.大量研究表明, 沉积物中的反硝化细菌主要是革兰氏阴性细菌(Verbaendert et al., 2011), 因此其更容易受到针对革兰氏阴性菌的抗生素的抑制.虽然本文所检出的4种抗生素均为广谱抑菌型抗生素, 但不同抗生素的抗菌谱仍有所差异.ETM主要抑制革兰氏阳性细菌, 而NFX对革兰氏阴性菌的抑菌效果极强, 并且高浓度的NFX有急效杀菌活性(Khan et al., 1982；Schafhauser et al., 2018).SMX和TC的抗菌谱无明显的偏向性, 但是两者的残留浓度较低(<100 ng·g-1), 并且两者对革兰氏阴性菌的抑制活性要远低于NFX(Khan et al., 1982).Kang等(2018)发现, 低浓度SMX对活性污泥的反硝化功能并无影响.Chopra等(2001)也认为由于抗性基因的扩散, 低浓度的TC对细菌的抑菌效果已经大幅减弱.因此, TC和UPDNR的显著相关关系可能是由于其和NFX共线性所导致的假阳性.综上所述, 本研究认为南明河中反硝化潜势主要是受到了高浓度NFX的抑制.
4.2 残留抗生素抑制反硝化潜势的微生物机制由于抗生素的抑菌活性导致反硝化细菌丰度、多样性降低或是群落结构的改变是引起反硝化潜势的下降的主要微生物机制.但是需要指出的是, 反硝化作用是通过含有4类不同酶的微生物群落协同合作来完成的(Devol, 2015), 参与不同阶段的微生物对抗生素的响应并不一定相同.Zou等(2018)发现氧四环素对反硝化潜势的抑制作用主要是通过抑制nirK和nosZ基因而导致的, 其对nirS和narG并没有抑制作用.为了研究NFX是通过抑制反硝化过程哪些阶段从而抑制反硝化作用, 本研究同时测定了narG、nirS、nirK、cnorB、nosZ, 涵盖了反硝化过程4个阶段的关键基因.分析结果表明, 南明河沉积物反硝化潜势主要受到nirS基因丰度变化的影响(图 4), 并且仅有nirS与NFX有显著负相关关系(图 10).Yin等(2017)研究不同抗生素组合对反硝化反应的影响时也发现, NFX显著抑制反硝化速率的同时显著抑制了沉积物中的nirS而非nosZ, 这与本文结果一致.这说明, 高浓度NFX对反硝化潜势抑制作用主要是通过抑制编码nirS基因细菌主导的亚硝酸盐还原阶段而实现的.通过进一步对编码nirS的细菌进行测序分析, 本研究发现南明河中nirS细菌群落中可注释的种属全部都是革兰氏阴性细菌.而由上文可知, 高浓度NFX对革兰氏阴性菌有极强的抑制和杀灭的效果.这种针对革兰氏阴性菌的强杀菌效果是导致南明河编码nirS细菌的丰度和多样性显著下降的主要原因.然而, 与nirS不同, 大量研究表明编码narG、nosZ、cnorB的细菌中有一些是隶属于厚壁菌门的革兰氏阳性菌(Verbaendert et al., 2011).即使是功能和nirS相近的nirK, 也常在一些革兰氏阳性菌中检出(Heylen et al., 2006).这些革兰氏阳性菌可能在同功能的革兰氏阴性菌被NFX抑制时增殖, 从而维持相应基因的丰度和功能, 最终表现为NFX对nirS的“特异性”抑制.
为进一步探讨编码nirS的细菌种群组成对NFX的胁迫的响应, 以及和反硝化潜势的关系.本研究对相对丰度>1%的种属进行主成分分析, 并用第1、2主成分代表群落总体变化进行了相关性分析.结果表明, 除NM1的群落组成发生了明显变化, 其他区域细菌群落结构较为相似, 并且群落组成和NFX、UPDNR以及nirS基因丰度均无线性相关关系.但是这些结果并不能说明细菌群落结构不受到NFX的影响, 或者和UPDNR没有联系.一方面, 由于现有数据库和分析手段限制, 在测序、聚类和注释的过程中会损失一部分的细菌群落多样性, 可能影响最终分析结果(Lycus et al., 2017).另一方面, 反硝化细菌不同种群之间存在着复杂的种间关系, 其对抗生素的响应机制仍不清楚.Kleineidam等(2010)也发现磺胺嘧啶会抑制反硝化作用和nirS基因丰度, 但于此同时nirS细菌群落结构却并未发生变化.在后续研究中, 可以通过宏基因组手段对nirS编码细菌的抗性基因进行同步分析, 来深入研究其响应机制.
5 结论(Conclusions)1) 南明河沉积物中除AMX低于LOQ以外, 其他4种目标抗生素均检出, 浓度从大到小依次为NFX>ETM>TC>SMX.其中NFX的最高浓度达到了(894.40±12.02) ng·g-1, 与其他城市河道类似, 说明严重的NFX污染是城市河道的共性问题.高浓度的NFX对南明河沉积物中反硝化潜势有显著抑制作用.
2) NFX对反硝化潜势抑制作用主要是通过抑制编码nirS基因细菌主导的亚硝酸盐还原阶段而实现的.其主要原因是NFX对革兰氏阴性菌有极强的抑菌活性, 而南明河中编码nirS基因细菌均为革兰氏阴性, 从而导致NFX对nirS的“特异性”抑制.但是由于缺乏抗性基因的相关数据, 编码nirS基因细菌不同种群对NFX的响应机制仍不清楚.
3) 本文首次揭示了城市河道沉积物中抗生素污染对沉积物反硝化作用的抑制.随着城市河道抗生素污染和氮负荷超标的问题日益严重, 急需在更大的时空尺度上开展研究, 并结合宏基因组等技术手段深入研究抗生素污染对反硝化过程的影响及其反硝化细菌的响应机制, 为科学评估抗生素污染的微生态效应提供理论依据.
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