液-液相分离（Liquid-liquid phase separation, LLPS）是细胞内很多重要生命过程的关键驱动机制。在真核细胞中，LLPS能让各种相关的生物分子富集，帮助细胞形成各种无膜结构，如P颗粒（P-granules）、核仁（nucleoli）、异染色质（heterochromatin）和应激颗粒（stress-granules）等，从而实现提高生化反应效率，或是在压力环境下保护mRNA和蛋白质等重要细胞成分。LLPS具有可逆性并对环境因素高度敏感，近些年被证明是细胞响应外界压力及快速动态划分细胞空间结构的重要机制。与真核细胞相比，原核细胞内部更为拥挤并缺少有膜细胞器。液-液相分离机制在原核细胞中发挥了怎样的作用还存在较多未知。


论文截图
北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）、北京未来基因诊断高精尖创新中心（ICG）、生命科学学院白凡研究员课题组曾于2018年在Molecular Cell杂志上发表题为“ATP-dependent dynamic protein aggregation regulates bacterial dormancy depth critical for antibiotic tolerance”的研究论文，报道了细菌中存在的一种可动态聚集和分散的新型细胞内结构——蛋白质沉淀聚集体（aggresomes）。Aggresomes在显微镜明场下呈现为分布在细菌胞内的小黑点，在细胞遭遇外界压力（营养缺乏、抗生素攻击）时形成，促进细胞进入休眠状态；在外界环境改善后，aggresomes被清除，细菌重新恢复生长。围绕细菌aggresomes形成的微观机制，2021年10月20日，白凡课题组与英国约克大学的Mark C. Leake教授课题组合作在Science Advances杂志上发表题为“Membraneless organelles formed by liquid-liquid phase separation increases bacterial fitness”的研究论文，通过单分子高分辨率荧光显微追踪和多尺度数学建模，证明aggresomes是通过液-液相分离机制形成的无膜细胞器，在细菌对抗逆境和抗生素耐药中发挥了关键作用。

图1 使用单分子高分辨率荧光显微成像技术研究细菌蛋白质沉淀聚集体的形成机制
研究团队首先选择了三种在aggresomes中富集的蛋白质（HslU, Kbl, AcnB）作为研究对象，分别为其构建带有荧光标记的融合蛋白。通过在细菌内过表达HokB（一种细菌Toxin），降低细菌细胞内ATP水平，从而人为诱导aggresomes的形成（图1）。实验结果显示，三种蛋白在加入aggresomes的过程中展现出不同的动力学特征，其中HslU最快形成荧光聚集体，随后是Kbl，而AcnB最晚。
研究者选择了响应速度最快的HslU蛋白作为aggresomes的生物标记，通过单分子荧光追踪来探索aggresomes形成的时空动态特征。运用Slimfield单分子追踪技术（图1C），研究者获得了单个HslU-EGFP分子在aggresomes内部的运动轨迹和平均扩散系数，发现HslU蛋白在aggresomes内部能够自由移动，由此说明aggresome内并非固态；与此同时，在显微镜下观察aggresomes形成的动态过程，发现在aggresomes形成早期，细胞内不同aggresomes之间会发生碰撞—融合过程，两个较小的聚合体能够融合形成一个更大的聚合体（图2C），这也说明aggresomes具有液滴状性质；研究者进一步使用了荧光漂白恢复技术（FRAP）来定量aggresome内部蛋白质分子的流动性。当使用高强度会聚激光淬灭掉aggresome中一半的荧光蛋白后，可以观察到被淬灭区域的荧光信号缓慢回升（图2D，2E），证明aggresomes内部EGFP荧光分子能够进行自由交换。以上多重证据表明，沉淀聚集体内的蛋白质并不是紧密聚合，而是处于可部分自由运动的液体状态。进一步，通过细菌胞内ATP测量，研究团队发现细菌胞内ATP浓度下降而触发的液-液相分离是aggresomes形成的核心机制。

图2 液-液相分离驱动细菌蛋白质沉淀聚合体的形成
研究团队使用Individual-Protein-Based Model（IPBM）模拟了蛋白质沉淀液滴逐渐聚集而发生相分离形成较大无膜细胞器的过程。通过对细菌胞内蛋白质的扩散—碰撞—聚集过程进行Monte-Carlo模拟，模型可以定量解释和验证之前在实验中所观察到的结果（图3）。该数学模型不仅解释了aggresomes形成的机制，也确定了aggresomes形成过程中多个重要的动力学参数。

图3 数学模型模拟aggresomes形成的精细过程
研究团队证明在多种常见细菌中降低细胞内ATP均可诱导aggresomes的产生，暗示aggresomes的形成可能是细菌对抗外界压力的一种普适反应。为了探究aggresomes的生物学功能，研究团队通过化学小分子阻断和基因敲除的手段构建出让aggresomes无法正常形成的缺陷型菌株，与野生型菌株相比，缺陷型在抗生素及噬菌体攻击下更容易死亡。种种证据表明，aggresomes的形成在细菌对抗逆境和抗生素耐药中发挥了关键的生物学作用。
本研究拓展了液-液相分离机制在原核生物中的应用，发现细菌细胞利用相分离来动态调整蛋白质在细胞质中的时空分布，增强细菌对抗外界环境压力的能力和抗生素耐受。特别地，本研究揭示的液-液相分离对细胞内ATP浓度的响应是一种全新的调控机制，值得更进一步的研究。
北京大学生物医学前沿创新中心、生命科学学院金心博士，博士研究生罗昕玮，英国约克大学物理系Ji-Eun Lee博士，Charley Schaefer博士为本论文的并列第一作者。白凡和Mark C. Leake为本论文的共同通讯作者。该研究得到了来自国家自然科学基金委、北京未来基因诊断高精尖创新中心、北京大学国家蛋白质科学中心的支持。