梁瑞金, 冼雪芳, 丁玲, 周伶伶
深圳市龙华区人民医院 医学影像科, 广东 深圳 518109
2019-08-17 收稿, 2019-09-16 录用
基金项目: 深圳市龙华区创新资金项目（2017143）资助
^*通讯作者: 冼雪芳

摘要: 选择2017年12月~2018年11月我院收治的100例经临床确认的中毒性休克患者的临床资料，所有患者均进行CT血流灌注成像检查，原始图像经工作站自带的脑灌注软件处理后产生灌注参数伪彩图像，测量病变侧及对侧大脑半球多个解剖部位的脑血流量（CBF）、脑血容量（CBV）、平均通过时间（MTT）、达峰时间（TTP）等灌注参数，计算病变侧/对侧的对比值（rCBF、rCBV、rMTT、rTTP）。并使用免疫组学方法检测不同患者外周血及脑脊液中血脑屏障通透性与紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1、JAM-1、NOS和NSE的表达水平变化，并比较灌注参数与血脑屏障标志蛋白水平的相关性。结果显示，观察组患者外周血及脑脊液rCBF显著下降，rTTP降低，rPS升高（P < 0.05），但两组rMTT、rCBV比较，差异无统计学意义（P>0.05）。观察组患者外周血及脑脊液claudin-5、occludin、ZO-1、NOS显著下降，JAM-1、NSE明显升高（P < 0.05）。观察组claudin-5、occludin、ZO-1和NOS与rCBF、rTTP呈正相关，与rPS呈负相关；JAM-1和NSE与rCBF、rTTP呈负相关，与rPS呈正相关。rCBF、rTTP、JAM-1、NSE与神经元损伤程度呈正相关，claudin-5、occludin、ZO-1和NOS与神经元损伤程度呈负相关。上述结果表明CT血流灌注参数结合血脑屏障标志蛋白可有效评估中毒性休克患者神经元损伤程度，值得推广和应用。
关键词: CT血流灌注成像血脑屏障标志蛋白中毒性休克神经元损伤
Value of CT Perfusion Combined with Blood-brain Barrier Marker Protein in Evaluating Neuronal Damage in Patients with Toxic Shock
LIANG Ruijin, XIAN Xuefang, DING Ling, ZHOU Lingling
Medical Imaging Department, The People's Hospital of Longhua, Shenzhen 518109, Guangdong, P. R. China
^*Corresponding author: XIAN Xuefang
Abstract: The clinical data of 100 patients with clinically confirmed toxic shock admitted to our hospital from December 2017 to November 2018 were selected. All the patients underwent CT perfusion imaging.The original images were processed by the perfusion software in the workstation to produce pseudo-color images of perfusion parameters. Cerebral blood flow (CBF), cerebral blood volume (CBV), mean transit time (MTT), peak time (TTP) of the lesion side and the contralateral cerebral hemisphere was measured, and other perfusion parameters(rCBF, rCBV, rMTT, rTTP) were used to calculate the relative ratio of lesion side to opposite side. The expression of claudin-5, occludin, ZO-1, JAM-1, NOS and NSE in different patients were detected by immunohistochemical method, and the correlation between the protein levels and the perfusion paraneters was compared. The results showed that rCBF in peripheral blood and cerebrospinal fluid decreased significantly, rTTP decreased and rPS increased significantly in the observation group (P < 0.05), but there was no significant difference in rMTT and rCBV between the two groups (P>0.05). The claudin-5, occludin, ZO-1 and NOS in peripheral blood and cerebrospinal fluid of the patients in the observation group decreased significantly, while JAM-1 and NSE increased significantly (P < 0.05). In the observation group, claudin-5, occludin, ZO-1 and NOS were positively correlated with rCBF and rTTP, negatively correlated with rPS; JAM-1 and NSE were negatively correlated with rCBF and rTTP, and positively correlated with rPS. rCBF, rTTP, JAM-1 and NSE were positively correlated with neuronal injury, while claudin-5, occludin, ZO-1 and NOS were negatively correlated with neuronal injury. It is suggested that CT blood perfusion combined with blood brain barrier marker protein can effectively evaluate neuronal damage in patients with toxic shock, and it is worth popularizing and applying.
Key words: CT perfusion imagingblood-brain barrier marker proteintoxic shockneuron injury
脓毒性脑病与炎症介质引起脑血流动力学改变、血脑屏障损伤、脑水肿、神经元功能异常有关^{[1, 2]}。血脑屏障内皮细胞紧密连接蛋白分子是研究脑出血后脑水肿发生、发展机制的关键标志物。CT灌注成像能够在活体测量脑组织灌注状况和水肿程度，经过原始图像的后处理和计算可以得到相对脑血容量(rCBV)、相对脑血流量(rCBF)、相对平均通过时间(rMTT)、毛细血管表面通透性(PS)等灌注指标，从而判断脑水肿和血脑屏障破坏的程度^{[3, 4]}。本研究旨在通过CT灌注成像评估中毒性休克患者神经元损伤程度，并且分析灌注指标与外周血和脑脊液中血脑屏障通透性与紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1、JAM-1、NOS和NSE表达水平变化的相关性，以期评估CT血流灌注结合血脑屏障标志蛋白对中毒性休克患者神经元损伤的评价价值，为早期预测、诊断和治疗提供新靶点。
1 资料与方法1.1 一般资料选取2017年12月~2018年11月于我院急诊科门诊及住院的中毒性休克患者100例为调查对象，其中，男60例、女40例，年龄37~64岁，平均(52.13±4.09)岁，入选患者符合2012年国际脓毒症治疗指南中关于严重脓毒症与脓毒性休克的诊断标准。根据患者神经元损伤级标准，其中I级36例，Ⅱ级40例，Ⅲ级24例。同时选择同期来我院体检的健康者98例为对照组，其中男59例，女29例，年龄35~70岁，平均(53.25±4.17)岁。两组研究对象一般资料比较，差异无统计学差异(P＞0.05)。
1.2 神经元损伤分级标准0级：无神经元坏死；Ⅰ级：散在单个神经元坏死或小团细胞坏死；Ⅱ级：散在的成团细胞坏死；Ⅲ级：几乎所有细胞都存在坏死。
1.3 方法CT脑灌注成像的设备采用美国GE公司生产的Revolution 256 CT。首先对患者行常规头颅CT扫描，其次对患者行头颅灌注扫描，所有调查对象CT的常规扫描及灌注扫描均在入院后7 d内完成。让患者平躺，呈解剖位，使用高压注射器经肘前静脉或经静脉留置针注射碘海醇，浓度为350 mgI/mL或400 mgI/mL，注射量为40~50 mL，流速为4~5 mL/s，随后推入生理盐水45 mL，流速为5 mL/s。扫描范围：以基底节为中心扫描上下脑组织，层厚、层间隔均为5 mm，采用非螺旋扫描，在注射后8 s开始扫描，每组间隔2 s，共扫描18组，50 s扫完。其他参数有：分辨率标准，视野250 nm，电压100 kV，电流300 mA，旋转时间0.5 s。所有调查对象的原始灌注数据均采用GE Revolution 256 CT所带工作站的AW4.6的功能分析软件Perfusion 4D进行后处理。将重建的图像传送到GE AW4.6工作站，由一名高年资神经放射诊断医生在不了解患者相关临床资料的情况下对图像进行分析，对其进行自动闭值定义，去除骨及空气的影响，软件自动产生脑血流量(CBF)、脑血容量(CBV)、平均通过时间(MTT)、达峰时间(TTP)等灌注参数，计算病变侧/对侧相对比值(rCBF、rCBV、rMTT、rTTP)及血脑屏障通透性参数(rPS)。
1.4 血脑屏障标志蛋白检测利用ELISA、免疫组化和免疫印记法检测外周血和脑脊液中血脑屏障通透性与紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1、JAM-1、NOS和NSE表达变化。使用抗人claudin-5抗体及其免疫组化试剂盒(美国abcam公司)，抗人occludin、ZO-1、JAM-1抗体及其免疫组化试剂盒(上海长岛生物技术有限公司)。NOS和NSE试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。均严格按操作步骤进行测定。
1.5 统计学方法采用SPSS 20.0统计学软件分析数据，对于计数资料以n(%)表示，用卡方检验；计量资料用(x±s)表示，组间对比用t检验。P < 0.05时，表示差异有统计学意义。
2 结果2.1 两组患者CT血流灌注相关指标比值比较观察组患者外周血及脑脊液rCBF、rTTP较对照组显著降低，rPS升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，且rCBF、rTTP随着神经元损伤程度的加重呈逐渐降低趋势，rPS呈增高趋势(P＜0.05)，但两组间及不同神经元损伤程度的患者相比较，rMTT与rCBV差异无统计学意义(P＞0.05)，见表 1、表 2和图 1。
表1

表 1 两组患者外周血中CT血流灌注相关指标比值比较 rCBF rCBV rMTT rTTP rPS 对照组 1.01±0.02 1.14±0.12 1.23±0.07 1.24±0.08 1.33±0.74 观察组 0.73±0.13a 1.09±0.11 1.17±0.06 1.04±0.04a 2.24±1.02a Ⅰ级 0.81±0.11a 1.07±0.11 1.19±0.05 1.10±0.05a 1.87±0.95a Ⅱ级 0.72±0.12ab 1.04±0.08 1.15±0.06 1.03±0.04ab 2.01±1.12ab Ⅲ级 0.61±0.13abc 1.03±0.10 1.11±0.05 0.90±0.03abc 2.33±1.09abc a.与对照组比较，P＜0.05；b.与观察组内Ⅰ级比较，P＜0.05；c.与Ⅱ级比较，P＜0.05

表 1 两组患者外周血中CT血流灌注相关指标比值比较

表2

表 2 两组患者脑脊液中CT血流灌注相关指标比值比较 rCBF rCBV rMTT rTTP rPS 对照组 3.54±0.04 4.44±0.07 2.84±0.13 2.89±0.26 3.05+1.14 观察组 1.15±0.08a 3.29±0.05 2.66±0.22 2.36±0.35a 7.88±1.07a Ⅰ级 1.22±0.13a 3.84±0.12 2.71±0.18 2.49±0.44a 9.06±0.99a Ⅱ级 0.88±0.10ab 3.62±0.09 2.63±0.19 2.01±0.39ab 11.05±1.02ab Ⅲ级 0.71±0.09abc 3.49±0.10 2.58±0.22 1.83±0.03abc 14.27±1.15abc a.与对照组比较，P＜0.05；b.与观察组内Ⅰ级比较，P＜0.05；c.与Ⅱ级比较，P＜0.05

表 2 两组患者脑脊液中CT血流灌注相关指标比值比较

图 1

图 1 脑部血液灌注CT图a.对照组；b.观察组CT血液灌注显示PS较高；c.观察组CT血液灌注显示PS较低

2.2 两组患者紧密连接蛋白相关指标比较观察组患者外周血及脑脊液claudin-5、occludin、ZO-1、NOS水平较对照组显著下降，JAM-1、NSE较对照组明显升高，且随着神经元损伤程度的加重，外周血及脑脊液claudin-5、occludin、ZO-1、NOS水平逐渐下降，JAM-1、NSE逐渐升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表 3和表 4。
表3

表 3 外周血紧密连接蛋白相关指标比较 claudin-5 occludin ZO-1 JAM-1 NOS NSE 对照组 85.64±10.13 193.08±7.17 118.04±6.62 1.33±0.74 1.04±0.47 20.88±5.36 观察组 56.52±7.03 90.33±4.80 76.43±6.07 2.24±1.02 0.53±0.28 39.41±7.35 Ⅰ级 68.39±8.62a 118.43±8.12a 89.22±8.34a 1.90±0.95a 0.81±0.35a 28.86±9.95a Ⅱ级 55.47±7.14ab 89.74±4.02ab 73.49±6.00ab 2.22±1.04ab 0.51±0.19ab 37.65±6.76ab Ⅲ级 42.38±6.97abc 69.82±2.13abc 61.35±5.09abc 2.97±0.93abc 0.39±0.09abc 49.53±5.01abc a.与对照组比较，P＜0.05；b.与观察组内Ⅰ级比较，P＜0.05；c.与Ⅱ级比较，P＜0.05

表 3 外周血紧密连接蛋白相关指标比较

表4

表 4 脑脊液紧密连接蛋白相关指标比较 claudin-5 occludin ZO-1 JAM-1 NOS NSE 对照组 247.23±27.68 334.11±42.32 53.08±44.57 59.33±10.74 45.64±10.86 122.23±13.68 观察组 125.94±15.25 187.35±24.02 39.27±32.66 88.24±11.02 26.12±5.35 165.94±16.25 Ⅰ级 184.21±21.64a 115.72±31.56a 47.38±40.17a 64.73±7.69a 32.73±8.47a 149.71±11.33a Ⅱ级 119.36±17.62ab 189.30±22.15ab 36.74±30.09ab 85.38±10.02ab 25.86±6.21ab 163.44±18.84ab Ⅲ级 97.43±13.47abc 154.82±16.46abc 27.45±25.84abc 97.42±15.63abc 19.22±3.15abc 179.82±19.23abc a.与对照组比较，P＜0.05；b.与观察组内Ⅰ级比较，P＜0.05；c.与Ⅱ级比较，P＜0.05

表 4 脑脊液紧密连接蛋白相关指标比较

2.3 紧密连接蛋白表达与CT血流灌注参数的相关性分析观察组claudin-5、occludin、ZO-1和NOS与rCBF、rTTP呈正相关，与rPS呈负相关；JAM-1和NSE与rCBF、rTTP呈负相关，与rPS呈正相关，见表 5。
表5

表 5 紧密连接蛋白表达与CT血流灌注参数的相关性分析 指标 claudin-5 occludin ZO-1 JAM-1 NOS NSE rCBF 0.885* 0.679* 0.834* -0.642* 0.693* -0.873* rCBV 0.068 0.074 0.080 -0.082 0.064 -0.078 rMTT 0.085 0.063 0.088 -0.097 0.068 -0.106 rTTP 0.423* 0.536* 0.396* -0.743* 0.633* -0.471* rPS -0.641* -0.683* -0.672* 0.706* -0.379* 0.425* *.P＜0.05

表 5 紧密连接蛋白表达与CT血流灌注参数的相关性分析

2.4 多元Logistic回归分析通过单因素分析结果，筛选差异具有统计学意义的影响因素作为自变量，以神经损伤程度为因变量，进行多元Logistic回归分析。结果证实了CT血流灌注参数及紧密连接蛋白表达水平是评价患者神经元损伤的相关指标，而rCBF、rTTP、JAM-1、NSE与神经元损伤程度呈正相关，claudin-5、occludin、ZO-1和NOS与神经元损伤程度呈负相关，见表 6。
表6

表 6 多元Logistic回归分析 指标 β值 标准误 OR值 95%CI P值 v rCBF 0.065 0.011 1.009 1.002~1.016 0.001 1 rTTP 0.094 0.064 1.146 1.103~1.326 0.000 1 rPS -0.053 0.017 0.975 0.932~0.994 0.003 1 claudin-5 -0.046 0.012 1.029 1.006~1.053 0.000 1 occludin -0.060 0.035 1.204 1.203~1.586 0.000 1 ZO-1 -0.224 0.068 1.305 0.781~2.484 0.000 1 JAM-1 0.059 0.022 1.186 1.021~1.374 0.001 1 NOS -0.072 0.023 1.082 1.035~1.117 0.001 1 NSE 0.324 0.071 1.482 1.108~3.449 0.004 1

表 6 多元Logistic回归分析

3 讨论脓毒症(Sepsis)是机体对感染产生的宿主失调反应，会引起危及生命的器官功能障碍，是诱发脓毒性休克和多脏器功能障碍综合征的主要原因^{[5, 6]}。及时掌握脓毒症病情严重程度，对预后进行早期预测，有利于临床医师制定合理的治疗方案。
脓毒症发病率逐年增高，由于目前尚无特异的治疗方法，而早发现、早诊断、早治疗对改善脓毒症患者的预后有着十分重要的作用^[7]。研究显示^[8]，CT血流灌注在患者脑损伤出现症状30 min后显示病灶，异常灌注区表现为CBF下降，CBV正常或I级升高、严重时下降，MTT基本正常或延长，TTP延长或消失。常规检査一般要到损伤后期才会显示病灶，对于超急性期与急性期的脑损伤，应用常规检查一般很难发现缺血病灶，因此不能用作早期诊断。故本研究系统观察CT血流灌注指标rCBF、rCBV、rTTP、rMTT、rPS的变化，分析了它们对脓毒症休克的评估价值。研究结果显示，在脓毒症休克患者外周血及脑脊液中，rCBF、rCBV、rTTP、rMTT均下降，rPS升高，但rMTT、rCBV比较差异无统计学意义(P＞0.05)，表明CBF与CBV变化不一致，CBV变化幅度小，这主要是由于脑血管自身具有调节和代偿的能力。脓毒性休克患者普遍存在着异常灌注区CBV正常或Ⅰ级升高，说明这些患者虽然脑灌注发生了异常，但脑储备功能尚完善，临床治疗中应及时挽救脑组织^{[9, 10]}。同时结果显示，外周血rCBF、rCBV、rTTP、rMTT、rPS的变化与脑脊液中的变化不相平衡，表明脑脊液中CT灌注指标可能与外周血的灌注指标不相关，中枢神经与外周血的免疫调节可能是相互分隔的。
有报道显示^[11]，脑损伤3 h后，血浆蛋白开始出现外渗，血-脑脊液屏障出现开放；再灌注达到6~12 h，血-脑脊液屏障通透性逐渐增加；再灌注达到24~48 h，血-脑脊液屏障通透性会出现明显增高并达到高峰；再灌注达到72~120 h，血-脑脊液屏障通透性会逐渐减小^{[12, 13]}。紧密连接是维持上皮细胞内环境稳定的重要结构，具有封闭细胞间隙，维持细胞黏附性、极性和通透性，以及辅助信号传递蛋白调节细胞增殖、分化等作用，而Claudins蛋白是紧密连接结构与功能的最重要组成成分。有研究显示^{[14, 15]}，Claudins蛋白的异常表达将破坏上皮渗透屏障，使细胞极性丧失，细胞间黏附力下降。本研究结果显示，观察组患者外周血及脑脊液claudin-5、occludin、ZO-1、NOS显著下降，JAM-1、NSE明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。这主要是由于在脑微血管内皮细胞中，Claudins-5、occludin及JAM-1表达增加，与血脑屏障功能密切。而ZO-1蛋白表达水平的高低与脑损伤程度具有高度相关性^{[16, 17]}，这与本研究结果相符。NSE是神经元细胞所特有的一种酸性蛋白酶，是显示神经细胞损伤的最敏感标志物，是神经元损害的标志性酶，一直被认为是脑制备再灌注损伤的保护性因素之一^[18]。CT血流灌注参数与血脑屏障标志蛋白相关指标比较发现，观察组claudin-5、occludin、ZO-1和NOS与rCBF、rTTP呈正相关，与rPS呈负相关；JAM-1和NSE与rCBF、rTTP呈负相关，与rPS呈正相关。且rCBF、rTTP、JAM-1、NSE与神经元损伤程度呈正相关，claudin-5、occludin、ZO-1和NOS与神经元损伤程度呈负相关。由此可知，CT血流灌注指标中rCBF、rTTP、rPS是诊断中毒性休克患者神经元损伤的重要指标；而血脑屏障标志蛋白中claudin-5、occludin、ZO-1、NOS、JAM-1和NSE在中毒性休克患者表达中均异常，在脑脊液中的表达较血清中更加敏感。
综上所述，CT血流灌注参数结合血脑屏障标志蛋白可有效评估中毒性休克患者神经元损伤程度，值得推广和应用。

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