摘要： 【目的】探究热激蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)基因在美国白蛾Hyphantria cunea抵御高温胁迫过程中的作用，为揭示美国白蛾的扩散机制以及预测潜在分布区提供理论支撑。【方法】利用PCR技术克隆美国白蛾HSP70基因，并进行生物信息学分析；利用qPCR技术检测新蜕皮的美国白蛾4龄第2天幼虫在25, 30, 35和40℃处理下HSP70基因的表达特性；构建美国白蛾HSP70的原核表达载体，并在大肠杆菌Escherichia coli BL21感受态细胞中诱导表达该蛋白，利用Ni2+-His柱纯化蛋白，并通过Western blot验证该蛋白；利用体外实验测定原核表达获得的重组蛋白在高温胁迫下的ATP酶活性。【结果】克隆获得美国白蛾2条HSP70基因HcHSP70(GenBank登录号: MT995848)和HcHSC70(GenBank登录号: MT261583)，其ORF长度分别为1 917和2 061 bp，分别编码637和687个氨基酸，分子质量分别约为69.66和74.96 kD，等电点分别为5.90和5.96；氨基酸序列结构均含有3个高度保守的区域GIDLGTTYS, IFDLGGGTFDVSIL和VGGSTRIPKVQ，符合热激蛋白70家族的特征；蛋白三维结构均由N端ATPase功能域和C端底物结合功能域所组成。系统进化树显示HcHSP70与鳞翅目HSP70家族其他成员聚为一支，而HcHSC70与鳞翅目HSC70家族的其他成员聚为另一支。qPCR结果表明，新蜕皮的美国白蛾4龄第2天幼虫在热胁迫下HcHSP70的相对表达量显著上调，且在35℃处理2 h下达到峰值，而热胁迫下HcHSC70的表达响应较微弱。成功构建了HcHSP70的原核表达载体并在体外诱导表达。纯化后的重组蛋白HcHSP70具备ATPase活性，且在高温胁迫下酶活性稳定。【结论】本研究克隆获得美国白蛾2条HSP70基因HcHSP70和HcHSC70，明确了两条基因在高温处理下的表达特性；成功对美国白蛾HcHSP70进行原核表达及纯化，并证明重组蛋白HcHSP70在高温下具有稳定的ATPase活性，推测其在美国白蛾应对高温胁迫中发挥着重要作用。
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美国白蛾热激蛋白70基因的鉴定及功能分析
本站小编 Free考研考试/2022-01-03
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