摘要： 【目的】明确基于电穿孔的基因功能分析方法在家蚕Bombyx mori活体内的应用实效。【方法】针对调控家蚕幼虫体表斑纹黑色素合成的靶基因Wnt1 (Wingless)，人工合成特异性siRNA，向4龄第3天家蚕幼虫注射Wnt1 siRNA并进行电穿孔作为处理组(ERFA-RNAi)，以注射Wnt1 siRNA但未进行电穿孔的幼虫作为阴性对照组(negative control, NC)，解剖5龄幼虫斑纹区的表皮，用实时定量RT-PCR测定表皮中Wnt1的相对表达量，验证电穿孔介导的RNAi效果。带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP和红色荧光蛋白报告基因DsRed2表达元件的转座子载体pPIG-A3GR，通过电穿孔导入家蚕2龄幼虫；正常饲养72 h后，用荧光体视显微镜观察幼虫中EGFP和DsRed2的表达，验证当世代家蚕的嵌合体转基因。【结果】家蚕4龄第3天幼虫中导入Wnt1的特异性siRNA后，5龄幼虫体表特定部位斑纹的形成明显受到抑制，实时定量RTPCR分析表明5龄幼虫表皮中Wnt1的表达水平显著降低。嵌合体转基因家蚕的阳性率达56.60%，并且两个荧光报告基因EGFP和DsRed2在幼虫、蛹及成虫期持续表达。【结论】电穿孔技术可快捷、高效地向家蚕活体内导入外源RNA或DNA，是家蚕乃至其他昆虫基因功能解析的有效方法。
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电穿孔法可用于家蚕基因功能分析(英文)
本站小编 Free考研考试/2022-01-03
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