摘要： 【目的】人类 C 型尼曼匹克病(Niemann-Pick disease type C， NPC)主要是由NPC1基因突变引起的一类遗传疾病。NPC1蛋白主要负责胞内胆固醇运输，同时也作为病毒侵染宿主细胞的重要受体之一近年来备受关注。本研究旨在探究NPC1蛋白与中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus, CSBV)感染的关系。【方法】通过PCR扩增中华蜜蜂Apis cerana cerana AcNPC1基因；将其克隆至pET-30a原核表达载体，转化至大肠杆菌Escherichia coli RosettaTM(DE3)进行IPTG诱导表达，采用镍柱纯化重组蛋白，免疫小鼠制备多克隆抗体。设计并合成AcNPC1 siRNA，添食中华蜜蜂幼虫；运用RT-qPCR检测和分析中华蜜蜂CSBV添毒幼虫中AcNPC1的表达量，以及RNAi干扰后不同时间AcNPC1基因和CSBV病毒衣壳蛋白VP1基因在感染CSBV的中华蜜蜂幼虫中的表达水平。【结果】成功构建重组表达质粒pET-30a-AcNPC1，在大肠杆菌中获得高效表达的重组蛋白，目的蛋白大小约为36 kD，经亲和纯化获得了纯度较高的重组蛋白，免疫小鼠成功制备了多克隆抗体，免疫印迹分析发现AcNPC1抗体能杂交到两条带，有可能是在提取膜蛋白过程中该蛋白发生了部分降解。中华蜜蜂CSBV添毒幼虫中AcNPC1表达与正常幼虫中的相比，在12, 24和48 h并无显著变化，在72 h出现显著上调。RNAi实验结果表明，中华蜜蜂正常幼虫添食24 h后AcNPC1的3个干涉片段(siRNA1, siRNA2 and siRNA3)均对AcNPC1具有显著性下调作用，AcNPC1表达分别下调了73.20%， 72.81%和54.78%；给CSBV添毒幼虫分别添食3个干涉片段，AcNPC1表达分别下调了43.90%，59.85%和57.67%。CSBV VP1基因在干扰AcNPC1基因72 h后表达下调了67.65%。【结论】利用原核表达系统能有效地在体外表达中华蜜蜂AcNPC1，并制备了其多克隆抗体。利用体外合成的siRNA对中华蜜蜂幼虫中AcNPC1的表达进行干扰，表明在蜜蜂中通过饲喂的方式进行RNAi可以成功下调靶标基因表达水平。不过，RNAi实验结果提示AcNPC1表达下调后可能并不直接影响CSBV的感染。本研究为进一步阐明AcNPC1的潜在功能打下了基础。
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中华蜜蜂NPC1蛋白AcNPC1的原核表达、多克隆抗体制备及功能鉴定
本站小编 Free考研考试/2022-01-03
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