摘要： 【目的】激活增强子结合蛋白4(activating enhancer binding protein 4, AP-4)是近年来备受关注的一类功能广泛的转录因子，参与Wnt/β-catenin信号通路的调控。本研究旨在研究棉铃虫Helicoverpa armigera HaAP-4基因的原核表达并制备多克隆抗体，明确HaAP-4基因的时空表达谱，初步探究HaAP-4对棉铃虫胆固醇载体蛋白2(sterol carrier protein-2, SCP-2)基因(HaSCP-2)表达的调控作用。【方法】通过PCR扩增棉铃虫HaAP-4基因片段，将其克隆至pET-28a原核表达载体，转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21，经IPTG诱导表达，采用镍柱纯化重组蛋白，免疫新西兰兔制备多克隆抗体。运用RT-qPCR检测HaAP-4基因在棉铃虫不同发育阶段(卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫)以及5龄幼虫和预蛹不同组织(中肠、脂肪体、头和表皮)中的表达水平。设计并合成HaAP-4 siRNA，转染棉铃虫Ha细胞，通过RT-qPCR检测和分析使用HaAP-4 siRNA进行RNA干扰后Ha细胞中HaAP-4和HaSCP-2基因 mRNA的表达情况。【结果】成功构建pET-28a-HaAP-4重组表达质粒，在大肠杆菌细胞中获得高效表达的可溶性蛋白，目的蛋白大小约为55 kD，经纯化获得了纯度较高的重组蛋白，免疫新西兰兔成功制备了多克隆抗体，通过Western blotting检测显示抗体具有较好的特异性，ELISA分析表明抗体效价较高。发育阶段特异性表达结果显示，HaAP-4基因在棉铃虫不同发育阶段均有表达，其中在卵期、5龄幼虫期和预蛹期的表达量较高。组织表达结果表明，HaAP-4基因在5龄幼虫和预蛹不同组织中均有表达，且在中肠和头部具有高表达，而在表皮和脂肪体中表达量较低。RNA干扰实验发现，HaAP-4基因的敲降对HaSCP-2基因转录有显著影响，HaSCP-2基因mRNA表达水平下降了约55%。【结论】利用pET-28a原核表达系统能有效地在体外表达可溶性的HaAP-4，并制备了较好的多克隆抗体。RNAi实验结果提示，在中肠内高表达的HaAP-4基因能促进HaSCP-2基因的转录表达，在棉铃虫脂质生理代谢过程中发挥作用。本研究为进一步深入阐明棉铃虫HaAP-4的潜在功能打下了基础。
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棉铃虫激活增强子结合蛋白AP-4基因的原核表达、多克隆抗体制备、表达谱分析及功能鉴定
本站小编 Free考研考试/2022-01-03
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