实现重要农作物精准基因组编辑对加快农作物遗传改良进程具有重要意义。引导编辑技术（Prime Editing）能够在基因组的靶位点处实现精准的片段插入、删除及碱基的任意替换。引导编辑系统由两部分构成：其一是nCas9 (H840A)与工程化改造的逆转录酶（Reverse Transcriptase, RT）融合构成的PE效应蛋白；其二是包含PBS（Primer Binding Site）序列和RT模板（RT Template）序列的pegRNA（Prime Editing Guide RNA）。在pegRNA的引导下，PE效应蛋白结合到靶位点，切割非靶标链产生缺刻，释放出可与其PBS序列结合的游离单链，从而起始对RT模板的逆转录过程，然后通过DNA修复将RT模板上对应的碱基改变引入基因组。高彩霞研究组前期在水稻和小麦中成功建立并优化了适用于植物的引导编辑器（Plant Prime Editor, PPE）（Lin et al., Natrue Biotechnology, 2020）。目前研究发现，引导编辑系统在植物基因组中许多位点编辑效率依旧偏低，需要进一步优化。而该研究组前期工作暗示植物引导编辑效率可能受到PBS和RT模板序列的影响（Lin et al., Natrue Biotechnology, 2020）。设计合适的pegRNA序列是提高引导编辑效率有效路径，但通过常规实验方法筛选高效形式的pegRNA费时费力，限制了引导编辑技术在植物中的广泛应用。因此，如何提升引导编辑效率并快速获取高效形式的pegRNA是植物引导编辑技术亟需解决的问题。
　　近日，中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究组与李家洋研究组合作开发了高效设计pegRNA以及提高植物引导编辑效率的新策略。由于引导编辑系统的PBS序列与非靶标链结合是起始逆转录过程的重要条件，而熔解温度（Melting Tempreture, Tm）决定了两条链结合的紧密程度，因此研究人员推测PBS的Tm值很有可能对引导编辑系统的编辑效率有重要影响。对此，研究人员在18个水稻内源位点进行了测试，发现当PBS的Tm值为30℃左右时，水稻的引导编辑效率在多数位点上达到最高，并且随着温度的增高或降低均呈现递减的趋势。同时，研究人员还开发了双pegRNA的策略，即针对所需突变同时向细胞中递送分别靶向DNA两条链的两个pegRNA进行共同编辑，以期提高引导编辑的效率。在15个水稻内源位点测试了该策略，结果表明，采用双pegRNA的引导编辑与使用单个pegRNA相比编辑效率平均可以提升3.0倍。基于Tm值的PBS序列设计和双pegRNA策略，研究人员进一步开发了植物pegRNA设计网站PlantPegDesigner（http://www.plantgenomeediting.net/）。该网站可以为使用者提供完整的pegRNA选择、设计与推荐方案，方便使用者快速设计高活性pegRNA。以上设计策略的开发，有效地提升了引导编辑系统的工作效率，极大简化了在植物中获得高效pegRNA的过程，为实现植物基因组功能解析和作物精准育种提供了强有力的技术支撑。
　　相关研究成果结果于2021年3月25日在线发表在Nature Biotechnology杂志（DOI:10.1038/s41587-021-00868-w）。高彩霞研究组博士生林秋鹏、靳帅、博士后宗媛以及李家洋研究组青年研究员余泓为本文的共同第一作者；高彩霞研究员与李家洋研究员为本文共同通讯作者。该研究得到了国家转基因重大科技专项、中国科学院战略性先导专项A，国家自然科学基金的资助。

图：植物高效引导编辑pegRNA设计策略。（a,b）PBS的Tm值及其对PPE在水稻中编辑效率的影响。（c,d）双pegRNA策略的示意图及其对PPE编辑效率的提升。（e）PlantPegDesigner在线设计网站的工作流程。