0 引言
【研究意义】冷热应激是指动物受到寒冷或炎热刺激所产生的一系列非特异性反应。随着畜牧业集约化和规模化发展及全球性气温剧烈变化,冷热应激严重影响了畜禽的生产性能、繁殖性能以及免疫力[1,2],成为制约畜牧业生产的重要因素。研究表明,热应激下奶牛的采食量减少,产奶量下降,乳成分含量降低[3,4],机体免疫功能受到抑制,导致奶牛乳房炎发病率提高[5]。而冷应激下,奶牛因体热散失较多,必然不断的增加能量消耗以维持正常体温,导致产奶净能减少,产奶量下降[6]。【前人研究进展】奶牛适宜生活的环境温度为5—25℃[7],超出此温度范围,奶牛就会发生冷或热应激反应。环境湿度也影响奶牛的冷热应激反应,因此常采用温湿度指数（temperature-humidity index,THI）来综合描述气候条件[8],通常当THI大于72时,奶牛出现热应激反应[8],THI小于38时,则出现冷应激反应[9]。参与调节冷热应激的神经内分泌轴主要有交感-肾上腺髓质轴（SAM）、下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）和下丘脑-垂体-甲状腺轴（HPT）[10]。奶牛处于冷热应激时,SAM、HPA和HPT轴被激活,垂体分泌促肾上腺皮质激素（adrenocorticotrophic hormone,ATCH）、催乳素（prolactin,PRL）和生长激素（growth hormone,GH）等激素,进一步调节血管收缩和舒张及能量代谢;同时,血液中与冷热应激相关的酶和电解质离子含量也相应发生变化[11,12],如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）等。【本研究切入点】因此,存在于血液中的这些生化指标,是奶牛冷热应激反应的内在体现,参与应激条件下机体能量的重新分配以维持体温恒定[13],在生产性能未表现异常之前就可检测到其变化,可用于早期监测奶牛的应激程度[14,15],降低冷热应激对产奶性能造成的不利影响,也可作为潜在的指标评价奶牛的冷热应激状态,辅助筛选耐应激个体。【拟解决的关键问题】北京地区每年夏季有131—139 d处于热应激期,其中处于中度热应激的天数超过50%[16],冬季昼夜温差高达20℃,冷应激和热应激均可对北京地区奶牛的生产造成严重影响。因此,系统地分析冷热应激对北京地区荷斯坦牛产奶性能和血液生化指标的影响,对该地区奶牛的生产管理及耐应激个体选育具有重要意义。本研究选择北京市三元绿荷金银岛牧场的健康泌乳荷斯坦牛为研究对象,分别于热应激期（2014年8月份,N=178）、非应激期（2014年11月份,N=120）和冷应激期（2015年1月份,N=126）采集血样,检测14种血液生化指标,收集7项产奶性能数据,分析冷热应激对荷斯坦牛产奶性能和血液生化指标的影响,筛选可判别冷应激反应的潜在血液生化指标,为制定该地区预防冷热应激方案和筛选抗冷热应激个体提供依据。1 材料与方法
1.1 试验动物
本试验在北京市三元绿荷金银岛牧场进行,以健康泌乳荷斯坦牛为研究对象。该荷斯坦牛群体采用散栏式饲养,舍外设运动场,自由饮水,全天全混合日粮（TMR）自由采食,整个试验期间日粮营养成分保持一致,其营养水平符合奶牛饲养标准（NY/T 34-2004）。饲料主要营养成分如下：干物质23 kg,粗料比例40%,粗蛋白16%—17%。试验在3个不同时期进行：热应激期（2014年8月份）、非应激期（2014年11月份）和冷应激期（2015年1月份）,采样个体数分别为178头、120头和126头,其中有101头在3个月份中均采样。热应激期从2014年8月1日开始,监测牛舍内THI（温湿度指数）变化,当THI连续7 d高于78后进行血液采集;非应激期从2014年11月1日开始,7 d后进行血液样品采集;冷应激从2015年1月1日开始,在THI连续7 d小于38后进行血液样品采集。1.2 牛舍环境温湿度记录
在牛舍中央距地面1.5 m处悬挂温湿度自动记录计,每半小时自动记录一次温湿度。根据公式计算THI：THI=0.8×AT+[RH×(AT-14.4)]+46.4[8],式中AT和RH 分别为温度和相对湿度。热应激判别标准[8]：轻度热应激,72≤THI≤78;中度热应激,78<THI≤89;重度热应激,THI>89。冷应激判别标准[9]：轻度冷应激,25≤THI≤38;中度冷应激,8≤THI<25;重度冷应激,-12≤THI<8。1.3 血液采集和生化指标测定
通过尾静脉采血法分别于2014年8月8日上午7：00—10：00（N=178）、2014年11月8日上午7：00—10：00（N=120）、2015年1月17日上午7：00—10：00（N=126）采集健康泌乳荷斯坦牛的血液样品,3 000 r/min离心10 min后,分离上层血清和下层红细胞,-40℃冷冻保存[17]。测定14种血液生化指标：放射免疫法测定促肾上腺皮质激素（adrenocorticotrophic hormone,ATCH）、皮质醇（cortisol,COR）、皮质酮（corticosterone,CORT）、C反应蛋白（C-reactive protein,CRP）、多巴胺（dopamine,DA）、生长激素（growth Hormone,GH）、脂质过氧化物（lipid peroxide,LPO）、去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）、催乳素（prolactin,PRL）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）;比色法测定血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、乳酸（lactate,LD）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）;原子吸收法测定红细胞钾（erythrocyte potassium,K+）。所有血液生化指标的测定均委托北京华英生物技术研究所进行。1.4 产奶性能数据
本研究采集了3个不同月份（热应激期：2014年8月份,N=178;非应激期：2014年11月份,N=120;冷应激期：2015年1月份,N=126）的7项产奶性能数据,包括：连续7 d平均日产奶量（average milk yield of 7 days,AMY,乳脂率（fat percentage,FP）、乳蛋白率（protein percentage,PP）、脂蛋比（fat percentage/Protein percentage,F/P）、乳糖率（lactose percentage,LP）、干物质率（solid percentage,SP）和体细胞分（somatic cells score,SCS）。产奶性能原始数据由北京市三元绿荷金银岛牧场采集和提供。1.5 数据分析
1.5.1 冷热应激影响荷斯坦牛产奶性能的方差分析 采用SAS9.2软件,利用MIXED过程分析冷热应激对荷斯坦牛产奶性能的影响,模型如下：Y =μ +MON+LAC+COW+e（模型1）
其中,Y是各产奶性能;μ是各产奶性能的均值;MON是月份的固定效应（8月份,11月份,1月份）;LAC 是泌乳阶段的固定效应（DIM≤100,早期;100<DIM≤200,中期;DIM>200,后期）;COW是奶牛个体的效应;e是随机残差。
模型中胎次、产犊季节、怀孕天数等不显著效应已剔除,仅保留显著的因子加入模型;由于数据有限
不考虑两因子和三因子互作。
采用最小二乘均值法对不同泌乳阶段和荷斯坦牛个体效应进行校正,用Bonferroni t检验对月份效应进行多重比较。
1.5.2 冷热应激影响荷斯坦牛血液生化指标的方差分析 采用SAS9.2软件,利用MIXED过程分析冷热应激对荷斯坦牛血液生化指标的影响,模型如下：
Y =μ+MON+PAR+COW+e（模型2）
其中,Y是各血液生化指标含量;μ是各血液生化指标含量的均值;MON是月份的固定效应（8月份,11月份,1月份）;PAR是胎次的固定效应（1胎,2胎,其他）;COW是奶牛个体的效应;e是随机残差。
模型中泌乳阶段、产犊季节、怀孕天数等不显著效应已剔除,仅保留显著的因子加入模型;由于数据有限不考虑两因子和三因子互作。
采用最小二乘均值法对胎次和荷斯坦牛个体效应进行校正,用Bonferroni t检验对月份效应进行多重比较。
1.5.3 受试者工作特征曲线分析（receiver operating characteristic curve,ROC曲线） 为了进一步分析各血液生化指标的变化与奶牛冷热应激反应程度之间的潜在关系,采用SAS9.2软件中Logistic过程对冷热应激下荷斯坦牛显著变化的血液生化指标进行ROC曲线分析,筛选可相对准确指示奶牛个体冷热应激反应的血液生化指标。ROC曲线图中,曲线下面积（area under the curve,AUC）值越大,表示其判别冷热应激反应的假阳性和假阴性的总数越少,准确性越高。AUC值在0.50—0.80之间,表示具有较低准确性;AUC值在0.80—0.90之间,表示具有较好准确性;AUC值大于0.90表示具有较高准确性。
2 结果
2.1 应激期与非应激期牛舍温度和THI
本研究监测了3个不同月份中试验牛牛舍的温度和THI,如图1所示：8月份牛舍的平均温度为31.80℃,平均THI达到了81.57,且该月THI大于78持续时间超过8 h的天数有21 d,最长可持续24 h,说明本试验群体在8月份长时间处于中度热应激状态（79≤THI≤89）状态;11月份的平均温度为12.76℃,该月平均THI为55.43,说明本试验群体在11月份处于非应激状态;1月份的平均温度为-6.70℃,平均THI为25.63,表明试验群体在1月份处于轻度冷应激状态（25≤THI≤38）,但该月有21 d的温差大于12℃,1月份中旬和下旬则持续处于冷应激状态（最低THI为10）,一定程度上加重了该荷斯坦牛群体的冷应激状态。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1应激期与非应激期牛舍的温度和THI黑色三角形表示该天THI大于78而且持续时间超过8 h;黑色菱形表示该天温差大于12℃
-->Fig. 1The temperature and THI of stress or non -stress period in cowshed The black triangle indicates that THI is greater than 78 and lasts for more than 8 h, and the black diamond indicates the temperature difference is greater than 12℃
-->
以上结果表明本荷斯坦牛试验群体在8月份和1月份分别处于中度热应激状态和轻度冷应激状态。为了检测这种中等和轻微程度的温度应激是否会对受试奶牛群体的生产性能和生理产生影响,采集了试验群体3个不同月份的日产奶量等7项产奶性能数据,并采集血液测定了促肾上腺皮质激素等14种血液生化指标（奶牛内在生理变化的表现）。
2.2 冷热应激对荷斯坦牛产奶性能的影响
方差分析结果显示,月份、泌乳阶段和荷斯坦牛个体均对多项产奶性能有显著影响（P<0.05）,因此采用最小二乘均值法对泌乳阶段和荷斯坦牛个体效应进行校正后,再比较不同月份（冷热应激）对产奶性能的影响。多重比较结果如表1所示：8月份与11月份相比,AMY下降了1.34 kg,奶样中的FP、PP、F/P和SP极显著降低（P<0.01）,LP显著降低（P<0.05）,而SCS极显著增加（P=0.01）;1月份与11月份相比,AMY下降了1.13 kg,奶样中的FP和SP极显著降低（P<0.01）,F/P显著降低（P<0.05）,SCS则极显著增加（P<0.01）。以上结果表明冷热应激已严重地影响了荷斯坦牛的产奶性能,同时降低了奶牛的免疫能力,增加了乳房炎的发病率。Table 1
表1
表1冷热应激对荷斯坦牛产奶性能的影响
Table 1Effect of cold and heat stress on milk production traits in Holstein cows
| 产奶性能 Milk production traits | 8月份 August (LSM±SE) | 11月份 November (LSM±SE) | 1月份 January (LSM±SE) | P值1） P-value | P值2） P-value |
|---|---|---|---|---|---|
| AMY(kg) | 32.14±0.59 | 33.48±0.73 | 32.35±0.69 | 0.18 | 0.46 |
| FP(%) | 3.68±0.04 | 4.09±0.05 | 3.88±0.05 | <0.0001 | 0.002 |
| PP(%) | 3.16±0.02 | 3.30±0.02 | 3.26±0.02 | <0.0001 | 0.18 |
| F/P | 1.17±0.01 | 1.24±0.01 | 1.19±0.02 | 0.0006 | 0.03 |
| LP(%) | 4.92±0.02 | 4.98±0.02 | 4.95±0.02 | 0.02 | 0.26 |
| SP(%) | 12.46±0.06 | 13.07±0.07 | 12.79±0.06 | <0.0001 | 0.002 |
| SCS | 3.22±0.12 | 2.77±0.15 | 5.82±0.14 | 0.01 | <0.0001 |
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2.3 冷热应激对荷斯坦牛血液生化指标的影响
动物的冷热应激反应是一个激素等多种因素参与调节的神经内分泌应对过程,存在于血液中的多种生化指标是奶牛冷热应激反应的内在生理表现。方差分析结果显示,月份、胎次和荷斯坦牛个体均对多种血液生化指标产生显著影响（P<0.05）,通过最小二乘均值法将胎次和荷斯坦牛个体效应校正后再对不同月份进行多重比较。如表2所示：8月份与11月份相比,血样中的BUN、CRP、LDH、LPO、NE和K+极显著降低（P<0.01）,而GH、LD、PRL和SOD极显著升高（P<0.01）;1月份与11月份相比,CRP、DA、GH、PRL和SOD极显著降低（P<0.01）,ACTH显著降低（P<0.05）,而血样中的COR、CORT和K+极显著升高（P<0.01）。以上数据表明冷热应激引起了荷斯坦牛多种血液生化指标的显著变化,因此,这些发生显著变化的血液指标可作为判别奶牛冷热应激反应的潜在标记物,用于早期监测奶牛的应激程度,降低冷热应激对产奶性能造成的不利影响。Table 2
表2
表2冷热应激对荷斯坦牛血液生化指标的影响
Table 2Effect of cold and heat stress on blood biochemical parameters in Holstein cows
| 血液生化指标 Blood biochemical parameters | 8月份（LSM±SE） August(LSM±SE) | 11月份（LSM±SE） November(LSM±SE) | 1月份（LSM±SE） January(LSM±SE) | P值1) P-value | P值2) P-value |
|---|---|---|---|---|---|
| ACTH(pg·mL-1) | 23.06±0.51 | 24.31±0.60 | 22.20±0.08 | 0.10 | 0.02 |
| BUN(mmol·L-1) | 5.01±0.07 | 5.54±0.09 | 5.38±0.11 | <0.0001 | 0.36 |
| COR(ng·mL-1) | 95.66±1.34 | 94.85±1.65 | 103.88±2.09 | 0.69 | <0.0001 |
| CORT(ng·mL-1) | 286.67±0.91 | 286.11±1.12 | 293.17±1.41 | 0.68 | <0.0001 |
| CRP(mg·L-1) | 3.02±0.20 | 4.43±0.25 | 4.09±0.32 | <0.0001 | 0.0006 |
| DA(ng·mL-1) | 73.72±1.91 | 79.95±2.35 | 67.28±2.96 | 0.14 | 0.001 |
| GH(ng·mL-1) | 5.23±0.06 | 3.99±0.07 | 3.39±0.09 | <0.0001 | <0.0001 |
| LD(mmol·L-1) | 2.22±0.04 | 2.05±0.03 | 2.04±0.04 | <0.0001 | 0.93 |
| LDH(U·L-1) | 901.14±17.49 | 998.78.44±21.48 | 966.85±26.97 | 0.0007 | 0.26 |
| LPO(nmol·L-1) | 5.49±0.04 | 5.79±0.05 | 5.76±0.07 | <0.0001 | 0.66 |
| NE(pg·mL-1) | 355.69±5.24 | 421.45±6.47 | 418.91±8.18 | <0.0001 | 0.74 |
| PRL(mIU·L-1) | 291.31±2.72 | 221.15±3.36 | 209.02±4.25 | <0.0001 | 0.0009 |
| SOD(U·mL-1) | 119.61±0.93 | 111.87±1.15 | 94.17±1.46 | <0.0001 | <0.0001 |
| K+ (mmol·L-1) | 14.52±0.13 | 16.46±0.16 | 17.37±0.20 | <0.0001 | <0.0001 |
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2.4 ROC曲线分析
冷热应激下分别有9种及10种血液生化指标发生显著变化,为了进一步评判这些显著变化指标潜在指示冷热应激反应的准确性,通过Logistic过程对这19种显著变化的血液生化指标进行ROC曲线分析。如图2所示：热应激下PRL的AUC值为0.91,GH和CRP的AUC值分别为0.85和0.83,表明这3种指标判别个体热应激状态的准确性优于其他7种指标（图2-A）;而冷应激下仅SOD的AUC值大于0.80,其值为0.84,表明SOD判别个体冷应激状态的准确性优于其他8种指标（图2-B）。综上,PRL、GH和CRP可做为指示奶牛热应激反应的潜在血液生化标记,SOD可作为指示奶牛冷应激反应的潜在血液生化标记。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2冷热应激下显著变化血液生化指标的ROC分析
-->Fig. 2The ROC analysis results of blood biochemical parameters significantly changed under cold or heat stress
-->
3 讨论
3.1 THI与奶牛冷热应激
气候变化是影响奶牛养殖的主要因素之一,THI作为温度和湿度的综合指标被广泛用于评估奶牛群体的冷热应激状态。当环境THI超过72时,奶牛开始处于热应激状态,干物质采食量和产奶量开始下降[18],乳成分和体细胞数也受到显著影响[3],也有研究发现,THI高于68时,奶牛已经开始出现热应激反应,当THI超过70时,干物质采食量、产奶量、乳脂率和乳蛋白率开始随THI升高而大幅度下降[19]。因此,牛群饲养的地理位置和管理水平等因素会影响THI判别冷热应激的准确性。寻找可辅助THI早期检测奶牛冷热应激反应的标记物显得尤为重要。此外,北京地区自2008年以来,冷热应激呈现“双升”态势,对奶牛养殖业造成了不小的冲击,其中8月份和1月份冷热应激程度最严重,天数占比最多[16]。本研究选择2014年8月、2014年11月和2015年1月作为应激和非应激试验期,对这3个月份THI、荷斯坦牛产奶性能和血液生化指标的变化规律进行了系统分析,探讨冷热应激对北京地区荷斯坦牛产奶性能的影响,筛选可判别冷热应激的候选血液生化指标。3.2 冷热应激对北京地区荷斯坦牛产奶性能的影响
荷斯坦牛散热能力差,新陈代谢和产奶过程又会产生大量的热[20],所以极易受热应激的影响。热应激下奶牛机体增加散热,减少产热,维持能量增加20%—30%,而奶牛的采食量减少,导致日产奶量下降,乳成分发生变化[4]。同时,奶牛机体免疫功能受到抑制,导致奶牛乳房炎发病率提高,SCC增加[5]。而冷应激下奶牛机体为保持体温恒定增加维持能量,也会导致生产性能降低,机体免疫力下降[21]。本研究以北京市三元绿荷金银岛为试验地点,分析了产奶性能随THI变化的规律,8月份平均THI为81.57,THI大于78且持续时间超过8 h的有21 d,说明该地区奶牛在8月份长期处于中度热应激状态,产奶性能数据显示8月份的AMY下降了1.34 kg,FP、PP、LP、SP和F/P等均显著降低,而SCC极显著增加。1月份的平均THI为25.63,显示该荷斯坦牛群体仅处于轻度冷应激状态,但1月份有21 d的温差达到12℃（最大可达20℃）,中旬和下旬则持续处于冷应激状态（最低THI为10）,加重了冷应激对该奶牛群体的影响,产奶性能分析结果显示1月份AMY下降了1.13 kg,FP、SP和F/P显著降低,SCC极显著增加了10万/L。产奶性能随THI的显著变化,表明冷热应激已严重影响了北京地区奶牛正常的生产性能,早期监测奶牛的冷热应激状态是科学管理冷热应激期奶牛生产的重要部分,因此寻找可早期监测奶牛冷热应激反应的标记物,对降低这些不利影响具有重要的意义。3.3 冷热应激对北京地区荷斯坦牛血液生化指标的影响
奶牛的冷热应激反应是一个由激素等多种因子参与调节的神经内分泌应对过程,存在于血液中的多种生化指标是奶牛冷热应激反应的内在生理表现,在生产性能发生异常变化之前就已经发生变化[14,15],能够较早地反应奶牛受温度应激影响的程度,所以这些发生显著变化的血液指标可用于判别奶牛的冷热应激反应。本研究分析了北京市三元绿荷金银岛牧场3个不同月份荷斯坦牛试验群体血液中生化指标的变化规律,与11月份相比,8月份有10种血液生化指标发生了显著变化,1月份有9种血液生化指标发生了显著变化,说明冷热应激对奶牛生理状态产生了严重影响。为了评估这些指标判别奶牛冷热应激反应的准确性,本研究将这19种显著变化的血液生化指标进行了ROC曲线分析。在10种受热应激显著影响的血液生化指标中,PRL、GH和CRP的AUC值大于0.80,其中PRL的AUC值最高,达到0.91。PRL是“应激激素”中的重要成员,奶牛血液PRL浓度在热应激后显著升高[22,23,24],表明PRL参与了体温调节。ALAMER等[25]提出,热应激下血液中PRL含量的升高可能与调节某些产热代谢通路有关。此外,PRL基因中的遗传多态与牛的温度调节能力和热应激反应显著相关,证实了PRL在体温调节过程的重要作用[26,27]。研究表明,GH与PRL密切相关,二者的分子量大小和结构相似,均通过与细胞表面受体结合激活JAK2-STAT5信号通路,调节靶基因表达[28]。GARNER等[29]报道,热应激奶牛血清中GH含量显著高于对照组,与本研究的结果一致。本研究中,热应激期试验奶牛血清中PRL和GH均极显著高于非应激期,说明PRL与GH在调节奶牛体温的过程中可能存在协同作用。PRL和GH的AUC值分别为0.91和0.85,表明二者指示奶牛冷热应激反应的准确性较高,因此可与THI组合作为奶牛热应激反应的判别参数。
在试验奶牛受冷应激显著影响的9种血液生化指标中,仅SOD的AUC值大于0.80,表明其判别冷应激反应的准确性优于其他指标。SOD是生物体内清除自由基的重要抗氧化酶,铜和铁是构成SOD的必要元素,冷应激会降低血液中铜和铁等金属离子的浓度,因此也降低了血液中SOD的浓度[30]。研究发现,西门塔尔杂交牛冷应激下血液中SOD含量显著降低[31],鸡在12℃的冷应激下心脏中SOD基因的表达水平同样显著降低[32]。在本研究中,冷应激奶牛血清中SOD含量显著降低,AUC值为0.84,对于判别奶牛的冷应激反应具有较好的准确性。
4 结论
本研究结果表明,北京地区荷斯坦牛在8月份和1月份均处于较严重的应激状态,且冷热应激均对该地区荷斯坦牛的产奶性能和生理状态造成了严重影响,增加了乳房炎的发病率,因此对北京地区冷热应激的早期监测尤为重要和迫切。综合受试者工作特征曲线分析和文献报道,催乳素和生长激素可作为指示北京地区荷斯坦牛热应激反应的候选指标,超氧化物歧化酶可作为指示北京地区荷斯坦牛冷应激反应的候选指标。结合温湿度指数数据并同时检测这些敏感指标的变化,可为早期制定缓解奶牛冷热应激的管理方案和耐冷热应激个体选育提供理论依据。（责任编辑 林鉴非）
The authors have declared that no competing interests exist.
