0 引言
【研究意义】饲用酶因具有改善畜禽生产性能、提高饲料消化率,降低粪含水量,改善畜禽舍环境等特点,已成为饲料营养领域的研究热点之一,但饲用酶制剂的有效性不仅取决于其本身的酶学特性,还与基础饲粮和目标动物密切相关。据估计,到2020年全球饲用酶市场总值将达13.7亿美元[1]。因此,快速评价饲用酶的有效性已成为饲料企业和养殖业的迫切需要。【前人研究进展】采用动物试验评价饲用酶的有效性耗时、费力、变异大,试验结果误差较大[2]。国内外****们试图探索快捷、易标准化的体外法评价饲用酶的有效性。ALABI等[3]采用胃蛋白酶-胰液素体外两步法评价Roxazyme G、木聚糖酶、植酸酶有效性,试验表明体外评价方法可用作动物试验的预试验。MALATHI等[4]利用两步法评价木聚糖酶混合酶对常见鸡饲料原料非淀粉多糖消化率的影响,并提出体外法是快速评价外源酶有效性和稳定性的方法。KONG等[5]分别用胃蛋白酶-胰液素两步法和胃蛋白酶-胰液素-微生物酶三步法研究了木聚糖酶、蛋白酶和植酸酶组成的混合酶对9种不同来源的饲料原料体外回肠和全消化道干物质消化率的影响,结果表明外源酶对体外干物质消化率的作用效果受饲料原料和研究方法的影响。目前体外法虽在评价饲用酶制剂有效性方面取得进展,但体外法中模拟饲料消化的消化酶来源和浓度变异性大,体外参数设置缺乏理论解释[6]。【本研究切入点】本课题组长期从事体外法研究,目前已经建立了完善的猪禽饲料生物学效价的仿生学评价方法[7-10],且仿生法与动物试验法测定的干物质消化率、能量消化率、代谢能之间具有较强的相关性,并可利用仿生法筛选猪禽饲料的最佳酶谱[11-12]。但利用仿生法评价外源酶制剂有效性的研究较少。【拟解决的关键问题】本试验利用单胃动物仿生消化系统分析测试外源蛋白酶对饲粮的干物质消化率（dry matter digestibility,DMD）、总能消化率（gross energy digestibility,GED）和酶水解物能值（enzymatic hydrolysate gross energy,EHGE）的影响,并分析DMD和EHGE与外源蛋白酶添加量的相关关系,确定蛋白酶的最适添加量,为快速评价饲用酶制剂的有效性提供方法参考,并为生产实践中外源蛋白酶的使用提供数据支撑。1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
本试验于2015年12月至2016年1月在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室进行。1.2 试验饲粮和试验设计
参照中国饲养标准（2004）和NRC（1994）配制肉鸡基础饲粮,包括前期（1—21日龄）和后期（22—42日龄）基础饲粮。试验采用单因素完全随机设计,分别在前期和后期基础饲粮中添加0、15 000、75 000和150 000 PROT·kg-1的蛋白酶（蛋白酶来源于地衣芽孢杆菌,活性为90 000 PROT·kg-1;酶活定义：pH=9.0,37℃条件下,每分钟从1 μmol·L-1底物中释放出1μmol对硝基苯胺所需要酶量为一个活性单位,即1 PROT）,共8种样品处理,每种样品处理设5个重复,每个重复1根消化管。饲粮采用四分法取样后,用实验用饲料粉碎机粉碎过60目,充分混合均匀后-20℃储存备用。基础饲粮组成见表1,饲粮营养成分见表2。Table 1
表1
表1基础饲粮组成（风干基础）
Table 1Ingredient and chemical composition of basal diets (air-dry basis) (%)
| 项目 Item | 含量 Content | |
|---|---|---|
| 前期饲粮 Starter diet | 后期饲粮 Finisher diet | |
| 原料 Ingredients | ||
| 玉米 Corn | 55.00 | 58.81 |
| 豆粕 Soybean meal | 36.30 | 32.27 |
| 豆油 Soybean oil | 4.15 | 5.00 |
| 磷酸氢钙 CaHPO4 | 1.80 | 1.62 |
| 石粉 Limestone | 0.90 | 0.67 |
| 食盐 NaCl | 0.30 | 0.30 |
| DL-蛋氨酸 DL-Met | 0.24 | 0.14 |
| L-赖氨酸盐 L-Lys·HCl | 0.21 | 0.10 |
| 预混料 Premix1) | 1.00 | 1.00 |
| 氯化胆碱 Choline chloride (50%) | 0.10 | 0.10 |
| 合计 Total | 100.00 | 100.00 |
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Table 2
表2
表2试验饲粮的常规营养成分含量分析（干物质基础）
Table 2Composition of experimental diets (dry matter basis)
| 项目 Item | 前期饲粮Starter diet (PROT·kg-1) | 后期饲粮 Finisher diet (PROT·kg-1) | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0 | 15 000 | 75 000 | 150 000 | 0 | 15 000 | 75 000 | 150 000 | |
| 干物质 Dry matter (%) | 89.81 | 90.47 | 89.99 | 90.13 | 90.83 | 90.78 | 90.65 | 90.99 |
| 粗蛋白质 Crude protein (%) | 24.29 | 23.86 | 23.74 | 23.13 | 21.72 | 21.63 | 21.85 | 21.62 |
| 粗脂肪 Ether extract (%) | 7.81 | 7.95 | 7.78 | 7.79 | 9.12 | 8.93 | 9.01 | 9.12 |
| 粗灰分 Crude ash (%) | 6.13 | 6.41 | 5.87 | 6.12 | 6.09 | 6.15 | 5.90 | 6.04 |
| 中性洗涤纤维 Neutral detergent fiber (%) | 8.55 | 8.36 | 8.49 | 9.10 | 8.72 | 9.03 | 8.09 | 7.53 |
| 酸性洗涤纤维 Acid detergent fiber (%) | 2.50 | 2.53 | 2.87 | 2.42 | 2.14 | 2.14 | 2.22 | 1.92 |
| 总能 Gross energy (MJ·kg-1) | 19.42 | 19.35 | 19.39 | 19.35 | 19.53 | 19.53 | 19.52 | 19.47 |
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1.3 试验方法
仿生消化操作过程中透析袋的型号和前处理、胃缓冲液和小肠缓冲液的配制和仪器运行参数等试验操作参照文献[13]。胃缓冲液：称取2.17 g氯化钠和1.57 g氯化钾溶于2 000 mL去离子水中,用2 mol·L-1的盐酸在41℃下调节pH至2.0。
小肠前段缓冲液：称取9.35 g无水磷酸氢二钠,40.09 g无水磷酸二氢钠,11.13 g氯化钠和3.09 g氯化钾,青霉素160万U于2 000 mL去离子水中,用1 mol·L-1的盐酸或1 mol·L-1的氢氧化钠在41℃下调节pH至6.50。
小肠后段缓冲液：称取48.77 g无水磷酸氢二钠,6.77 g无水磷酸二氢钠,10.03 g氯化钠和2.79 g氯化钾,青霉素160万U于2 000 mL去离子水中,用1 mol·L-1的盐酸或1 mol·L-1的氢氧化钠在41℃下调节pH至7.99。
模拟鸡胃液（胃蛋白酶活性 1 550 U·mL-1）：称取387.5 KU的胃蛋白酶（Sigma,P7000）溶解于250 mL pH 2.0的盐酸缓冲溶液中（41℃下标定pH）,缓慢搅拌至溶解（临用前配制）。
模拟鸡小肠液（淀粉酶活性401.46 U·mL-1,胰蛋白酶活性49.28 U·mL-1,糜蛋白酶活性11.31 U·mL-1）：量取淀粉酶（Sigma,A3306）110.40 KU、称取胰蛋白酶（Amersco,0785）13.55 KU、糜蛋白酶（Amersco,0164）3.11 KU溶解于25 mL去离子水中,缓慢搅拌直至溶解（临用前配制）。
1.3.1 胃模拟消化阶段的操作步骤 准确称取2.0000 g饲粮样品（精确到±0.0002 g）到10 mL的试管中。用已配好的活性为1 550 U·mL-1的鸡胃蛋白酶液20 mL将饲料样品无损转移到套有透析袋的仿生消化管中,同步测定饲粮样品的干物质含量和总能值。
将仿生消化管固定在已预热的单胃动物仿生消化系统（simulative digestion system,SDS-II）上,连通事先配制的胃段缓冲液,41℃条件下消化4 h。消化过程结束后,将消化残渣无损转移到已绝干恒重的培养皿中,放在65℃烘箱中烘干至无水痕后,调到105℃烘干至恒重,计算干物质消化率。
将培养皿中的消化残渣全部刮下,转移到已绝干恒重的玻璃砂芯坩埚中,无水乙醇脱脂后烘干至恒重,计算脱脂后干物质消化率,并测定脱脂未消化残渣的总能值。
1.3.2 全消化道模拟消化阶段的操作步骤 配制含淀粉酶（活性为401.46 U·mL-1）、胰蛋白酶（活性为49.28 U·mL-1）、糜蛋白酶（活性为11.31 U·mL-1）的模拟鸡小肠液。将仿生消化管固定在已预热的SDS-II上,依次连通事先配制的胃段缓冲液、小肠前段缓冲液和小肠后段缓冲液,41℃条件下,胃段消化4 h后,通过SDS-II的加酶管在每个消化管中精确补加2 mL模拟小肠液,继续进行7.5 h的小肠前段消化和7.5 h的小肠后段消化。消化过程结束后,将消化残渣无损转移到已绝干恒重的培养皿中,放在65℃烘箱中烘干至无水痕后,调到105℃烘干至恒重,计算干物质消化率。
将培养皿中的消化残渣全部刮下,转移到已绝干恒重的玻璃砂芯坩埚中,无水乙醇脱脂后烘干至恒重,计算脱脂后干物质消化率,并测定脱脂未消化残渣的
总能值,推算饲粮样品的酶水解物能值。
1.4 数据处理与统计分析
试验采用单因素完全随机设计,用SAS 9.2软件的MEANS模块对基本统计量进行分析,GLM模块对数据进行方差分析,REG模块进行线性回归,分析蛋白酶添加量对DMD和EHGE的影响。用Turkey法对平均值进行多重比较,结果以“平均值±标准差”表示,显著水平为 P<0.05,0.05<P<0.10的处理因素作趋势分析。其中数据计算公式如下：DMD (%) = (M1-M2) / M1 × 100
GED (%) = (GE1-GE2) / GE1 × 100
EHGE = (GE1-GE2) / (M1 × 1000)
公式中,DMD,饲料体外干物质消化率（%）;GED,饲料体外能量消化率（%）;EHGE,饲料体外酶水解物能值（MJ·kg-1）;M1,上样饲料干物质重量（g）;M2,未消化残渣干物质重量（g）;GE1,上样饲料总能（J）;GE2,未消化残渣总能（J）。
肠段的干物质消化率、能量消化率为全消化道测值与胃段测值之差。
2 结果
2.1 肉鸡生长前期饲粮的干物质消化率、能量消化率和酶水解物能值
由表3可知,随着在肉鸡前期饲粮中蛋白酶添加剂量的增加,全消化道DMD、GED和EHGE也随之增加（P<0.01）。与对照组相比,肉鸡前期基础饲粮添加75 000 PROT·kg-1的蛋白酶后,全消化道DMD和GED分别提高1.52%和1.76%;添加150 000 PROT·kg-1的蛋白酶后,全消化道DMD和GED分别提高1.88%和1.84%;添加75 000和150 000 PROT·kg-1的蛋白酶提高EHGE 0.36 MJ·kg-1（P<0.01）。与基础饲粮组相比,胃消化阶段蛋白酶添加组DMD、GED和EHGE均没有显著差异（P>0.05）。前期饲粮全消化道DMD、GED和EHGE的变异系数均在1.36%以内。Table 3
表3
表3肉鸡前期饲粮仿生干物质消化率、总能消化率和酶水解物能值
Table 3In vitro dry matter and gross energy digestibility and EHGE of broiler starter diet
| 项目 Item | 蛋白酶添加量 Protease Supplementation ( PROT·kg-1) | 数据统计Statistic analysis | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| P值P-value | 变异系数 Variation coefficient | 极差Range | |||||||
| 0 | 15 000 | 75 000 | 150 000 | Tukey | Linear | Quadratic | |||
| 干物质消化率DMD | |||||||||
| 胃Gastric DMD | 27.00±2.21 | 28.27±0.60 | 28.37±0.13 | 27.94±0.36 | 0.33 | 0.49 | 0.19 | 4.48 | 5.84 |
| 全消化道Total tract DMD | 74.00±0.53b | 73.92±0.68b | 75.52±0.32a | 75.88±0.24a | <0.01 | <0.01 | 0.05 | 1.34 | 3.08 |
| 肠Intestine DMD | 47.01 | 44.39 | 47.15 | 47.94 | — | — | — | — | — |
| 总能消化率GED | |||||||||
| 胃Gastric GED | 32.31±4.56 | 33.23±2.29 | 32.27±0.31 | 31.44±0.24 | 0.78 | 0.40 | 0.77 | 7.55 | 12.61 |
| 全消化道Total tract GED | 76.59±0.64b | 76.82±0.83b | 78.35±0.22a | 78.43±0.27a | <0.01 | <0.01 | 0.01 | 1.30 | 3.12 |
| 肠Intestine GED | 44.28 | 43.58 | 46.07 | 46.99 | — | — | — | — | — |
| 酶水解物能值EHGE (MJ·kg-1) | 15.07±0.13b | 15.09±0.16b | 15.43±0.04a | 15.43±0.05a | <0.01 | <0.01 | <0.01 | 1.36 | 0.66 |
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2.2 肉鸡生长后期饲粮的干物质消化率、能量消化率和酶水解物能值
由表4可知,随着在肉鸡生长后期饲粮中蛋白酶添加剂量的增加,胃消化阶段的DMD、GED和EHGE随之降低（P<0.01）。与对照组相比,肉鸡后期基础饲粮添加75 000和150 000 PROT·kg-1的蛋白酶后,胃消化阶段的DMD分别降低0.87%和0.69%,胃消化阶段的GED分别降低0.77%和0.41%。随着在肉鸡后期饲粮中蛋白酶添加剂量的增加,全消化道DMD、GED和EHGE随之增加（P<0.01）。与基础饲粮组相比,肉鸡后期基础饲粮添加75 000和150 000 PROT·kg-1的蛋白酶后,全消化道DMD分别增加1.88%和1.31%,全消化道GED分别增加2.34%和1.95%,EHGE分别增加0.40和0.31 MJ·kg-1。后期饲粮全消化道DMD、GED和EHGE的变异系数均在1.39%以内。Table 4
表4
表4肉鸡后期饲粮仿生干物质消化率、总能消化率和酶水解物能值
Table 4In vitro dry matter and gross energy digestibility and EHGE of broiler finisher diet
| 项目 Item | 蛋白酶添加量 Protease Supplementation ( PROT·kg-1) | 数据统计Statistic analysis | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| P值P-value | 变异系数 Variation coefficient | 极差 Range | |||||||
| 0 | 15 000 | 75 000 | 150 000 | Tukey | Linear | Quadratic | |||
| 干物质消化率DMD | |||||||||
| 胃Gastric DMD | 28.48±0.28a | 28.07±0.24ab | 27.61±0.25c | 27.79±0.14bc | <0.01 | <0.01 | <0.01 | 1.42 | 1.41 |
| 全消化道Total tract DMD | 75.35±0.53b | 75.56±0.28b | 77.23±0.75a | 76.66±0.11ab | <0.01 | <0.01 | <0.01 | 1.37 | 3.28 |
| 肠Intestine DMD | 46.87 | 47.49 | 49.62 | 48.86 | — | — | — | — | — |
| 总能消化率GED | |||||||||
| 胃Gastric GED | 31.38±0.44a | 31.36±0.38a | 30.61±0.16b | 30.97±0.27ab | <0.01 | 0.01 | <0.01 | 1.43 | 1.52 |
| 全消化道Total tract GED | 78.38±0.94b | 79.06±0.28b | 80.72±0.28a | 80.33±0.55a | <0.01 | <0.01 | <0.01 | 1.39 | 4.19 |
| 肠Intestine GED | 47.00 | 47.70 | 50.11 | 49.36 | — | — | — | — | — |
| 酶水解物能值EHGE (MJ·kg-1) | 15.58±0.19b | 15.73±0.05ab | 15.98±0.06a | 15.89±0.11a | <0.01 | <0.01 | <0.01 | 1.20 | 0.76 |
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2.3 蛋白酶添加量和DMD及EHGE的关系
采用一元二次回归模型分析蛋白酶添加量（PS,g·kg-1）对饲粮全消化道DMD及EHGE的影响（表5）,结果表明随着蛋白酶添加剂量的增加,DMD和EHGE呈先升高后降低的变化。由表可知,肉鸡前期饲粮全消化道体外干物质消化回归模型：DMD（%）= 2.56 PS - 0.82 PS × PS + 73.90（R2 = 0.82,RSD = 0.42,P<0.001）,酶水解物能值回归模型：EHGE（MJ·kg-1）= 0.75 PS-0.30 PS × PS + 15.02（R2 = 0.89,RSD = 0.07,P<0.001）。蛋白酶添加剂量为1.56 g·kg-1（140 400 PROT·kg-1）时DMD值达到最大,添加剂量为1.25 g·kg-1（112 500 PROT·kg-1）时,EHGE值达到最大。后期饲粮全消化道体外干物质消化回归模型：DMD（%）= 3.56 PS - 1.46 PS × PS + 75.20（R2 = 0.70,RSD = 0.60,P<0.001）;酶水解物能值回归模型：EHG（MJ·kg-1）= 0.61 PS - 0.30 PS × PS + 15.67（R2 = 0.79,RSD = 0.06,P<0.001）,蛋白酶添加剂量为1.22 g·kg-1（109 800 PROT·kg-1）时DMD的值达到最大,添加剂量为1.02 g·kg-1（91 800 PROT·kg-1）时EHGE的值达到最大。Table 5
表5
表5蛋白酶添加量和体外干物质消化率及酶水解物能值的关系
Table 5The inclusion of protease was regressed on the DMD and EHGE of diets
| 项目 Item | 方程Equation | R2 | 残差标准差RSD | P值 P-value | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 蛋白酶添加量 Protease supplementation (g·kg-1) | 蛋白酶添加量×蛋白酶添加量 Protease supplementation×Protease supplementation (g·kg-1) | 截距 Intercept | |||||
| 前期 Starter diet | |||||||
| DMD 消化率 (%) | 估计值Estimate | 2.56 | -0.82 | 73.90 | 0.82 | 0.42 | <0.001 |
| 标准误SEM | 0.57 | 0.33 | 0.16 | ||||
| P值P-value | <0.01 | 0.02 | <0.01 | ||||
| EHGE 能值 (MJ·kg-1) | 估计值Estimate | 0.75 | -0.30 | 15.02 | 0.89 | 0.07 | <0.001 |
| 标准误SEM | 0.10 | 0.05 | 0.03 | ||||
| P值P-value | <0.001 | <0.001 | <0.001 | ||||
| 后期 Finisher diet | |||||||
| DMD 消化率 (%) | 估计值Estimate | 3.56 | -1.46 | 75.20 | 0.70 | 0.60 | <0.001 |
| 标准误SEM | 0.82 | 0.48 | 0.22 | ||||
| P值P-value | <0.001 | <0.001 | <0.01 | ||||
| EHGE 能值 (MJ·kg-1) | 估计值Estimate | 0.61 | -0.30 | 15.67 | 0.79 | 0.06 | <0.001 |
| 标准误SEM | 0.09 | 0.05 | 0.03 | ||||
| P值P-value | <0.001 | <0.001 | <0.001 | ||||
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3 讨论
快速评价饲用酶的有效性已成为饲料企业和养殖业的迫切需要。体外法可快速评价饲用酶制剂的有效性,但传统的体外法的广泛应用常受到模拟消化酶来源和浓度变异性大、体外参数设置缺乏理论解释等因素制约[6]。基于单胃动物仿生消化系统的仿生法在“标准化、仪器化、自动化”等方面具有较大的优势,保证了试验结果的准确性和精确性[7-9]。3.1 外源蛋白酶对胃消化阶段干物质消化率和能量消化率的影响
单一外源蛋白酶对饲粮养分和能量的消化作用报道较少。本试验利用仿生消化系统模拟了肉鸡饲粮在胃肠道中的消化过程,测试饲粮养分消化率和酶水解物能值。在前期基础饲粮中添加外源蛋白酶对饲粮胃消化阶段的DMD和GED作用不显著。外源酶水解条件包括反应时间、pH、底物浓度、温度等[14-16]。本试验使用的外源蛋白酶为丝氨酸蛋白酶,其酶促反应最适pH常为7.0—10.0[17-18],而仿生法模拟鸡胃消化阶段的pH设置为2.0,外源蛋白酶在体外胃消化阶段作用不显著可能与酶促反应条件有关。在后期基础饲粮中添加外源蛋白酶降低了胃消化阶段的DMD和GED,MAHAGNA等[19]研究表明外源蛋白酶的添加可能抑制内源酶活性,本试验中可能是由于添加的外源蛋白酶抑制了内源胃蛋白酶的活性而导致胃消化阶段的DMD和GED降低。另外,本试验添加的外源蛋白酶本身是生物大分子,可能该蛋白酶能够抵抗内源胃蛋白酶水解并能抑制其活性,不会被胃蛋白酶消化造成“内源”干扰,但有待于进一步试验研究证实。3.2 外源蛋白酶对全消化道干物质消化率、能量消化率和酶水解物能值的影响
外源蛋白酶可减轻豆粕中抗营养因子的影响,提高豆粕水解效率,从而增加其可消化性[20-21]。YU等采用胃蛋白酶-胰液素体外法表明蛋白酶（3 125 PROT·kg-1）可促进大豆蛋白的降解。本试验经过体外模拟胃肠全消化道消化,得知外源蛋白酶可提高玉米-豆粕型基础饲粮全消化道DMD、GED和EHGE。肠段体外消化结果显示添加蛋白酶可以提高肠道DMD,除了酶自身分解饲料蛋白质外,可能也与添加外源蛋白酶在一定程度促进模拟肠消化中内源蛋白酶（如：糜蛋白酶、胰蛋白酶）活性有关[22-23]。FRU-NJI等[24]将外源蛋白酶（来源于地衣芽孢杆菌,酶活性为75 000 PROT·g-1）添加到玉米-豆粕型基础饲粮组和低蛋白饲粮组,可显著提高能量利用率,这与本试验结果相符。ANGEL等[25]在7—22日龄肉鸡饲粮中添加高于200 mg·kg-1的外源蛋白酶（来源于地衣芽孢杆菌,酶活性为：75 000 PROT·g-1）可提高养分（如：粗蛋白和大部分必须氨基酸）的表观消化率,这也与本试验添加结果相符。蛋白酶添加量和酶水解物能值的相关关系分析显示,肉鸡前期和后期基础饲粮分别添加112 500和91 800 PROT·kg-1的蛋白酶,饲粮的酶水解物能值最大。高精度的仿生法可初步预判饲用蛋白酶的有效性,为饲料企业和养殖业快速评价酶制剂的有效性作参考。4 结论
4.1
玉米-豆粕型基础饲粮中添加外源蛋白酶可显著提高肉鸡基础饲粮的干物质消化率、总能消化率和酶水解物能值。4.2
本试验条件下,肉鸡前期基础饲粮添加112 500 PROT·kg-1蛋白酶和后期基础饲粮添加91 800 PROT·kg-1蛋白酶可显著提升基础饲粮酶水解物能值。4.3
外源蛋白酶的添加剂量对消化道不同阶段、不同营养指标消化率的影响并不呈单纯一致的剂量反应规律。The authors have declared that no competing interests exist.
