0 引言
【研究意义】农业可持续发展已成为全球特别是中国的一个重要议题[1]。然而,长期大量使用化学肥料导致土壤有机物质减少、质量恶化[2-3]、微生物区系发生变化[1,4]、土壤生态遭受严重破坏,肥力降低[5-6]。因此,减少化学肥料的用量已得到广泛提倡[7]。许多微生物具有促进植物生长、提高营养成分的可用性及其摄取率、维持植物健康等多种功能,因此,微生物肥料成为可替代或部分替代化学肥料的理想候选者[8-11]。放线菌通常能够产生抗逆性较强的孢子,并能够定殖于植物根部土壤,产生各种抗生素,抑制多种植物病原体[12-14],分泌生长调节物质[15],同时这类微生物还具有解磷、解钾等各种功能[12,16-18],是研制微生物肥料的理想材料,因此,开展放线菌菌肥的研制对农业可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】放线菌菌肥的研究受到国内外广泛关注,在实验室[17]和野外[12-16,18]开展了许多工作,特别是尹莘耘等[13-16]对“5406”放线菌菌肥开展了一系列系统研究,在20世纪50—70年代,全国各地曾进行了大面积推广应用“5406”菌肥,取得了良好的增产效果,该菌肥的有效微生物为泾阳链霉菌（Streptomyces jingyangensis）[19]。近年来,国内放线菌菌肥的研究主要集中在生物防治方面,同时放线菌对作物种子萌发、幼苗生长、作物产量和品质的影响也日益受到关注。赵娟等[20]筛选到3株广谱拮抗放线菌Act1、Act11和Act12,它们对甜瓜和西瓜枯萎病菌具有拮抗活性,并对甜瓜幼苗具有促生作用,且Act12对土传植物病原真菌镰刀菌,如木贼镰孢、接骨木镰孢、尖镰孢西瓜专化型、尖镰孢棉花专化型和尖镰孢黄瓜专化型等,均具有较好的抑制作用[21],该菌与腐植酸钾配施,能够提高丹参出苗率,减少植株死亡率,改善丹参生长微环境,促进其生长[22]。吴艳辉等[23]筛选到一株对多种植物病原真菌具有抑制作用的放线菌W04,该菌株对西瓜枯萎病的抑制作用较强,在80%左右;王兰英等[24]研究发现金黄垂直链霉菌HN6对香蕉枯萎病的防治效果达72.02%,极显著高于95%恶霉灵1 200倍液,并能提高香蕉生物量;张艳杰等[25]田间试验表明玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63固体发酵物在对番茄连作障碍防效达46%;沈婷等[26]研究表明吸水链霉菌B04固体发酵物能有效降低草莓发病率,促进草莓生长,改善草莓品质;王兰英等[27]研究表明放线菌HN20对生菜具有显著促生作用,提高其各项生长指标;王世强等[28]发现链霉菌JD211能够显著提高土壤速效N、P含量,显著促进水稻幼苗生长,改善其生长微环境。然而,目前多数研究是在实验室条件下进行,而野外田间试验研究则较少开展。因此,亟需加强野外试验研究,以便真实评价放线菌菌肥在实际应用中的效果。【本研究切入点】放线菌菌肥的作用机制多种多样,包括防治植物病害、增加土壤有效磷和钾等矿物质元素的含量、提高种子发芽率和促进作物生长等[14-15,18,20-31]。菌株JXJ-0136是笔者实验室筛选的一株具有肥料效应的放线菌,本文将以2种常见蔬菜为指示植物,结合实验室和野外田间栽培试验,研究菌株JXJ-0136对作物生长的影响及其机制。【拟解决的关键问题】明确JXJ-0136菌株的分类学地位及促进作物生长的机制,分析其潜在应用价值,为放线菌菌肥的研制提供新材料。1 材料与方法
试验于2013—2014年在九江学院完成。1.1 菌株及培养基
菌株JXJ-0136由笔者实验室分离自庐山土样的一株放线菌。供试植物白菜,特纯矮抗青（江西洪城种业有限公司）;豇豆,美国无架豆（徐州市新天地种业有限公司）。放线菌培养基：葡萄糖4 g,酵母浸粉4 g,麦芽浸粉5 g,微量盐1 mL（微量盐组成：FeSO4·7H2O 0.2 g,MnCl2·4H2O 0.1 g,ZnSO4·7H2O 0.1g,蒸馏水100 mL）,H2O 1 L,pH 7.2,121℃灭菌30 min。解磷培养基：采用中华人民共和国农业行业标准NY/T 1847—2010的配方[32]。葡萄糖10 g,(NH4)2SO4 0.5 g,NaCl 0.3 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,KCl 0.3 g,FeSO4·4H2O 0.036 g,MnSO4·4H2O 0.03 g;有机磷（卵磷脂,2.0 g）或无机磷（Ca3(PO4)2 10 g）;去离子水1 L;pH 7.0,121℃灭菌30 min。种子萌发培养基：参考文献[33],Ca(NO3)2 0.8207 g,KNO3 0.5056 g,MgSO4·7H2O 0.6162 g,KH2PO4 0.2722 g,Na2-EDTA 0.0745 g,FeSO4·7H2O 0.0557 g,H3BO3 0.02860 g,MnSO4 0.01105 g,CuSO4·5H2O 0.00092 g,ZnSO4·7H2O 0.0022 g,H2MoO4 0.0009 g,蒸馏水1 L,琼脂15—18 g,pH 7.0,121℃灭菌30 min。
1.2 放线菌JXJ-0136的鉴定
参考文献[34]对JXJ-0136进行初步鉴定。采用插片法[35]获得菌丝,用光学显微镜和扫描电镜观察菌丝形态特征。以ISP 2培养基[36]为基础培养基,采用不同的pH（2.0—14.0）、NaCl含量（m/v,0—10%）和培养温度（4—50℃）培养该菌,其中pH和NaCl耐受性试验培养温度为28℃,生长温度试验的培养基pH为7.4,NaCl含量为0。采用溶菌酶法提取基因组DNA,用细菌通用引物primer A（5′-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3′）和primer B（5′-TACGGCTAC CTTGTTACGACTT-3′）进行PCR扩增,扩增产物送上海生工测序部测序,并与数据库EzTaxon Server version 2.1（http://www.ezbiocloud.net/ eztaxon）的16S rRNA基因序列进行比较,调出相似性高的菌株序列,利用软件CLUSTAL_X1.83进行多重序列比对,采用MEGA软件,以邻接法构建16S rRNA基因序列系统进化树。1.3 放线菌JXJ-0136对种子萌发及幼苗生长的影响
将菌株JXJ-0136接种于放线菌培养基中,置于180 r/min、28℃的条件下培养3 d,再在种子萌发培养基中分别加入0.2%、0.4%、0.6%和0.8%（v/v）的放线菌培养液,摇匀后倒入无菌组培瓶中,冷却凝固后将经表面消毒的蔬菜种子置于培养基中,用组培膜封瓶口,于28℃、光照强度为3 000 lx,光暗比为12 h﹕12 h的条件下培养,3—5 d后观察种子萌发及幼苗生长情况,并计算种子萌发率,测量幼苗株高和根长。另外,将未接种放线菌的培养基按照0.2%、0.4%、0.6%和0.8%（v/v）的量,加入种子萌发培养基中,作为培养基对照组;空白对照组加无菌水。1.4 田间试验
利用实验地土壤直接做营养钵,并培育豇豆和白菜幼苗,将生长一致的幼苗进行移栽,移栽处每穴施加5 mL放线菌培养液,移栽后整个生长过程中不施加任何其他肥料,统一管理,定时观察作物生长状况,及时收获豆荚,测量并记录其长度和质量,取平均值;白菜45 d后收获,测量其株高和质量,取平均值。对照组施加5 mL未接菌的放线菌培养基。田间试验于2013年4—10月在九江学院浔东校区实验地进行。
1.5 放线菌JXJ-0136对土壤总磷的影响
田间试验结束后,取植物根部土壤烘干并粉碎,用100目筛子过筛,称取0.5000 g置于锥形瓶中,参考汪小兰等[37]的方法提取土壤总磷。以少许蒸馏水润湿,加10 mL浓硫酸和1 mL高氯酸,于电炉上加热消煮,至瓶内溶液变为白色后继续消煮30 min,消煮液冷却后洗入200 mL容量瓶,并定容,采用钼锑抗比色法[32]测定溶液中可溶性磷的含量。1.6 放线菌JXJ-0136在植物根部土壤的定殖
田间试验结束后,取试验组和对照组的植物根部,将根部土样用无菌水进行梯度稀释,取稀释液在ISP 2琼脂平板上涂布,置于28℃条件下培养3—7 d,观察平板上生长的放线菌形态特征,将JXJ-0136的疑似放线菌菌落进一步纯化,并与JXJ-0136的菌落形态特征、色素产生情况、菌丝形态特征等进行比较,判断所分离在放线菌是否可能为放线菌JXJ-0136。1.7 放线菌JXJ-0136纯培养解磷效果
取放线菌JXJ-0136培养液按照5%（v/v）的接种量,接入不溶性有机或无机磷液体培养基中,于180 r/min、28℃的条件下培养,每24 h取样1次,共取样5次,样品溶液于4 500 r/min离心20 min,取上清,采用钼锑抗比色法[32]测定上清液中有效磷含量。第5次取样后用pH计检测各样品的pH。1.8 统计学处理
采用SPSS19.0统计软件对数据进行统计处理。确定3次重复实验的平均值（mean value）和标准偏差（standard deviation,SD）,绘图数据取3次试验的平均值,试验组与对照组比较,采用单因素方差分析,P≤0.05为差异显著,P≤0.01为差异极显著。2 结果
2.1 放线菌JXJ-0136初步鉴定
菌株JXJ-0136在6—45℃、pH 4.0—13.0和0—4%的盐浓度下均能生长,其中最适生长温度、pH和盐浓度分别为28℃、pH 8.0和1%。该菌气丝较发达,灰白色,孢子丝簇生,孢子长卵圆形（图1）,16S rRNA基因序列（1 463 bp）分析表明,菌株JXJ-0136是链霉菌属的成员,与Streptomyces violascens ISP 5183T（AY999737）、S. somaliensis NBRC 12916T（AB184243）、S. hydrogenans NBRC 13475T（AB184868）、S. albidoflavus DSM 40455T（Z76676）和S. daghestanicus NRRL B-5418T（DQ442497）的相似性依次为97.98%、97.71%、97.30%、97.23%和97.03%,但在系统进化树上后5株菌聚在单独一支,而菌株JXJ-0136形成单独一支（图2）;该菌与其他有效发表种的16S rRNA基因序列相似性均低于97%。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1放线菌JXJ-0136孢子丝
-->Fig. 1Spore chains of actinomycete strain JXJ-0136
-->
2.2 对种子萌发、幼苗株高和根长的影响
添加0.2%—0.8%的无菌培养基对白菜和豇豆种子萌发率、幼苗株高和根长均无明显影响;而添加0.2%—0.6%的放线菌JXJ-0136培养液时,白菜种子萌发率、幼苗株高和根长均随培养液剂量的增加而增加,在剂量为0.6%时试验组比对照组分别高（12.61± 2.93）%、（53.03±5.72）%和（51.92±10.13）%（P<0.01）,但继续增加放线菌培养液剂量时,白菜种子萌发率、幼苗株高和根长均略有减少;在试验浓度下（0.2%—0.8%）,豇豆种子萌发率、幼苗株高和根长均随放线菌培养液剂量的增加而增加,在剂量为0.8%时,试验组分别比对照组高（21.18±2.04）%、（22.33± 5.56）%和（20.08±4.32）%（P<0.01）（图3）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPTFig. 2Phylogenetic tree based on 16 s rRNA gene sequences analysis of strain JXJ-0136 and related taxa
Bootstrap values expressed as percentages of 1 000 replications >50 % were shown at the nodes。标尺：0.5%的序列分歧度Bar: 0.5% sequence divergence
-->
-->
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3放线菌JXJ-0136培养液对白菜和豇豆种子萌发率、幼苗株高和根长的影响
*和**分别表示试验组与对照组在P<0.05和P<0.01水平上差异显著。下同
-->Fig. 3Influences of actinomycete strain JXJ-0136 culture on the germination rates, heights and root lengths of seedlings of B. chinensis and V. unguiculata
* and ** indicated significant differences between the tests and the controls at P<0.05 and P<0.01 levels, respectively. The same as below
-->
2.3 菌株对栽培作物生长及产量的影响
放线菌JXJ-0136对试验蔬菜的生长和产量均有较大影响。试验组豆荚平均长度为（34.28±1.10）cm,比对照组（31.51±0.96）cm增加（8.79±3.48）%（P<0.05）;单株豇豆的平均产量为（195.98±5.92）g,比对照组（115.08±6.17）g增产（70.29±5.15）%（P<0.01）;白菜平均高度为（13.65±0.26）cm,比对照组（10.45±0.38）cm增加（30.86±2.49）%（P<0.01）;白菜每株平均质量为（205.63±9.92）g,比对照组（161.17±2.07）g增加（27.59 ± 6.15）%（P<0.01）。2.4 放线菌JXJ-0136对土壤总磷的影响
无论是否施加放线菌JXJ-0136,栽培作物后土壤总磷含量均会显著降低（P<0.05,P<0.01）,但对照组白菜土壤总磷含量比栽培前（1.44±0.06）mg·g-1降低了（13.32±2.75）%,而放线菌试验组白菜土壤总磷含量却比栽培前降低了（23.56±2.65）%,是对照组的（1.77±0.29）倍（P<0.01）;对照组（未施加放线菌）豇豆土壤总磷含量只比栽培前（1.43±0.07）mg·g-1降低了（12.76±3.34）%,而放线菌试验组豇豆土壤总磷含量却比栽培前降低了（37.10±1.98）%,是对照组的（2.70±0.15）倍（P<0.01）,这说明放线菌促进了作物对土壤磷的利用（图4）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4放线菌JXJ-0136对土壤总磷含量的影响
-->Fig. 4Influences of actinomycete strain JXJ-0136 on the soil total phosphorus contents
-->
2.5 放线菌JXJ-0136在植物根部的定殖
从施加放线菌JXJ-0136培养液的白菜和豇豆根部土样中,都分离到了与JXJ-0136菌落形态特征、产生的色素颜色、菌丝形态特征等均一致的放线菌,其中白菜根际土样中为（10.33±2.52）×103 CFU/g干土,豇豆根际土样中为（8.33±2.08）×103 CFU/g干土;而在未施加放线菌JXJ-0136培养液的对照组植物根部土样中,未分离到类似放线菌,说明放线菌JXJ-0136能够在白菜和豇豆根部土壤定殖。2.6 放线菌JXJ-0136液体解磷效果
在纯培养条件下,放线菌JXJ-0136对不溶性有机磷和无机磷均具有较好的降解作用,培养液中有效磷的含量随培养时间的延长而显著增加（P<0.01）（图5）,接种之前,培养基中有效磷的含量分别只有（0.86 ±0.05）和（1.26±0.18）mg,接种后5 d,分别增加到（73.94±0.94）和（7.12 ± 0.28）mg;而未接菌的无机磷培养基中有效磷浓度基本未发生变化,有机磷培养基中有效磷浓度稍有上升,但其浓度增加速率远低于试验组（P<0.01）（图5）。试验结束时,无机磷和有机磷培养基pH由起始pH 7.0分别降至5.0和6.0。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图5放线菌JXJ-0136对不溶性磷的降解活性
-->Fig. 5Degradation activities of actinomycete strain JXJ-0136 on insoluble phosphorus
-->
3 讨论
放线菌JXJ-0136与Streptomyces violascens ISP 5183T亲缘关系最近。然而,S. violascens的孢子丝为2—8圈螺旋形[38],而菌株JXJ-0136孢子丝簇状生长,长曲状,不形成螺旋。一般认为,16S rRNA基因序列相似性在95%以下可定为新属,98%以下可定为新种[34]。放线菌JXJ-0136与S. violascens ISP 5183T相似性为97.98%,略小于98%,因此,初步确定JXJ-0136是链霉菌属的一个潜在新种,但需要DNA-DNA分子杂交等试验结果的进一步确认。放线菌菌肥“5406”对不同农作物生长的影响不同,其增产率在5%—45%[15]。王兰英等[27]研究表明灰色链霉菌HN20对黄瓜促生作用不明显,但在低剂量条件下却显著促进生菜种子胚芽和胚根生长,增加其生物量,而在高浓度下则有抑制作用。李堆淑[29]研究发现细黄链霉菌培养液低浓度促进黄芩种子萌发和幼苗生长,高浓度则表现抑制作用。本研究也发现类似现象,在试验条件下,豇豆种子的萌发率、幼苗株高和根长,均随放线菌JXJ-0136使用剂量的增加而增加;但白菜种子的萌发率、幼苗株高和根长在剂量<0.6%时,随使用剂量增加而增加,>0.6%时则随着剂量增加而降低;同时该菌对白菜和豇豆的增产效果也具有显著差异,这说明放线菌JXJ-0136对不同农作物的影响不同。
生长调节物质能够刺激植物种子萌发,提高发芽率[39]。放线菌菌肥“5406”能够产生多种植物生长调节物质,提高作物种子萌发率,促进根的生长[15]。放线菌JXJ-0136制剂能够显著增加白菜和豇豆种子萌发率、幼苗株高及根长,这说明该菌能够产生植物生长调节物质,但这些生长调节物质的理化性质及类型等尚需要进一步研究。
溶解土壤中不溶性元素,为植物提供可吸收的矿物质营养,是微生物肥料促使农作物增产的主要机制之一。许多放线菌能够有效提高土壤中有效磷的含量,如放线菌菌肥“5406”[16]、Micromonospora aurantiaca MAMPM和灰色链霉菌SGMPM[12]、玫瑰黄链霉菌Men- myco-93-63[25]和链霉菌JD21[28]等。本研究表明,放线菌JXJ-0136在纯培养条件下,接种于不溶性无机磷和有机磷培养基并培养,其有效磷含量均随着培养时间的延长而迅速增加;在土壤中使用放线菌JXJ-0136制剂后,土壤中总磷含量显著降低,这说明该菌能够增加土壤中有效磷含量,促进植物对磷的吸收。因此,溶解不溶性磷,为植物提供可吸收的有效磷,是放线菌JXJ-0136促进植物生长的重要机制之一。
分泌小分子有机酸是解磷微生物溶解不溶性无机磷的重要方式,这些小分子有机酸主要包括草酸、乙酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸、柠檬酸、丁二酸、丙酸和苹果酸等,由于有机酸的产生,往往导致pH降低[40-42]。放线菌JXJ-0136接种于不溶性无机磷培养基,培养5 d后,培养液的pH比空白对照组降低了2.0,这说明产生有机酸是该菌溶解不溶性无机磷的机制之一,然而该菌分泌何种有机酸尚需要进一步研究。
JXJ-0136菌株对不溶性有机磷也具有一定的降解作用。许多微生物在环境中缺少正磷酸盐时,可诱导其细胞产生磷酸酶,将有机磷等降解为可溶性正磷酸盐,满足其生长需要。但由于不溶性有机磷培养基接种该菌培养5 d后,培养液的pH比空白对照组降低了0.98,pH降低可促进卵磷脂水解。因此,该菌对有机磷的降解作用是由于其分泌了有机酸,有机酸再促使卵磷脂的水解作用,还是由于该菌能够产生水解卵磷脂的磷酸酶,尚需要进一步研究。
有效微生物能否在施用的植物根际土壤中长期存活,并与植物形成特定的互利关系,是微生物肥料肥效能否持久的关键。放线菌菌肥“5406”肥效持久与其有效菌在很多作物根际土壤中能够长期、大量定殖有关[14]。张艳杰等[25-28]研究也发现,具有肥料效应的链霉菌能在作物根部土壤定殖良好。本研究在整个栽培试验中,只在栽培时施加一次放线菌JXJ-0136制剂,但其肥效却持续至白菜和豇豆整个生长周期,这与该菌能够在作物根际土壤中定殖有一定联系。
4 结论
放线菌JXJ-0136是链霉菌属的一个潜在新种,该菌能够产生未知生长调节物质,提高白菜和豇豆种子萌发率,增加幼苗株高和根长,并定殖于作物根际土壤,溶解土壤中不溶性磷,为植物提供可吸收的有效磷,促进作物生长,提高作物产量,在微生物肥料研制方面具有一定的潜在应用价值。The authors have declared that no competing interests exist.
