作为一项生命科学领域革命性工具，CRISPR/Cas9基因组编辑技术为植物生物学基础研究提供了简单高效的手段，但在作物遗传改良中应用仍受制于遗传转化和植物再生的技术瓶颈。传统上，CRISPR/Cas9等序列特异性核酸酶和选择标记基因需要借助农杆菌或基因枪介导的方式导入受体植物细胞，进行选择性培养和植株再生。病毒载体系统是外源基因体内递送和瞬时表达的理想工具，在植物组编辑领域，尽管植物病毒表达载体系统也广受关注，但CRISPR/Cas核酸酶基因较大的分子量（包括转录顺式元件可达5-6 kb），远超出了已知的大多数植物病毒载体的承载能力（<1-2 kb），目前尚未有利用侵染性植物病毒载体向植物系统递送CRISPR/Cas核酸酶的成功报道。
2020年6月29日，Nature Plants在线发表了浙江大学李正和教授研究组题为Highly efficient DNA-free plant genome editing using virally delivered CRISPR-Cas9的研究论文。该研究首次报道了利用一种工程化的植物负链RNA弹状病毒载体向植物体内系统递送CRISPR/Cas9核酸内切酶，并高效产生可稳定遗传的靶向基因编辑。Nature Plants同期配发了题为Editing through infection的评论文章，对该研究进行了详细的介绍。
该研究将CRISPR/Cas9表达框插入一种负链RNA弹状病毒载体，并利用tRNA加工机器对病毒转录的gRNA末端进行精确剪切，构建高效的单靶点、多靶点和染色体缺失病毒编辑载体系统。病毒侵染的植株组织经再生后可获得高达57%的纯和突变体或四等位突变体（烟草为异源四倍体），产生的基因编辑以经典的孟德尔遗传方式传递至后代植株。该研究提供了一种不依赖于遗传转化、无需分离特定的受体细胞或组织、通过简单易行的病毒侵染方法，可在植株个体水平递送CRISPR/Cas核酸酶进行高效基因组编辑的新方法，为作物DNA-free基因组编辑提供了新的思路。
浙江大学生物技术研究所马晓楠博士研究生为该论文第一作者，李正和教授为通讯作者，研究生张晓艳和刘慧敏参与部分工作。中国农科院植保所周雪平教授、美国加州大学伯克利分校Andrew Jackson教授和浙江大学作物所舒庆尧教授为研究提供了重要的帮助和建议。该研究得到国家自然科学基金面上项目、浙江省国家自然科学基金重点项目的资助。
论文链接：https://www.nature.com/articles/s41477-020-0704-5
（生物技术研究所供稿）