一种适用于文蛤家系鉴定的微卫星标记方法
专利类型发明
专利号CN201210112325.X
卢霞; 刘保忠; 王鸿霞
专利权人中国科学院海洋研究所
申请日期2012-04-17
2014-05-14
专利状态有效
授权国家中国
摘要本发明涉及遗传育种的分子辅助技术，具体的说是一种适用于文蛤家系鉴定的微卫星标记方法。具体为包括微卫星位点来源、引物设计、引物优化和微卫星标记家系鉴定体系确立四个步骤，先用磁珠富集文库方法筛选微卫星序列，用微卫星检索软件进行微卫星片段的快速分离；在微卫星重复的侧翼序列设计引物，优化引物成为微卫星标记；然后对微卫星标记在扩增过程中的重复性、稳定性和多态性信息含量值进行综合评价，确认其中的微卫星标记作为文蛤家系微卫星鉴别体系，用于文蛤不同家系的区分或个体间识别和鉴定，为文蛤遗传选育提供分子标记手段。
主权利要求:?1.一种适用于文蛤家系鉴定的微卫星标记方法，包括微卫星位点来源、引物设计、引物优化和微卫星标记家系鉴定体系，其特征在于：1）微卫星位点的来源：提取文蛤的基因组DNA利用提取的DNA，采用限制性内切酶法获得文蛤基因组DNA片段，并构建微卫星磁珠富集文库，检测阳性克隆，经测序得到含有微卫星重复的DNA序列；2）引物设计：在微卫星重复的侧翼序列利用软件PrimerPremier5.0设计引物，引物设计条件为：引物长度为19－25mer；GC含量为40%－60%；退火温度为45－65℃；预期PCR产物长度为100－400bp；3）引物优化：根据不同引物的Tm值进行温度梯度优化，在Tm值上下各10℃，温度梯度优化扩增得到的PCR产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-EB染色系统进行检测，选取杂带较少、特异性产物亮度较高的PCR反应对应的温度为该引物的最佳退火温度Ta；4）微卫星标记家系鉴定体系的确立：微卫星位点的多态性水平可用信息含量值PIC衡量，根据上述优化获得的Ta值，选取多个个体作为群体进行计算微卫星位点的多态性水平可用信息含量值PIC进而衡量多态性信息，根据PIC值，去除PIC小于0.25的标记，筛选得到重复性好、稳定性好，PIC值大于0.25的位点，作为文蛤微卫星标记家系鉴定体系，用于文蛤的家系区分与个体识别;所述引物优化时根据不同引物的Tm值进行温度梯度优化，在Tm值上下各10℃，温度梯度优化扩增，扩增条件为94℃预变性5min，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存；反应体系为20μL，含有40ng文蛤基因组DNA，1×PCRBuffer；Mg2+，1.5mmol/L；rTaq1U；dNTP10mmol/L，0.5μL；正反向引物10μmol/L，各0.5μL；加双蒸水补体系到20μL，其中模板是从多个混合个体中任取5个个体的DNA等量混合得到;所述正反向引物为：MMB39，正向:GCATGCTCGTACACACAA，反向:GAATTTCCTTCCATGTCATTT；MMB41，正向:CGCCTTACTTTATTCCTGATT，反向:CCATTCTCATGTTTCTGTTCT；MME64，正向:CACCCTCATGTCTTTGAACTA，反向:TATAGTCCGAGGCACTACAAA；MME84，正向:TCCATCTTCTTCTGAAACTCA，反向:TCCACAAGAGTTTTGTTGTCT；MME88，正向:GTCTCATTCTTTGTTGCTGAA，反向:ACGTGTTGAGTGGTAACCTAA；MME105，正向:ACGCACGCACTCACGCACT，反向:CTGGAGACTTGTTTAAAATGG；MMF68，正向:TGAGATGAGACCCTGTGTTAC，反向:AAGCAATGATTCTTCACCTAA；MMF71，正向:CGATTCCTATTGGTTGAAAAT，反向:ATGAAATCGTTTGCCACA。
语种中文
文献类型专利
条目标识符http://ir.yic.ac.cnhttp://ir.yic.ac.cn/handle/133337/25252
专题个人在本单位外知识产出

作者单位中国科学院海洋研究所

推荐引用方式
GB/T 7714卢霞,刘保忠,王鸿霞. 一种适用于文蛤家系鉴定的微卫星标记方法. CN201210112325.X[P]. 2014-05-14.


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