就像我们写字一样，DNA合成是一个容易出错的过程。寡核苷酸的化学合成、DNA聚合酶的延伸、基于寡核苷酸的基因片段组装等大片段DNA合成的每一步骤均可能引入错误碱基。这些“错误”如果没有及时“纠正”，它们将随着核酸链的复制而传播和扩散，导致DNA合成产物中一般只有5%-60%具有完全正确的序列。因此，DNA纠错环节的效率和经济性已经成为限制DNA合成质量、通量与成本的关键问题之一。
与其它的酶纠错系统相比，DNA错配修复蛋白（MutS）的纠错效率较高，而且使用相对简便。但在实际应用中，MutS酶活的持久性较差，在7天左右即开始显著下降，导致在一个完整的基因组合成流程中需要多次表达与纯化。这不仅阻碍了纠错环节的通量化和规模化，也限制了MutS纠错系统的工业化应用。
针对这一瓶颈问题，单细胞中心张佳博士带领的攻关小组，首先，提出了基于搭建人工二硫键来提高酶活持久性的思路，根据MutS的X射线晶体结构，理性设计了10组可能显著提高蛋白质稳定性的二硫键，并从实验中筛选出最佳的组合。其次，通过与麦芽糖结合蛋白 (MBP)的融合表达，来提高MutS蛋白的异源表达量。最后，通过储存条件的优化，将MutS蛋白与纤维素结合挂柱并保存在四摄氏度，进一步提高了MutS的使用寿命。最终构建的名为iMICC的DNA合成纠错系统，在保证纠错性能的前提下，能够保持峰值酶活长达63天，因此不再需要频繁地重复制备新鲜的MutS。同时，成品挂柱的储存方式还大大提高了使用的便捷性。
针对在溶液中合成Cas9同源基因和在芯片上合成木糖还原酶同源基因等的验证表明，iMICC能够将基因合成产物的错误率分别降低到0.64 / Kb和0.41 / Kb，组装成的正确片段占比72.1％和86.4％，而成本仅为$0.37/反应。因此，iMICC能够将基因合成过程中的碱基准确性提高37.6倍，同时大幅度提高了使用寿命。与常用的商品化纠错酶CorrectASE相比，iMICC的纠错性能高出6.6倍，却便宜了26.7倍。
因此，iMICC为建立一个更为简便、高效、稳定和低成本的工业化纠错流程奠定了基础。此外，这也是首次证明了二硫键的理性设计与搭建可以提高酶活的持久性，该思路为包括DNA纠错酶在内的诸多核酸工具酶的提质改性提供了有益启发。
单细胞中心张佳博士是该论文的第一作者。该工作由单细胞中心徐健研究员主持完成，得到了研究所姚礼山研究员团队、赵广研究员团队和联川生物技术公司高晓连教授、李璐璐博士等的帮助。该研究获得了国家自然科学青年基金、****等项目的支持。（文/图 张佳）
论文
Zhang, J., Wang, Y. F., Chai, B. H., Wang, J. C., Li, L. L., Liu, M., Zhao, G., Yao, L. S., Gao, X. L., Yin, Y. F., and Xu, J*. (2020). Efficient and low-cost error removal in DNA synthesis by a high-durability MutS. ACS Synthetic Biology.
文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00079
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