图1. 辛伐他汀生产工艺及本项目研究方案示意图
为了遗传改造工作的顺利进行，该团队开发了一个高效的土曲霉遗传操作平台，克隆表征了一系列高效土曲霉启动子，为遗传改造提供启动子元件支持；通过失活非同源重组末端连接途径使基因打靶效率从5%提高到90%以上，解决了基因打靶低下的问题；又结合尿嘧啶营养缺陷双向筛选体系和改良的Cre/loxP位点特异性重组系统实现了筛选标签的循环利用，突破了筛选标签不足的限制。该平台为后续的基因工程改造提供了技术平台支持（Huang X., et al., 2014，Huang X., et al., 2016）。
近期，研究团队通过体外实验鉴定了一个能高效水解洛伐他汀生成monacolin J的洛伐他汀水解酶PcEST，其活性远高于专利报道的洛伐他汀水解酶，是后者的232倍，而氨基酸序列一致性仅为16.8%，这说明PcEST是不受现有知识产权限制的高效洛伐他汀水解酶，为研究成果的实际应用提供了知识产权保障。
基于洛伐他汀水解酶PcEST，该团队对海正药业的洛伐他汀工业生产土曲霉菌株进行了遗传改造。利用强启动子PgpdAT异源表达洛伐他汀水解酶，成功地在不影响他汀化合物总产量的情况下将体内合成的洛伐他汀水解成了monacolin J，水解率达到95%，从而获得了能直接发酵生产monacolin J的土曲霉细胞工厂。实现了直接利用现有的洛伐他汀发酵工艺和设备，一步发酵直接生产monacolin J ，不再需要洛伐他汀水解过程，简化了辛伐他汀的生产工艺，有望降低企业的生产成本和污染排放。该工作近日发表于Metabolic Engineering杂志上（Huang X., et al, 2017），并与海正药业联合申请了发明专利（201611079430.2）。
上述研究获得国家自然科学基金和海正药业集团的支持。（文/图 黄雪年）
图2. 产monacolin J土曲霉细胞工厂构建
1）Huang X., Liang Y., Yang Y., Lu X.*, Single-step production of the simvastatin precursor monacolin J by engineering of an industrial strain of Aspergillus terreus, Metabolic Engineering, 2017, 42: 109–114.
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717617301180
2）Huang X., Chen M., Li J., Lu X.*, Establishing an efficient gene-targeting system in an itaconic acid producing Aspergillus terreus strain, Biotechnology letters, 2016, 38(9):1603-1610.
https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs10529-016-2143-y
3）Huang X., Lu X., Li J., Cloning, characterization and application of a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter from Aspergillus terreus. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2014, 41(3): 585- 592.
https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs10295-013-1385-0
4) 吕雪峰，黄雪年，杨勇，郑玲辉，黄隽，滕云，应玲萍，“2-甲基丁酸侧链水解酶和产莫纳克林J的曲霉菌株及其构建方法与应用”，发明专利，申请号：201611079430.2；
5) 吕雪峰，黄雪年，李建军，陈梅，“一种切除筛选标签的方法与应用”，发明专利，申请号：2015102756323；
6) 吕雪峰，黄雪年，李建军，陈梅，“一种提高基因打靶技术在土曲霉中应用效率的方法与应用”，发明专利，申请号：2015102754915；
7）吕雪峰，黄雪年，李建军，陈梅，“一种具有高效同源重组能力的土曲霉及其构建方法与应用”，发明专利，申请号：2015102752731；
