水稻是人类重要的粮食作物之一，在我国粮食生产中占有重要的地位。水稻花序的形态结构是直接决定最终产量的重要农艺性状之一。水稻花序发育和形态建成包括花序分生组织（IM）、一次和高次枝梗分生组织（BMs），小穗分生组织（SpM）以及花分生组织（FM）等多类生殖分生组织活性的调节、属性转换，以及花器官属性建立和形态建成等发育事件，受外在环境条件和内在遗传因子等多方面因素调控。但人们对IM、BMs、SpM和FM之间的形态和分子差异，以及它们在发育中的细胞水平差异仍不甚了解。近年来，多家实验室使用单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）研究了拟南芥、玉米、水稻等材料根、茎和叶等组织的细胞特性和异质性，不仅在单细胞分辨率上提供了有价值的转录组学信息，还对这些器官的发育轨迹提供了前所未有的见解，也为开展植物花序和花器官的发育轨迹分析提供了新的契机。
该研究以2个含盖水稻花序早期发育各生殖分生组织转换、花器官属性建立等发育过程的样本S1（花序长度<2mm）、S2（花序长度2-3mm）和剑叶（对照）进行了单细胞测序（BD RhapsodyTM，上海烈冰），获得了包含37,571个高质量细胞的单细胞转录组数据，并将这些细胞分为小穗、分生组织、花序轴和叶四大细胞类群（图1）。研究人员进一步对小穗、花、分生组织亚群进行了细胞类群鉴定和全面的分析，并通过原位杂交、分子标记转基因植株和突变体分析验证了分类的正确性。
图1.水稻花序早期发育模式图及细胞分类
(a) 水稻花序早期发育模式图。(b) 实验流程，展示花序早期发育两个时期材料的取材、原生质体收集、细胞捕获、单细胞转录组测序和生物信息学分析的工作流程。(c) t-SNE分类算法将花序细胞分为小穗、分生组织、轴、叶四大类群。(d) AUROC（area under the receiver operator characteristic curve）分析展示样本之间的高重复性。
鉴于****前期在水稻小穗和花发育中已经克隆了较多的调控因子，为细胞分群提供了可用的标记基因。研究人员首先对小穗和花细胞进行了细分研究。其中花的细胞类群可以分为10类，根据分子标记和拟时序分析，研究人员不仅鉴定到护颖（extraordinary glum, eg）、不育外稃（sterile lemma, sl）、外稃（lemma, le）、内稃（palea, pa）、浆片（lodicule, lo）、雄蕊（stamen）等已知花器官细胞类群，还发现了小穗属性细胞（SIC）、FM、边界细胞（boundary）、隐性孢片（cryptic bract）等新的细胞类群（图2）。研究人员发现ROC/HDG家族基因在SIC中富集，在拟时序分析结果中位于花器官发育的起点（图2）。研究还发现，WOX类转录因子DWT1在FM中高富集，是FM的标记基因；遗传学分析揭示DWT1基因突变的确会造成内稃、浆片属性和数量的异常，证实DWT1具有调控水稻FM活性的功能（图2）。
图2.水稻花细胞类型分类和dwt1突变体表型
(a) 水稻花的UMAP图，显示10个花细胞亚分群。红色和蓝色箭头表示花细胞的两条发育轨迹：生殖器官（FM、pa、lo、st等花组织）和非生殖器官（cb、le、sl, rg等苞叶类附生组织）。(b) 小穗和花结构示意图。(c) DWT1在FM中高富集。(d) 野生型9522小穗的表型。(e) dwt1突变体花表现出内稃异常(e1)或缺失(e2)、多雌蕊(e3)、和伸长的颖片状浆片(e4，e5)等表型。
通过拟时序分析，研究人员进一步构建了花发育的两条途径，并在单细胞表达组学层面证明水稻“真正的”花是以SIC–FM–pa/lo/st模式发育，而rg、sl、le是苞片状器官的观点（图3）。通过原位结果验证，ROC/HDG家族基因高度富集的SIC细胞群处于SpM和FM的表皮层（L1），暗示花分生组织L1在花分生组织活性调控和后续发育中发挥重要功能；研究人员由此提出ROC/HDG基因家族可能提供来自FM外层的位置信号，以激活水稻小穗和花启动的假设（图3）。
图3.水稻花细胞拟时序分析和SIC-FM发育模型
(a)和(b) 花细胞的拟时序分析结果，显示FM细胞会发育成花器官，包括不含叶属性细胞的内稃、浆片和雄蕊(a)，和包含叶属性细胞的护颖、隐性苞片和边界细胞(b)。(c) 小提琴图显示ROC基因在花SIC中富集。(d) ROC1(d1)、ROC3(d2)的mRNA原位杂交显示SIC为花序原基表皮细胞。(e) 小穗中SIC、SSC（支撑细胞群）和FM之间关系的模型图。
研究人员随后对生殖分生组织再次进行细胞类群细分，将分生组织细胞簇分为花序分生组织、分枝分生组织和小穗分生组织三类，并提供了一系列全新的细胞类型标记基因（图4）。研究通过拟时序重建了各类生殖分生组织的发育途径，并确定了四类控制侧生分生组织转变的调节因子。研究人员还深入分析了第二类代表基因OsAUX1的表达模式和生物学功能，证实Osaux1突变体花序变小、分枝和小穗数量减少的表型，为生长素调控水稻花序发育提供了直接的遗传学证据（图4）。
图4.水稻花序分生组织细胞类型鉴定和拟时序分析，以及OsAUX1调控花序分枝的表型
(a) 花序分生组织细胞的UMAP图，分为3种细胞类型：IM、BM、SM。(b) 对分生组织细胞进行拟时序分析，展示了从IM到BM和SM的两条分化轨迹。(c) 对(b)图中红色节点的BEAM分析显示转录因子对分生组织转化的贡献分为四大类。(d)OsAUX1基因BEAM分析散点图，表示OsAUX1主要影响IM向BM的分化。(e) OsAUX1在S1时期的原位杂交结果，显示OsAUX1在BM和SM中表达。(f) 与野生型9522相比，Osaux1-1;4突变体花序显示较短的分枝和较少的小穗数。(g) 与野生型相比，Osaux1-1;4突变体花序的长度变短。
这些研究成果系统绘制了水稻花序早期发育的单细胞图谱，重建了水稻花和生殖分生组织的发育轨迹，明确了花序发育过程中的一系列重要调控因子并提供了遗传学证据，为今后解析水稻花序发育的精细过程和分子机制，以及水稻高产育种奠定了良好的基础。
该项目获得了国家自然科学基金、杂交水稻国家重点实验室开放课题、上海市水稻产业技术体系建设、高等学校学科创新引智计划、上海交通大学SMC晨星计划等项目经费的支持。
论文链接：https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/nph.18008
