, 罗丽萍1, 王宇萌1, 郭鸿钦1 1. 东北大学 资源与土木工程学院, 辽宁 沈阳 110819;
2. 东北大学 智慧水利与资源环境科技创新中心, 辽宁 沈阳 110819
收稿日期：2020-10-11
基金项目：“十三五”国家重点研发计划项目(2019YFC1907204); 辽宁省科技重大专项(2020020307-JH1/103-04); 中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(N182508026)。
作者简介：赵鑫(1982-), 男, 辽宁沈阳人, 东北大学副教授, 博士生导师。
摘要：大麦虫取食降解泡沫塑料易受环境因子的影响而导致存活率降低.为了减少环境因子对塑料降解研究的干扰，通过条件实验探究了环境因素对大麦虫幼虫生长和取食泡沫塑料的影响，借助MiSeq测序解析了其消化道内潜在的塑料降解核心功能菌群.实验结果表明，光照、塑料密度与接触面积均对大麦虫生长和取食聚苯乙烯(Polystyrene，PS) 泡沫塑料有明显的影响.黑暗条件有利于大麦虫的生长和取食塑料；密度低且接触面积小的PS泡沫塑料更容易被大麦虫取食，但是破碎程度高的泡沫塑料不利于大麦虫的取食，而仅以PS泡沫塑料作为大麦虫的唯一食物无法满足其幼虫正常生长的需求.取食PS泡沫塑料对其消化道的菌群结构影响显著，unclassified Enterobacteriaceae，Dysgonomonas，Sphingobacterium和Enterococcus 4个菌属与PS泡沫塑料降解密切相关.
关键词：塑料生物降解大麦虫光照条件塑料密度接触面积功能菌群
Research on Influencing Factors of Polystyrene Consumption by Zophobas atratus Larvae, and Gut Core Functional Microbiome
ZHAO Xin1,2
, LUO Li-ping1, WANG Yu-meng1, GUO Hong-qin1 1. School of Resources & Civil Engineering, Northeastern University, Shenyang 110819, China;
2. Science and Technology Innovation Center of Smart Water and Resource Environment, Northeastern University, Shenyang 110819, China
Corresponding author: ZHAO Xin, E-mail：zhaoxin@mail.neu.edu.cn.
Abstract: The survival rate of Zophobas atratus in the styrofoam biodegradation investigation is affected by environmental factors. In order to reduce the interference on the experiments of plastic biodegradation, effects of environmental factors on the growth of Zophobas atratus and consumption of the styrofoam were investigated, and the potential core functional bacteria was speculated by using the MiSeq sequencing technology. The experimental results indicated that light condition, plastic density and contact area have significant impacts on the growth of Zophobas atratus and the consumption of polystyrene(PS) styrofoam. Dark condition is conducive to the growth and plastic consumption by Zophobas atratus. Styrofoam with low density and low contact area is favored by Zophobas atratus. However, plastic with high breakage degree is not conducive to Zophobas atratus, and taking styrofoam as sole diet can not meet the growth requirements of larvae. Significant changes in gut microbiome of Zophobas atratus was observed with PS styrofoam diet, and genera of unclassified Enterobacteriaceae, Dysgonomonas, Sphingobacterium and Enterococcus are closely related to the degradation of PS styrofoam.
Key words: plastic biodegradationZophobas atratuslight conditionplastic densitycontact areafunctional microbiome
塑料因具有质轻、韧性强、耐腐蚀、高绝缘等优点而被广泛使用[1-2].但是，由于塑料属于高分子聚合物，化学稳定性强，很难自然分解，而在环境中形成长期污染[3].截至2017年，至少已有6.3亿t塑料垃圾在自然环境中积累，并正以每年4000 t的速度继续积累[4-5].塑料垃圾不仅对土壤、大气、地表水造成严重的污染，携带的其他污染物还会通过食物链对人的生命健康造成威胁[6].传统的塑料垃圾处理方法主要是填埋和焚烧，潜在二次环境风险，无法彻底解决塑料污染的问题[7].因此，寻求解决塑料废弃物处置与资源化的新技术迫在眉睫.
近年来，研究人员发现黄粉虫和大麦虫等昆虫的幼虫可取食降解聚苯乙烯(Polystyrene，PS) 泡沫塑料.PS泡沫塑料，分子式为[—CH(C6H5)CH2—]n，主要用于建筑保温材料、包装泡沫、一次性餐具等产品[7].目前，全球PS泡沫塑料的年产量超过2 000万t，约占总塑料产品的7.1%，其废弃物也在环境中大量累积[8].有关利用昆虫取食降解塑料的研究主要从2010年开始.沈叶红[9]发现黄粉虫可以以PS泡沫为食物生长.Yang等[8]发现取食塑料的黄粉虫存活率高于饥饿的黄粉虫，添加麦麸可以提升黄粉虫取食PS泡沫的效率，Yang等[10]从取食PS泡沫的黄粉虫肠道中分离获得1株可降解塑料的细菌YT2.陈冠舟等[11]和Brandon等[12]分别利用MiSeq测序技术对以PS泡沫为食的黄粉虫的肠道菌群结构进行分析，发现Brevundimonas和Kosakonia等菌属可能与PS的降解有关.另外，大麦虫(Zophobas atratus)也被发现具有取食降解塑料的能力.大麦虫属昆虫纲、鞘翅目、拟步甲科[13]，其与黄粉虫亲缘性较近，但体型是黄粉虫的3~4倍，对泡沫塑料的取食效率也高于黄粉虫[14].苗少娟[15]首次发现大麦虫幼虫啃食降解EPE, EPS, PVC, EVA等多种塑料，借助傅里叶红外光谱和热重分析证明被取食的塑料在其消化道内发生了降解.杨莉等[16]对以PS塑料作为唯一食物的大麦虫肠道微生物进行体外培养，发现PS降解潜在功能菌Klebsiella和Citrobacter等显著富集.取食和降解泡沫塑料现象的发现，为塑料的生物降解提供了新的探索思路和实验对象.但是，通过前期研究发现，一些外界条件的改变会明显影响大麦虫的生长发育、存活率和取食塑料效率，需要深入研究，优化大麦虫的培养条件，以降低环境因子对大麦虫取食塑料研究的干扰.
本研究选取PS泡沫塑料作为大麦虫的唯一饲料来源，探讨光照、塑料密度和接触面积等环境因素对大麦虫幼虫生长和存活率，以及取食泡沫塑料效率的影响.利用MiSeq测序技术，探究降低环境因子扰动后，取食塑料的大麦虫肠道菌群结构特征.该研究对降低环境因子扰动、提升大麦虫取食泡沫塑料效率、富集功能微生物，以及塑料降解机制的探索等后续研究有重要的价值.
1 材料与方法1.1 实验材料和条件大麦虫幼虫购自江苏省无锡昆虫养殖厂.为了避免容器材料对实验的干扰，选择在玻璃制烧杯(500 mL) 中进行实验，使用纱布遮盖，保证通风，并避免其他干扰；挑选质量和长度接近的大麦虫(平均值±标准差：质量(0.8±0.03) g，长(5±0.5) cm)，每只烧杯中放入数量相等的大麦虫，尽量保证初始生物量相同.对照组饲料为麦麸，购于农副产品专卖店；PS泡沫塑料购于浙江银龙塑料制品公司，主要用于生产包装箱和墙体保温材料.实验在室内进行，温度为(23±2) ℃，空气相对湿度(55±5)%.
1.2 实验设计和方法光照条件影响实验：设置4个光照强度，1 500 lx(24L)，1 000 lx(24L)，500 lx(12L：12D)，0 lx(24D)，其中L表示光照，D表示黑暗，前面的数字表示每天的光照时间.每只烧杯中放入密度为12 kg/cm3泡沫塑料0.3 g，每3 d更换1次.
塑料密度影响实验：设置塑料密度分别为12 kg/cm3的0.3 g，16 kg/cm3的0.4 g和20 kg/cm3的0.5 g实验组，对照组以麦麸为唯一饲料.每只烧杯中的泡沫塑料体积相同(5 cm×5 cm×1 cm)，每3 d更换1次.
接触面积影响实验：取5组规格为5 cm×5 cm×1 cm的密度为12 kg/cm3泡沫塑料0.3 g，1组不切割，其余分别进行2，4，8等分切割，以及颗粒化处理，处理后大麦虫与泡沫塑料的接触面积分别为70，80，90，100，150 cm2(塑料粒度分别为5 cm×5 cm×1 cm，2.5 cm×5 cm×1 cm，2.5 cm×2.5 cm×1 cm，2.5 cm×2.5 cm×0.5 cm，破碎化后塑料直径为(0.4±0.1) cm.对照组以麦麸为唯一饲料.
为避免消化道内残留的食物对实验的影响，实验开始前3 d对大麦虫进行饥饿处理.对实验中死亡和化蛹的幼虫及时清理，每2 d在烧杯中喷洒1 mL蒸馏水；每7 d使用电子天平(AY220，Mettler) 对大麦虫和剩余泡沫塑料称重.每组实验平行设置3组重复.实验结束时记录剩余的大麦虫数.
1.3 消化道提取与菌群结构研究参照文献[17]的方法对大麦虫消化道进行提取.相同实验组的消化道混合，使用OMEGA公司的E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit试剂盒提取基因组DNA.16S rRNA基因V3-V4区的PCR第一轮扩增，引物(341F: CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TCT G; 805R: GAC TGG AGT TCC TTG GCA CCC GAG AAT TCC A)；第二轮扩增引入Illumina桥式PCR兼容引物.扩增完成后，产物交由生工生物工程(上海) 股份有限公司，利用Illumina MiSeq测序平台完成测序工作.基于97%的相似性阈值对测序结果进行可操作分类单元(operational taxonomic units, OTU) 聚类分析和菌群差异分析.
1.4 数据统计处理使用如下方法对实验数据进行统计分析：
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光照对大麦虫生长的影响如图 1所示.不同光照条件下，大麦虫的平均质量均是先增加后逐渐减小，虫重在前期增加推断原因是经过饥饿处理的大麦虫在实验开始时大量啃食塑料，其肠道尚未适应，短时间内无法将塑料消化并排出体外，而形成质量的短暂上升.在14 d后，大麦虫质量出现减少的情况，说明塑料为唯一食物来源无法满足大麦虫幼虫正常生长发育所需的营养，待其肠道逐渐适应后，塑料被逐渐消化而排出体外，大麦虫质量又逐渐减小.黑暗条件下的大麦虫的质量始终最大，每条大麦虫的质量35 d累计增加23.19 mg，随着光照强度增强，大麦虫的质量增长逐渐减小，增加量分别为19.6，15.76和12.13 mg，表明黑暗条件对大麦虫取食塑料和生长影响最小.随着光照强度的增强，大麦虫的生长逐渐减缓.之前的研究表明，光照对拟步甲科昆虫幼虫的发育不利，例如：增加光照(>250 lx)会抑制黄粉虫幼虫的生长和虫蛹的发育[18]，与本研究结论相符合.
图 1(Fig. 1)
 | 图 1 光照对大麦虫生长的影响Fig.1 Effect of light condition on the growth of Zophobas atratus |
光照强度对大麦虫取食泡沫塑料的影响如图 2所示.大麦虫在不同的光照条件下对塑料的取食量差异显著：大麦虫在黑暗条件下取食塑料的效率最高，35 d累计消耗量为48.4 mg/条，且取食量远大于其他3组，随着光照强度增强，大麦虫对塑料的取食量逐渐减小，分别为33.8(500 lx(12L∶12D))，23.7(1 000 lx(24L))，19.8(1 500 lx(24L))mg/条.实验表明，大麦虫对光线敏感，光照强度增加，大麦虫的活性降低，影响大麦虫对泡沫塑料的取食，黑暗条件更适合大麦虫存活和取食泡沫塑料.
图 2(Fig. 2)
 | 图 2 光照对大麦虫取食PS泡沫塑料的影响Fig.2 Effect of light condition on the PS styrofoam consumption by Zophobas atratus |
2.2 泡沫塑料密度对大麦虫取食的影响实验35 d，统计大麦虫存活率：对照组存活率为100%，密度12 kg/cm3的实验组的存活率为(95.56±3.85) %，密度16 kg/cm3和20 kg/cm3实验组的存活率均为(93.33±3.85) %.说明以PS泡沫塑料为唯一食物不能完全提供大麦虫生长所需的营养物质.
大麦虫取食不同密度泡沫塑料后的质量变化如图 3所示.对照组中，大麦虫质量一直增加，35 d累计增加55.29 mg/条，而仅喂食泡沫塑料的大麦虫质量均先增加后减少，分别增重19.67(12 kg/cm3)，14.12(16 kg/cm3) 和10.81(20 kg/cm3) mg/条，这与光照条件实验中大麦虫质量的变化相一致.
图 3(Fig. 3)
 | 图 3 塑料密度对大麦虫生长的影响Fig.3 Effect of styrofoam densities on the growth of Zophobas atratus |
大麦虫取食的泡沫塑料密度越小，其质量增加越多，然而，大麦虫对密度大的泡沫塑料的取食量更大(图 4)；推断其原因是密度大的塑料质量更大，而由于口器限制大麦虫每次取食塑料的体积相对固定，导致取食更少体积的高密度塑料的质量可能高于低密度泡沫塑料.另外，推断低密度塑料在其肠道消化效果更充分.因此，取食低密度泡沫塑料对大麦虫的生长影响较小.
图 4(Fig. 4)
 | 图 4 大麦虫对不同密度PS泡沫塑料的取食量比较Fig.4 Consumptions of PS styrofoam with different densities by Zophobas atratus |
由于泡沫塑料的密度会影响大麦虫的取食量，因此，采用塑料的取食率(即投入相同体积泡沫塑料后取食量与起始量的百分比) 准确表征和比较大麦虫取食不同密度的泡沫塑料(图 5所示).大麦虫对密度为12，16，20 kg/cm3塑料的取食率分别为71.86%，60.36%，56.41%，表明大麦虫对密度低、泡沫化程度高的塑料取食降解效果更好.此结论与苗少娟[15]的研究结果相吻合.
图 5(Fig. 5)
 | 图 5 塑料密度对大麦虫取食PS泡沫塑料的影响Fig.5 Effect of styrofoam densities on the PS styrofoam consumption by Zophobas atratus |
2.3 塑料接触面积对大麦虫取食的影响实验结束时，麦麸对照组的大麦虫存活率为100%，塑料接触面积为70，80，90，100，150 cm2的大麦虫存活率分别为(95.56±3.85) %，(93.33±3.85) %，(93.33±3.85) %，(86.67±6.66) %和(86.67±6.66) %.表明大麦虫与泡沫塑料接触面积小时存活率更高.不同接触面积对其生长的影响如图 6所示，对照组大麦虫的质量始终增加，35 d累计增加50.9 mg/条，远高于其他实验组，喂食PS泡沫塑料的大麦虫其质量经历一个先增加后减少的过程.同时发现，大麦虫的质量和泡沫塑料接触面积成反比，即泡沫塑料破碎化程度越高，对大麦虫的生长影响越大.
图 6(Fig. 6)
 | 图 6 泡沫塑料接触面积对大麦虫生长的影响Fig.6 Effect of contact areas of styrofoam on the growth of Zophobas atratus |
实验发现(图 7所示)，当大麦虫与塑料接触面积为70 cm2时，35 d后大麦虫对泡沫塑料的取食量最大，为51.3 mg/条；随着接触面积的增加，大麦虫对泡沫塑料取食量随之减少, 塑料接触面积为80，90，100，150 cm2的大麦虫35 d的PS泡沫取食量分别为43.1，38.7，33.5，26.1 mg/条.破碎度高的泡沫塑料不利于大麦虫取食.因此，利用大麦虫取食降解泡沫塑料不建议进行破碎化的前处理.
图 7(Fig. 7)
 | 图 7 泡沫塑料接触面积对大麦虫取食PS泡沫的影响Fig.7 Effect of contact areas of styrofoam on the PS styrofoam consumption by Zophobas atratus |
2.4 优化后大麦虫的生长与取食PS泡沫塑料经过光照、塑料密度及大麦虫与塑料接触面积等条件优化后，大麦虫的存活率、生长情况及对泡沫塑料的取食降解效率均得到明显提升.存活率从之前研究中的(70±5) %提升至(95±5) %，而大麦虫的生长情况也得到明显改善，即经过环境条件优化后的大麦虫质量增加更加明显，说明大麦虫在优化的条件能够更好地摄取和吸收营养物质.另外，条件优化后，大麦虫对泡沫塑料的取食效率得到显著提升，大麦虫在35 d的泡沫塑料取食效率从最低的19.8 mg/条，增加到最高的51.3 mg/条.通过对实验环境条件的优化可以明显提升大麦虫对PS泡沫塑料的取食.
2.5 消化道中塑料降解核心功能菌群探究利用Miseq测序获得经过环境因素优化后大麦虫消化道内潜在PS泡沫塑料降解核心功能菌群特征.以喂食麦麸的大麦虫为对照，选择取食PS泡沫塑料的大麦虫消化道中相对丰度变化最明显的前15个OTU进行分析.如图 8所示，Spiroplasma，Klebsiella和unclassified(un.) Enterobacteriaceae 3个菌属在两组中的含量均占较大比例，推断为其肠道中普遍存在的菌属；Spiroplasma菌群丰度显著降低，说明取食PS塑料后其生长受到抑制.
图 8(Fig. 8)
 | 图 8 大麦虫消化道菌属水平菌群结构变化Fig.8 Changes of gut microbiome in the genus level |
大麦虫取食塑料后消化道菌群丰度增加最明显的前10个OTU如图 9所示.其中，unclassified Enterobacteriaceae的相对丰度增加最明显，从11.35%增加至20.11%；Enterococcus和Dysgonomonas分别从2.29%和1.06%增加至6.09%和4.75%；Sphingobacterium只在PS组出现，比例为2.92%.在之前的研究中，Peng等[19]和Brandon等[12]均指出Enterobacteriaceae和Enterococcus中可能存在降解PS泡沫塑料的功能菌.除上述2个菌属外，本研究还认为Dysgonomonas和Sphingobacterium菌属也可能与塑料在大麦虫消化道内的降解有关.另外，取食塑料后Klebsiella，Fervidicella，Acinetobacter，Mangrovibacter，Chryseobacterium和Serratia等菌属对应的OTU相对丰度也有明显增长，也可能存在与降解PS塑料有关的功能菌.对比之前研究，杨莉等[16]也推断Dysgonmonas和Klebsiella可能与PS泡沫塑料的降解相关.
图 9(Fig. 9)
 | 图 9 大麦虫消化道潜在塑料降解功能菌Fig.9 Potential plastic-degrading biaceria in the gut of Zophobas atratus |
3 结论1) 大麦虫的生长和取食泡沫塑料受光照、塑料密度和接触面积的影响显著.优化外界环境因子，可以提升大麦虫的存活率和取食效率.
2) 在黑暗条件下，大麦虫幼虫对密度低、泡沫化程度高和破碎度低的泡沫塑料取食效果更好，在实际生产或者实验中，不建议对泡沫塑料进行破碎化的前处理.
3) 仅以泡沫塑料作为饲料会影响大麦虫的正常生长，限制其取食塑料的效果.
4) 通过对光照、塑料密度和塑料接触面积等实验条件优化，使大麦虫的存活率大幅提升，由70%提升至95%，显著降低塑料降解研究中环境因子的扰动.
5) 取食PS泡沫塑料对大麦虫肠道菌群结构影响显著，unclassified Enterobacteriaceae，Enterococcus，Dysgonomonas，Sphingobacterium等菌属丰度显著增加，推断与PS泡沫塑料的降解密切相关.
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