赵鑫, 刘芳, 赵研, 胡筱敏
东北大学 资源与土木工程学院, 辽宁 沈阳 110819
收稿日期：2017-04-05
基金项目：国家科技重大专项(2013ZX07202-010)。
作者简介：赵鑫(1982-)，男，辽宁沈阳人，东北大学副教授，博士;
胡筱敏(1958-)，男，江西婺源人，东北大学教授，博士生导师。

摘要：使用2株具有良好的好氧反硝化能力的假单胞菌对序批式反应器(SBR)进行生物强化, 连续运行61 d, 探讨进水C/N变化对微生物强化SBR内微生物菌群和其脱氮效率的影响.随着C/N降低, 反硝化效率明显降低, 但是经强化的SBR的反硝化效率始终优于对照组, 向活性污泥中接种好氧反硝化细菌后, NO₃^--N去除率最高提升14.1%, 使用纯菌构建人工菌群可将NO₃^--N去除率提高22.6%.使用好氧反硝化菌进行强化可以提升反硝化细菌所占比例, 促使其迅速成为优势功能菌群, 缩短系统的启动周期, 大幅提高系统的反硝化效率, 并且提高菌群结构和系统运行的稳定性.该技术在处理C/N>10:1的含硝酸盐的污水时更具优势.
关键词：生物强化好氧反硝化序批式反应器脱氮效率菌群结构分析
Effects of C/N on the Denitrification Efficiency of SBR Enhanced by Aerobic Denitrifying Bacteria
ZHAO Xin, LIU Fang, ZHAO Yan, HU Xiao-min
School of Resources & Civil Engineering, Northeastern University, Shenyang 110819, China
Corresponding author: ZHAO Xin, E-mail: zhaoxin@mail.neu.edu.cn
Abstract: Two strains of Pseudomonas with efficient aerobic denitrification ability were used in the bio-augmentation process of sequencing batch reactor. In the 61 days' operating process, the effects of C/N on the microbial community structures and denitrification efficiency were investigated. Although the denitrification efficiencies obviously decreased with the C/N decreasing, the performances of bio-augmentation groups were better than those of the negative control. Adding efficient aerobic denitrifiers into activated sludge enhanced the NO₃^--N removal rate by about 14.1%, whereas the pure-cultured group was enhanced by 22.6%. Bio-augmentation with aerobic denitrifiers enhanced the proportion of denitrifiers, promoted them to be the dominant functional population, shortened the system's start-up period, greatly enhanced the denitrification efficiency, and improved the stability of the microbial community structure and the system's operation. This technique is more advantageous in the treatment of C/N>10:1 wastewater containing nitrate.
Key words: bio-augmentationaerobic denitrificationSBRdenitrification efficiencymicrobial community structure analysis
水体中的氮主要以有机氮、氨氮和硝酸盐氮的形式存在, 氮含量过高不仅会成为水体富营养化、水体黑臭的直接诱因, 而且会对水生态环境产生巨大危害, 加重水生态系统修复难度和成本, 甚至对人类及其他生物产生毒害.据统计, 中国2014年氨氮排放总量238.5万t^[1], 远远超出受纳水体的环境容量, 污染负荷压力大, 导致地表水体氮素含量严重超标, 氮污染已超过COD，成为影响地表水水环境质量的首要指标^[2].
在传统的生物脱氮技术中, 由于硝化菌和反硝化菌对溶解氧、pH等反应条件的不同要求, 往往需要分隔出好氧区和厌氧区, 工艺复杂, 且运行时间长.好氧反硝化菌的发现成功解决了这一难题, 它能够在有氧条件下进行反硝化反应, 实现硝化反硝化反应在时间和空间上的统一.同步硝化反硝化(SND)是应用好氧反硝化菌进行脱氮的一种高效手段, 可在同一反应系统的相同条件下实现硝化和反硝化过程, 简化操作的难度, 大幅降低投资费用和运行成本^[3-5].碳氮比(简写为C/N)是影响SND的重要因子, C/N越高, 反硝化碳源越充分, SND现象愈明显, 脱氮效率也越高^[6-8].
本研究尝试使用好氧反硝化菌对序批式反应器(sequencing batch reactor, SBR)进行微生物强化, 探讨不同C/N条件对污染物的去除效率; 结合高通量测序技术解析微生物群落结构的演替, 通过对反硝化效率、污染物去除率和系统稳定性的比较分析, 评价好氧反硝化微生物强化的可行性, 为该技术的工程应用提供前期技术支撑.
1 材料与方法1.1 菌种来源实验使用的好氧反硝化细菌Pseudomonas chengduensis ADM 2-2(KY458157)和Pseudomonas chloritidismutans ADM 8-1(KY458158)保存于东北大学环境工程系.2株菌的好氧反硝化最佳pH分别为11和9, 最佳碳源均为柠檬酸钠, 最佳C/N分别为11和13, 最佳NaCl质量浓度分别为20 g/L和30 g/L.在最适条件下, 硝态氮(NO₃^--N)初始质量浓度为170 mg/L, 48 h的最大去除率分别为87.83%和88.06%.
1.2 培养基与进水水质好氧反硝化菌使用的培养基(g/L):柠檬酸钠2.8, KNO₃ 0.72, KH₂PO₄ 1, MgSO₄·7H₂O 1；pH=8.0, 121 ℃高压灭菌后备用.
连续流实验进水采用模拟配水, 柠檬酸钠和琥珀酸钠为碳源, KNO₃为唯一氮源, pH=8.0±1.0, C/N变化情况如表 1所示.
表 1(Table 1)

表 1 主要进水指标Table 1 Data of influent quality 阶段 时间/d C/N Ⅰ 1~21 20 1 500±20 75±10 Ⅱ 22~29 17 1 275±20 75±10 Ⅲ 30~37 14 1 050±20 75±10 Ⅳ 38~45 11 825±20 75±10 Ⅴ 46~53 8 600±20 75±10 Ⅵ 54~61 5 375±20 75±10

表 1 主要进水指标 Table 1 Data of influent quality

1.3 实验装置实验采用3个SBR完成, 有效容积4 L(见图 1).采用时控开关控制, 间歇运行, 反应周期8 h; 每个循环进水5 min；曝气7 h, 沉淀50 min, 出水5 min；蠕动泵进水, 重力引流出水, 以磁力阀控制出水开关；曝气泵供气, 以转子流量计控制曝气量.
图 1(Fig. 1)

图 1 SBR示意图Fig.1 Diagram of the SBR

1.4 SBR启动运行及微生物强化方法SBR Ⅰ为对照组, 仅投加50%活性污泥(MLSS 4 800 mg/L); SBR Ⅱ投加45%活性污泥(MLSS 4 800 mg/L), 并同时接种5%的ADM 2-2菌液和5%的ADM 8-1菌液(MLSS均为2 000 mg/L); SBR Ⅲ同时接种5%的ADM 2-2菌液和5%的ADM 8-1菌液(MLSS均为2 000 mg/L).菌液加入量均以体积分数计.
1.5 水质参数分析方法主要水质参数指标包括COD_Cr、氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮以及活性污泥质量浓度MLSS, 分析方法按照国标的标准方法操作^[9].
1.6 微生物群落结构分析方法微生物群落结构分析使用高通量测序技术, 委托上海美吉生物公司完成, 扩增使用16S rRNA的V3-V4区通用引物341F(5′-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3′)和805R(5′-GAC TAC HVG GGT ATC TAA TCC-3′).
2 结果与讨论2.1 好氧反硝化菌的微生物强化将富集培养的ADM 2-2，ADM 8-1按比例接种到SBR中, 比较微生物强化对SBR脱氮的效率差异和系统稳定性; 待系统基本稳定时, 逐渐调整进水COD负荷, 降低进水C/N(COD/N), 探讨C/N对系统和微生物群落演替的影响.C/N从启动阶段的20:1逐渐降低为17:1, 14:1, 11:1, 8:1, 5:1, 其中启动阶段持续21 d, 其余各阶段均持续8 d.虽然, 反应器出水COD质量浓度随进水C/N的下降而降低, 但是总体看3个SBR对COD的去除率一直保持相对稳定, 平均保持在90%左右, 仅略有提升.
COD去除效果如图 2所示, 开始启动时3组装置的COD去除率依次为83.2%, 85.13%, 87.56%.相比对照组, 投入强化微生物的SBR对COD的去除率较高.启动3 d后, SBR Ⅱ COD去除率的每日增量分别为2.06%和1.63%, 略低于对照组反应器的3.41%和3.23%, 推断是投加的反硝化菌与活性污泥中原有微生物菌群形成竞争.从第4天开始, SBR Ⅱ的COD去除率上升速度明显加快, 这说明菌液中的微生物在竞争中逐渐取得优势.SBR Ⅲ在启动初期一直具有较高的COD去除率, 到第3天, SBR Ⅲ的COD去除率就能达到94.41%, 可见菌液在扩大培养之后仍然具有较高的有机物去除能力.在反应器运行的整个过程中, 3组SBR的COD去除率都维持较高水平(≥90%).
图 2(Fig. 2)

图 2 COD去除效果Fig.2 Removal rate of COD

NO₃^--N的去除率变化如图 3所示.运行第1天, 3组SBR的NO₃^--N去除率整体较低, 分别为65.5%, 65.5%, 76.2%;SBR Ⅲ的NO₃^--N去除率明显高于其他2组反应器, 说明菌株混合液不仅具有较快生长繁殖速度, 扩大培养之后仍具有良好的好氧反硝化性能.随着反应器运行, 3组装置的NO₃^--N去除率逐步提升, 从第10天起₃^--N的去除进入稳定状态₃^--N的去除率分别为79.4%, 84.5%, 93.0%;运行第15天, 经强化的SBR Ⅱ的NO₃^--N去除率与对照组产生最大差值, 相差14.1%;而运行第11天时, SBR Ⅲ的NO₃^--N去除率与对照组差值最大，达18.6%.可见, 采用好氧反硝化菌强化SBR反应器可以明显提高SBR系统的反硝化效率, 如果采用纯菌构建人工生物群落，脱氮性能会更好.
图 3(Fig. 3)

图 3 NO3--N去除效果Fig.3 Removal rate of NO3--N

从运行第22天起, 开始阶段性降低进水C/N₃^--N的去除率随之出现明显波动, 先急剧下降, 然后逐渐适应并上升, 再趋于稳定, 体现了系统中微生物受外界环境扰动而产生的变化; 而且3组SBR的NO₃^--N去除率明显受到进水C/N降低的影响, 即降低进水C/N会抑制好氧反硝化反应.进水C/N从20:1降低到11:1的过程中, SBR Ⅲ中纯培养反硝化菌的NO₃^--N去除率始终高于另外2组装置, 说明纯培养细菌和微生物强化的SBR对于NO₃^--N有更好的去除能力; 当C/N=11:1时, 3组反应器的NO₃^--N去除率已经分别从C/N=20:1时的79.4%, 84.5%和93.0%降低至50.3%, 56.3%和64.5%;纯培养细菌和微生物强化组的去除率始终高于对照组.当进水C/N＜11:1时, 投加纯培养细菌的SBR Ⅲ更容易产生波动, 微生物强化的SBR Ⅱ的NO₃^--N去除率优势逐渐减弱.C/N=8:1时, 3组SBR稳定运行时的NO₃^--N去除率分别为49.8%, 51.6%, 54.2%.当C/N=5:1时, SBR Ⅱ和SBR Ⅲ的NO₃^--N去除率优势消失, 并低于对照组; 此时的平均NO₃^--N去除率分别为43.6%, 40.2%, 39.7%, 原本最有优势的SBR Ⅲ的NO₃^--N去除率变为最低.
由于假单胞菌属细菌为异养菌, 在生长代谢过程中对碳源有强烈依赖：在碳源较多时, 反硝化反应进行速度快, 而碳源不足时, 生长代谢受到影响, 导致生长受到抑制, 优势地位逐渐被其他细菌取代.在3组SBR中, 进水C/N偏低时, SBR Ⅱ和SBR Ⅲ的NO₃^--N去除率明显相应降低, 特别是SBR Ⅲ, 由于仅投加了纯培养细菌, 当条件不适宜时, 就会产生明显的波动现象, 影响系统的稳定性, 耐受冲击负荷能力差.SBR Ⅱ经过微生物强化后₃^--N去除率明显优于空白对照组, 而且当进水C/N调整后, 耐受能力也更强一些.
综合分析, 在3组SBR中, 经过微生物强化的SBR Ⅱ的去除效率高于空白对照组, 耐受外界干扰并进行快速自我调节的能力要优于纯培养细菌组.因此, 微生物强化组的能力更具有优势.
2.2 微生物群落结构分析对3组SBR在61 d内的微生物群落变化进行分析, 分别选择6批次样品进行分析:第0天(Rx-0)、第10天(Rx-1), 第21天(Rx-2), 第29天(Rx-3), 第45天(Rx-4)和第61天(Rx-5), x是SBR编号.其中第21天(包括第21天)之前为SBR的启动期, 后面3次取样对应调整进水C/N的样品.污泥样品经抽提基因组DNA后扩增、测序, 测序结果按照97%相似性对非重复序列进行OTU(operational taxonomic units)聚类, 丰度低于1%的菌合并归入Others, 具体结果如图 4所示.
图 4(Fig. 4)

图 4 样品微生物群落结构分析Fig.4 Analysis of the microorganism community structure

由于接种污泥来自城市污水处理厂的生化池, 所以初始污泥中的微生物多样性较高且没有明显的优势菌种.在R1-0和R2-0样品中, 优势菌主要来源于Flavobacterium, Amaricoccus和Azoarcus, 分别约占7.0%, 5.8%和5.7%.这3个菌属的细菌均为生化池内的常见菌属, 具有有机污染物去除能力和一定的硝化除磷能力^[10-11].初始污泥中具有好氧反硝化能力的微生物比例很低, 推断是导致反应器启动初期反硝化效率低的原因.在SBR Ⅲ中, 投加了富集培养的假单胞菌, 因此在R3-0的样品中, 均为Pseudomonas菌属细菌, 优势非常明显.
在SBR的启动期, 3组SBR中占据优势种群地位的均是Pseudomonas细菌, 但是SBR Ⅱ和SBR Ⅲ中的比例更高.人工投加的强化细菌改变了污泥中的微生物群落组成, 假单胞菌属细菌丰度的增加大幅提升了系统的反硝化能力, 这也是SBR Ⅱ和SBR Ⅲ的NO₃^--N去除效率始终高于对照组的原因.
随着进水C/N的降低, 3组SBR中的假单胞菌属细菌所占比例明显降低, SBR Ⅰ和Ⅱ中下降比例最明显, 在第29天, 假单胞菌属细菌在3组SBR中的比例分别为R1:18.3%, R2:37.5%, R3:52.7%, 分别是C/N调整之前的53.8%, 57.7%和69.3%.假单胞菌数量的降低, 明显改变了3组SBR的NO₃^--N去除率, 微生物的群落结构变化与NO₃^--N去除率曲线形成了明显的呼应.SBR Ⅰ中, 微生物种类仍多于Ⅱ和Ⅲ, 假单胞菌是此时系统中主要的好氧反硝化功能微生物.随着进水C/N进一步降低, 在SBR Ⅱ和Ⅲ中出现了一定比例的Azoarcus属细菌, Azoarcus也是污水处理厂生化池中常见的异养反硝化细菌, 但是比Pseudomonas细菌的反硝化能力弱, 对碳源的需求也较高^[12-13].在第45天, 进水C/N=11:1, Pseudomonas和Azoarcus所占的比例进一步降低, 这与进水碳源含量明显降低和功能菌生长受抑制有关, 并导致反硝化效率进一步下降.当进水C/N=5:1(第61天)时, 3组SBR内Pseudomonas比例均大幅降至17%以下, 3组SBR的好氧反硝化率均维持在40%左右，此时的Pseudomonas已经不是系统中的优势菌群.3组SBR中的情况基本相同, 系统中的Amaricoccus，Flavobacterium和Thauera占有更高的比例，3种菌也是活性污泥中的常见细菌, 与Azoarcus相同，也具有一定的硝化和反硝化能力, 可以去除水中一些其他污染物.其中, 已知的Thauera(陶厄氏菌属)通常也具有反硝化能力^[14-15].
通过比较3组SBR中的微生物菌群结构变化发现, 投加好氧反硝化细菌可以明显提升功能菌所占的比例, 从而提升系统的反硝化效率; 使用纯培养细菌构建反硝化菌群，虽然反硝化效率较高, 但容易受到低碳氮比等外界因素的扰动, 影响系统稳定性.微生物强化方法应用于处理高碳氮比的硝酸盐污水更具优势.
3 结论1) 采用好氧反硝化菌对SBR进行强化可以有效提升反硝化细菌在菌群中所占比例, 促使好氧反硝化细菌迅速成为优势功能菌群; 可以在不增加额外运行成本的前提下, 缩短系统的启动周期, 并且大幅提高系统的反硝化效率.
2) 虽然采用纯菌构建的反硝化微生物菌群效率更高, 但是经微生物强化的系统耐受外界环境变化扰动的能力强, 系统菌群结构稳定, 受扰动后恢复周期缩短.
3) 使用投加好氧反硝化菌进行微生物强化的技术在处理C/N>10:1的含硝酸盐的污水时更有优势.
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