脂滴是维持脂质和能量稳态的关键细胞器，由中性脂组成的内核及包裹其外的单层磷脂组成。脂滴表面分布着多种蛋白，以调控脂类的储存、代谢及脂滴运动。越来越多的研究揭示，脂滴具有更多的生理功能，例如抗菌免疫能力、促进药物积累和激活能力、内核膜代谢能力、与其他细胞器相互作用以交换营养分子、作为癌症和衰老大脑神经认知功能障碍的标志物等。尽管对脂滴功能的机制缺乏研究，但已证实这些功能与脂滴生命周期的动态密切相关。揭示脂滴的动态有助于研究脂滴的功能机制和发现新的功能。然而，脂滴的数量、位置、大小和组成在细胞之间甚至在同一细胞内可能会有很大差异，脂滴的生命周期、时间和位置上也通常不可预测且难以观察。此外，这些事件在脂滴生命周期中的发生率仍然未知。这种细胞异质性和不可预测性要求用于探测脂滴动态的成像技术不仅具有对脂滴的识别能力，更需要具有较好的空间和时间分辨率，以及长时间的的稳定成像能力。
超分辨荧光成像可突破衍射极限实现最高可达单分子的空间分辨，但荧光团易光漂白而迅速淬灭的问题使得超分辨荧光成像一直面临着时间分辨率低和成像时间长的挑战。因此提高荧光团的光稳定性是超分辨荧光成像面临的前沿问题。
本工作中，徐兆超团队提出了“缓冲荧光探针”（buffering fluorogenic probe，BFP）的策略来解决脂滴动态成像中光稳定性的问题。“缓冲”策略（buffer strategy）是指在成像过程中，脂滴内部光漂白的荧光探针被外部周围新的和完整的荧光探针有效取代，即荧光探针交换速率大于漂白速率时，即可确保脂滴成像的光稳定性。该策略要求探针在脂滴外部时处于荧光淬灭的状态，并且在脂滴外具有较高的浓度以保证足够的缓冲能力。LD-FG有适中的脂溶性保证了既有足够的分子对脂滴进行荧光染色，同时又有足够比例的分子在脂滴外作为缓冲池。缓冲池不仅可以快速补充脂滴中的光漂白探针，保证了长时间荧光成像的光稳定性，还可以及时染色细胞中的新生脂滴，并接收脂滴减小或消亡中释放到外部的探针。
基于LD-FG优异的光稳定性，团队借助结构光照明显微镜对脂滴的多种动态过程进行了高时空分辨率的成像，首次发现了两种新的脂滴融合模式，包括多个脂滴的同时融合和线粒体介导的融合；揭示了细胞不同区域和不同细胞之间的异质性；提出脂肪细胞分化过程中脂滴成熟的新模型，即首先进行快速脂滴融合，接着是缓慢成熟步骤；首次在细胞中观察到融合过程中的哑铃形中间形态，证明聚结（coalescence）并不像以前知道的那样罕见，而是在细胞中无处不在的。
作为最小的生命单元，细胞是含有细胞器、分子复合物和功能单分子的多体系、跨尺度的复杂系统，不同尺度单元又根据其位置、结构、运动、浓度以及与其他功能单元的动态相互作用，精确、有序和协调地执行复杂多样的细胞功能，这使得细胞具有个体与系统性相统一、异质性、高度动态、不确定性等多种特征。团队期望“缓冲荧光探针（BFP）”的策略可以在未来用于开发针对更多不同细胞内生物靶点的光稳定探针，最终实现细胞内生物分子全景超时空分辨动态成像。
相关成果以“Stable Super-resolution Imaging of lLpid Droplet Dynamics through a Buffer Strategy with a Hydrogen-bond Sensitive Fluorogenic Probe”为题，于近日发表在《德国应用化学》（Angew. Chem. Int. Ed.）上。该工作的第一作者是我所1818组博士研究生陈婕和博士后王超。该工作得到国家自然科学基金、我所创新基金等项目的资助。（文/图 陈婕）
文章链接： https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202111052
