纳米孔作为一种单分子蛋白质传感手段的优势正在逐渐显现。许多工作已经证明纳米孔能以单分子分辨率对蛋白质进行识别和结构动力学直接分析。然而，蛋白质与核酸不同，其表面电荷分布和整体带电性质差异较大，难以在统一的测试环境下都获得足够的捕获效率，这使得同时感知不同电荷蛋白质的传感器设计变得复杂。近年来，研究者通过工程化改造纳米孔内电荷分布的策略增加电渗透（EOF）作用，已经开发了一系列适合蛋白质分析的生物纳米孔道例如溶细胞素A（ClyA），曲霉毒素C（FraC）和胸膜溶素AB（PlyAB）。但这种策略可能影响待测蛋白和纳米孔的结构稳定性，影响分析效率。同时，以上分析系统均暂未实现生物样品的直接检测。
图1. 机器学习辅助MspA纳米势阱同时检测不同电荷蛋白质
最近，我校黄硕教授课题组提出了一种简单有效的方案，将KCl/CaCl2不对称电解质缓冲液与耻垢分枝杆菌孔蛋白A (MspA) 检测系统相结合构建电渗透(EOF)纳米势阱。这种方法可以将纳米孔对蛋白质的捕获效率提高7~18倍，且分析时间延长达159倍，极大程度提高了纳米孔解析蛋白质的能力。使用这种MspA势阱，天然肌红蛋白（holo-MB）和其脱辅基状态(apo-MB)之间的结构差异可以被清晰的分辨；另外，两种天然无序蛋白（ATCR和NCBD）形成复合物前后的结构差异也可以在单分子尺度被清晰的表征。更重要的是，碱性的溶菌酶(pI=11)、中性的apo/holo-肌红蛋白（pI=8.5 和7.3）和酸性的ACTR/NCBD复合物（pI=5.75）可在pH=7.0的测试环境下被同时传感。这是纳米孔分析策略中首次实现不同电荷性质的蛋白质的同时检测。
图2. MspA纳米势阱鉴别市售乳清蛋白粉中的ɑ-乳白蛋白和β-乳球蛋白
进一步，为了实现混合传感事件分类的自动化，作者提取了蛋白质对离子流阻塞的七个特征构建了机器学习分类模型，对不同蛋白质的鉴定准确率可达到99.9%。这种机器学习辅助的MspA纳米势阱可以被用于直接从市售乳清蛋白粉中快速鉴定并定量两种酸性蛋白：ɑ-乳白蛋白和β-乳球蛋白，无需对样品做任何的纯化预处理步骤，样品浓度0.4 μg/mL即可测试。验证了该策略在从混合物中对蛋白质的快速和敏感检测或实时结构分析方面的具有非常好的应用前景，为纳米孔的蛋白质无标签直接分析提供了新的思路。
该工作以"Machine Learning Assisted Simultaneous Structural Profiling of Differently Charged Proteins in a Mycobacterium smegmatis Porin A (MspA) Electroosmotic Trap"为题，于2022年1月7日发表于《美国化学学会期刊》（DOI：https://doi.org/10.1021/jacs.1c09259）我校化学化工学院博士生刘瑶为改论文的第一作者，我校化学化工学院黄硕教授为论文通讯作者，陈洪渊院士对该工作做出了重要指导。此项研究得到了生命分析化学国家重点实验室以及南京大学化学和生物医药创新研究院(ChemBIC)的重要支持，国家自然科学基金（项目编号：31972917, 91753108, 21675083）、中央高校基本科研业务费资助项目(项目编号：020514380257, 020514380261)、江苏省高层次创业创新人才引进计划（个人、团体计划）、江苏省自然科学基金（项目编号：BK20200009）、南京大学生命科学分析化学国家重点实验室(项目编号:5431ZZXM1902)、南京大学科技创新基金资助项目、中国博士后科学基金资助项目(项目编号：2021M691508)等提供了经费支持。
论文链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c09259
