RNA是由四种核糖核苷酸以共价键连接而成的线性聚合物，其结构呈现出多样的变化性，一般存在一级、二级和三级三种结构层次。一级结构是指核糖核苷酸的排列顺序，二级结构是指碱基之间非共价相互作用的二维表示，三级结构是指二维结构单元之间通过非共价相互作用形成的三维空间结构，包括双螺旋、吻式结构、假结结构、核糖拉链以及最为经典tRNA L型三级结构等。目前对RNA结构-功能关系的理解是有限的，主要原因是普遍缺乏高分辨率的结构信息。经典的结构生物学方法如X-ray、NMR或EM往往需要暴力的样品前处理，容易破坏RNA天然的三级结构。随着越多越多新的RNA生物学功能被迅速发现，迫切需要开发一种新型温和的天然RNA三级结构表征方法。
生物纳米孔被证明是一种新型的单分子传感器。该技术利用分子穿过孔道时产生的特异性指纹信号进行单分子识别，可以分辨细微的理化性质和结构差异，同时兼具无需任何样品前处理等优势，有望实现天然状态下RNA三级结构的直接检测。但由于孔径（1-2 nm）限制，结构化的生物大分子在通过纳米孔被检测的过程中往往需要解折叠成一维线性结构，因而现阶段该技术尚无法直接探测RNA等生物大分子的天然结构。
近日，我校化学化工学院黄硕、物理学院李文飞等共同报道了一种新型的纳米孔势阱检测方法，巧妙地利用锥形结构的耻垢分枝杆菌膜蛋白A(MspA)的宽阔前庭，将复杂结构的RNA分子捕获至其纳米空腔中，汇报其空间结构信息。同时利用孔道狭窄的识别位点汇报RNA解折叠动力学信息，以此实现miRNA, siRNA, tRNA, rRNA等低分子量RNA三级结构的高分辨检测与区分。

图1: 利用MspA纳米孔势阱区分低分子量RNA结构。
进一步的分子动力学模拟发现， tRNA的L型三级结构被MspA捕获时存在多种进孔构型，因此在纳米孔传感中可以汇报多种特征信号。这表明MspA纳米孔势阱具有高分辨检测能力，对于几何不对称的RNA分子可以汇报丰富的RNA结构信号。辅助分子动力学模拟可以对其信号机制进行精准解读。



图2：分子动力学模拟揭示tRNA过孔信号机制。
针对这些丰富的RNA特征信号，该工作进一步开发了多参数机器学习算法，综合11种特征指标，实现RNA混合样本中传感事件的自动分拣，准确率高达93.4%。在此基础上，该团队首次从单分子层面上发现了tRNA结构的跨物种保守性，并实现了酵母低分子量RNA的直接检测。这种基于MspA的纳米孔势阱检测技术打破领域内纳米孔无法检测大尺寸生物分子的思维定式和技术瓶颈，为结构化的DNA、RNA以及蛋白质的直接检测提供新的思路。该工作还为研究RNA-客体分子相互作用，以及理解RNA复杂的生理功能和RNA疾病相关研究提供高分辨、免标记的单分子分析工具。

图3：机器学习辅助的RNA信号自动识别
该工作以“Structural-profiling of low molecular weight (LMW) RNAs by nanopore trapping/translocation using Mycobacterium smegmatis porin A (MspA)”为题，于2021年6月7日在《Nature Communications》发表相关论文（DOI：10.1038/s41467-021-23764-y，文章链接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-23764-y）, 我校化学化工学院王玉琴博士后和南京航空航天大学关晓宇博士为该论文共同第一作者。我校化学化工学院黄硕教授、物理学院李文飞教授和南京航空航天大学张道强教授为该论文共同通讯作者。 此项研究得到了国家自然科学基金（项目编号：91753108、31972917、21675083、11974173）、江苏省高层次创业创新人才引进计划（个人、团体计划）、 江苏省自然科学基金（项目编号：BK20200009）、南京大学优秀科研计划（项目编号：ZYJH004）、生命分析化学国家重点实验室（项目编号：5431ZZXM1902）、南京大学科技创新基金项目和南京大学高性能计算研究中心等经费支持。