张献,彭涛,张耀,李若熙,杨丽娟
(酿酒生物技术及应用四川省重点实验室(四川轻化工大学),四川 宜宾 644000)
摘要:
氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate, EC)是酒精饮料生产过程中自然产生的副产物,具有潜在的致癌性和遗传毒性,成为影响人们健康的隐患。利用氨基甲酸乙酯水解酶(Urethane hydrolase, UH)消除酒精饮料中已存在的EC具有直接、高效的作用。为了进一步探索EC水解酶的功能与作用,本实验利用生物信息学的方法对已注释的EC水解酶进行其氨基酸序列的理化性质、亲疏水性、信号肽、跨膜结构域、蛋白质的二级、三级结构及功能域进行预测分析,并将EC水解酶蛋白进行多序列比对分析。结果表明,EC水解酶基因编码472~551 aa,分子量在50~62 kD之间,理论等电点(pI)在5左右,均为酸性亲水性蛋白,无跨膜区和信号肽。二级结构预测结果显示EC水解酶的氨基酸都以α螺旋以及无规则卷曲为主,螺旋与折叠排列有序。此外,使用同源建模的方法对EC水解酶进行模型的构建,预测结果质量评估均较好,并使用同源比对的方法,分析出EC水解酶高保守氨基酸残基。这些分析与预测为挖掘新的EC水解酶、进一步研究EC与EC水解酶结合位点以及对EC水解酶的改造提供了理论依据。
关键词: 氨基甲酸乙酯 氨基甲酸乙酯水解酶 生物信息学 结构预测
DOI：10.12113/202011002
分类号:Q55
文献标识码:A
基金项目:四川轻化工大学人才引进项目(No.E10402638).
Bioinformatics analysis of urethane hydrolase family
ZHANG Xian, PENG Tao, ZHANG Yao, LI Ruoxi, YANG Lijuan
(Liquor Making Bio-Technology & Application of Key Laboratory of Sichuan Province (Sichuan University of Science & Engineering), Yibin 644000, Sichuan,China)
Abstract:
Ethyl carbamate (EC) is a naturally produced by-product in the production of alcoholic beverages. It has potential carcinogenicity and genetic toxicity, and has become a hidden danger that affects peoples health. The use of urethane hydrolase (UH) to eliminate the existing EC in alcoholic beverages has a direct and efficient effect. In order to further explore the function and role of EC hydrolase, the bioinformatics methods were adopted to analyze the physical and chemical properties hydrophilicity and hydrophobicity, signal peptide, transmembrane domain, protein secondary and tertiary structure, and functional domains of the of amino acid sequence annotated EC hydrolase, and the EC hydrolase protein was subjected to multiple sequence comparison analysis. Results show that the EC hydrolase gene encoded 472-551 aa, the molecular weight was between 50-62 kD, and the theoretical isoelectric point (pI) was about 5. They were all acidic hydrophilic proteins without transmembrane domain and signal peptide. The secondary structure prediction results show that the amino acids of EC hydrolase were mainly alpha helix and random coil, and the helix and fold were arranged in order. In addition, the method of homology modeling was used to construct a model of EC hydrolase, and the quality evaluation of the prediction results was good. The highly conserved amino acid residues of EC hydrolase were analyzed by homology comparison. These analyses and predictions provide theoretical basis for further research on the binding sites of EC and EC hydrolase and the modification of EC hydrolase.
Key words: Ethyl carbamate Urethane hydrolase Bioinformatics Structure prediction
张献, 彭涛, 张耀, 李若熙, 杨丽娟. 氨基甲酸乙酯水解酶的家族生物信息学分析[J]. 生物信息学, 2022, 20(1): 64-74. DOI: 10.12113/202011002.
ZHANG Xian, PENG Tao, ZHANG Yao, LI Ruoxi, YANG Lijuan. Bioinformatics analysis of urethane hydrolase family[J]. Chinese Journal of Bioinformatics, 2022, 20(1): 64-74. DOI: 10.12113/202011002.
基金项目 四川轻化工大学人才引进项目(No.E10402638) 通信作者 杨丽娟，女，副教授，研究方向：生物化学与分子生物学.E-mail: yanglijuan@suse.edu.cn 作者简介 张献，男，硕士研究生，研究方向：食品工程.E-mail: zx15708286249@163.com 文章历史 收稿日期: 2020-11-14 修回日期: 2021-04-25
Contents Abstract Full text Figures/Tables PDF
氨基甲酸乙酯水解酶的家族生物信息学分析
张献
, 彭涛, 张耀, 李若熙, 杨丽娟
酿酒生物技术及应用四川省重点实验室(四川轻化工大学)，四川 宜宾 644000
收稿日期: 2020-11-14; 修回日期: 2021-04-25
基金项目: 四川轻化工大学人才引进项目(No.E10402638)
作者简介:张献，男，硕士研究生，研究方向：食品工程.E-mail: zx15708286249@163.com
通信作者: 杨丽娟，女，副教授，研究方向：生物化学与分子生物学.E-mail: yanglijuan@suse.edu.cn
摘要: 氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate, EC)是酒精饮料生产过程中自然产生的副产物，具有潜在的致癌性和遗传毒性，成为影响人们健康的隐患。利用氨基甲酸乙酯水解酶(Urethane hydrolase, UH)消除酒精饮料中已存在的EC具有直接、高效的作用。为了进一步探索EC水解酶的功能与作用，本实验利用生物信息学的方法对已注释的EC水解酶进行其氨基酸序列的理化性质、亲疏水性、信号肽、跨膜结构域、蛋白质的二级、三级结构及功能域进行预测分析，并将EC水解酶蛋白进行多序列比对分析。结果表明，EC水解酶基因编码472~551 aa，分子量在50~62 kD之间，理论等电点(pI)在5左右，均为酸性亲水性蛋白，无跨膜区和信号肽。二级结构预测结果显示EC水解酶的氨基酸都以α螺旋以及无规则卷曲为主，螺旋与折叠排列有序。此外，使用同源建模的方法对EC水解酶进行模型的构建，预测结果质量评估均较好，并使用同源比对的方法，分析出EC水解酶高保守氨基酸残基。这些分析与预测为挖掘新的EC水解酶、进一步研究EC与EC水解酶结合位点以及对EC水解酶的改造提供了理论依据。
关键词: 氨基甲酸乙酯 氨基甲酸乙酯水解酶 生物信息学 结构预测
Bioinformatics analysis of urethane hydrolase family
ZHANG Xian
, PENG Tao, ZHANG Yao, LI Ruoxi, YANG Lijuan Liquor Making Bio-Technology & Application of Key Laboratory of Sichuan Province (Sichuan University of Science & Engineering), Yibin 644000, Sichuan, China
Abstract: Ethyl carbamate (EC) is a naturally produced by-product in the production of alcoholic beverages. It has potential carcinogenicity and genetic toxicity, and has become a hidden danger that affects people's health. The use of urethane hydrolase (UH) to eliminate the existing EC in alcoholic beverages has a direct and efficient effect. In order to further explore the function and role of EC hydrolase, the bioinformatics methods were adopted to analyze the physical and chemical properties hydrophilicity and hydrophobicity, signal peptide, transmembrane domain, protein secondary and tertiary structure, and functional domains of the of amino acid sequence annotated EC hydrolase, and the EC hydrolase protein was subjected to multiple sequence comparison analysis. Results show that the EC hydrolase gene encoded 472-551 aa, the molecular weight was between 50-62 kD, and the theoretical isoelectric point (pI) was about 5. They were all acidic hydrophilic proteins without transmembrane domain and signal peptide. The secondary structure prediction results show that the amino acids of EC hydrolase were mainly alpha helix and random coil, and the helix and fold were arranged in order. In addition, the method of homology modeling was used to construct a model of EC hydrolase, and the quality evaluation of the prediction results was good. The highly conserved amino acid residues of EC hydrolase were analyzed by homology comparison. These analyses and predictions provide theoretical basis for further research on the binding sites of EC and EC hydrolase and the modification of EC hydrolase.
Key Words: Ethyl carbamate Urethane hydrolase Bioinformatics Structure prediction
氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate或Urethane，简称EC)，存在于多种发酵食品和酒精饮料中，是一种具有致癌性的物质[1-2]。2007年，EC被国际癌症研究机构IARC(the International Agency for Rescarch on Cancer)归类为2A类致癌物质[3]。日本、加拿大等[4-5]国家对酒精饮料中EC含量有着严格的限量标准。目前消除EC有多种方法，包括对发酵工艺的优化、物理吸附、代谢工程改造酵母以及生物酶法消除等，其中用生物酶法来消除EC被认为是最为理想的一种方法[6]。关于消除EC的生物酶研究中，用于EC消除的酶有两种，一种是酸性脲酶(Acid urease)；另外一种就是氨基甲酸乙酯水解酶(Urethane hydrolase或urethanase)。1990年，Kobashi[7]等日本学者从小鼠肠道中的Citrobacter sp.中第一次发现EC水解酶，证实其能够降解EC。2006年，Akutsu-ShigenoY[8]等从马红球菌(Rhodococcus equistrain TB-60)中得到了EC水解酶，并实现了该酶的异源表达。李京京[9]等从小鼠的胃中筛选出一株具有EC降解能力的赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis SC02，并通过对其蛋白质的N段测序，获得了该酶的氨基酸序列。EC水解酶存在于多种微生物中，并且不同微生物的EC水解酶的酶学性质差异较大，普遍存在对乙醇和酸的耐受力差、对底物的亲和力低的问题[8, 10]。2016年，刘晓慧[11]等人通过计算机辅助以及定向改造技术对来自于赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis SC02的EC水解酶进行改造，提高了该酶的温度稳定性，但其对乙醇的耐受力并未有所提升。此外，EC水解酶的氨基酸序列未得到有效解析。2019年，Masaki [12]等日本学者在假丝酵母Candida parapsilosis得到了EC水解酶，并获得了该酶的基因序列。目前，已报道的EC水解酶均属于酰胺酶家族，从EC分子的结构上来看，酯酶家族部分酶也能够对其进行水解，但是还未见有酯酶降解EC的报道[6](见图 1)。EC水解酶存在的这些问题限制了EC水解酶的发展与应用。若采用基因工程以及蛋白质工程的手段，对EC水解酶进行分析优化等研究，解决其存在的问题，可进一步推进EC水解酶在食品中的应用。
图 1(Figure 1)
图 1 氨基甲酸乙酯水解机制[6]Figure 1 Hydrolysis mechanism of urethane[6]本研究采用生物信息学的方法对EC水解酶进行分析，结合ProtParam、ProtScale、SignalP 5.0 Server、NetPhos 2.0 Server等生物信息学软件，对微生物的EC水解酶氨基酸序列分别进行理化性质、序列分子进化、亲水或疏水性、二级结构、功能域、信号肽以及蛋白的磷酸化等方面进行分析和预测，为下一步EC水解酶的酶分子改造、基因工程菌的构建、表达等奠定基础。
1 材料与方法1.1 数据来源试验中的EC水解酶(UH)序列均来自美国国家生物信息中心(NCBI)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中已收录的完整的氨基酸序列，分别来自于马红球菌、赖氨酸芽孢杆菌以及假丝酵母(见表 1)。
表1(Table 1)
表 1 氨基酸序列基本信息Table 1 Basic information of amino acid sequence 微生物名称 酶名称 氨基酸登录号 GanBank 马红球菌 UH - DD320008.1
赖氨酸芽孢杆菌 UH ANG60415.1 KU353448.1
假丝酵母 UH BBP47208.1 LC511748.1
注：“-”表示未查到，马红球菌的氨基酸序列经过基因翻译工具获得.
表 1 氨基酸序列基本信息Table 1 Basic information of amino acid sequence
1.2 方法采用Expasy网站提供的ProtParam工具对EC水解酶的氨基酸序列进行理化性质分析；亲疏水性特征使用Expasy网站的ProtScale工具进行分析；使用在线工具NPSA server中的SOPMA进行微EC水解酶的氨基酸序列二级结构分析和预测[13]；使用CDD和SMART[14]对EC水解酶保守结构的分析；EC水解酶信号肽的分析和预测采用工具SignalP 5.0 server；运用TMHMM 2.0 Server进行EC水解酶的跨膜结构域的分析和预测；NetPhosK 3.1 Server进行EC水解酶的氨基酸序列磷酸化位点分析；使用SWISS-MODEL[15]和I-TASSER对EC水解酶进行3D建模，以及使用SAVES[16]对模型进行评价。利用Clustal Omega[17]进行氨基酸的多序列比对分析，并用ESPript3.0进行序列对比的结果显示。在线分析工具网址(见表 2)。
表2(Table 2)
表 2 生物学在线分析工具网址Table 2 Websites of online biology analysis tools 工具 网址 ProtParam http://web.expasy.org/protparam/
ProtScale http://web.expasy.org/protscale/
SOPMA https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html
CDD https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/
SMART http://smart.embl-heidelberg.de/
SignalP 5.0 server http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/
TMHMM 2.0 Server http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/
NetPhosK 3.1 Server http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/
SWISS-MODEL https://swissmodel.expasy.org/
I-TASSER https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/
SAVES https://servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES
Clustal Omega https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/
ESPript3.0 http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi
表 2 生物学在线分析工具网址Table 2 Websites of online biology analysis tools
2 结果与分析2.1 EC水解酶蛋白序列理化性质分析使用ProtParam工具分析3条完整的EC水解酶蛋白序列(见表 3)。结果显示，目前在NCBI上所能检索到的EC水解酶氨基酸序列中，氨基酸数量在472-551之间，氨基酸数量最大的是假丝酵母，为551 aa，分子量为61.74 kDa左右。理论等电点(pI)范围在5.03~5.71之间，最大的为Candida parapsilosis。三个蛋白的负电荷氨基酸残基总数(Asp + Glu)都大于正电荷氨基酸残基总数(Arg + Lys)。同时对三个EC水解酶的氨基酸残基组成也进行了分析(见表 4)。发现3个EC水解酶蛋白共有的且含量丰富的主要氨基酸为丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、亮氨酸(Leu)。在蛋白质稳定性方面，Rhodococcus equistrain TB-60的EC水解酶不稳定指数为34.70，显示为较稳定蛋白，其余两种蛋白为不稳定蛋白。此外，脂肪系数的结果显示，3个蛋白均表现为亲水性。
表3(Table 3)
表 3 EC水解酶的氨基酸序列理化性质Table 3 Physicochemical properties of amino acid sequence of urethane hydrolase 来源 Rhodococcus equistrain TB-60 Lysinibacillus fusiformis SC02 Candida parapsilosis 基总数/aa 472 472 551
分子量/kDa 50.70 51.48 61.74
pI 5.03 5.39 5.71
Asp + Glu 58 58 67
Arg + Lys 38 45 60
不稳定系数 34.70 40.70 40.20
脂肪系数 83.35 94.85 87.97
总平均亲水系数 -0.213 -0.146 -0.256
表 3 EC水解酶的氨基酸序列理化性质Table 3 Physicochemical properties of amino acid sequence of urethane hydrolase
表4(Table 4)
表 4 EC水解酶家族成员氨基酸组成成分分析Table 4 Analysis of amino acid composition of members of urethane hydrolase family? %Composition of amino acid Rhodococcus equistrain TB-60 Lysinibacillus fusiformis SC02 Candida parapsilosis
Ala (A) 11.4 8.9 7.4
Arg (R) 6.1 3.4 3.8
Asn (N) 3.8 4.7 5.1
Asp (D) 7.2 6.4 6.0
Cys (C) 0.6 0.8 1.5
Gln (Q) 2.5 3.8 2.9
Glu (E) 5.1 5.9 6.2
Gly (G) 10.8 7.8 6.2
His (H) 2.8 2.3 1.3
Ile (I) 3.8 7.4 4.7
Leu (L) 9.1 9.1 11.1
Lys (K) 1.9 6.1 7.1
Met (M) 2.5 1.5 1.6
Phe (F) 2.3 3.6 4.2
Pro (P) 7.0 5.5 6.0
Ser (S) 4.9 6.8 6.5
Thr (T) 5.7 4.4 5.6
Trp (W) 2.8 0.8 1.6
Tyr (Y) 2.1 3.2 4.7
Val (V) 7.4 7.4 6.5
表 4 EC水解酶家族成员氨基酸组成成分分析Table 4 Analysis of amino acid composition of members of urethane hydrolase family?
2.2 EC水解酶氨基酸序列的亲水性/疏水性经过ProtScale对EC水解酶氨基酸序列进行亲水性/疏水性预测。Hphob. /Kyte & Doolittle量表规定疏水性越强的氨基酸标度值越高，当蛋白质的氨基酸标度值大于0时为疏水，小于0时为亲水。
在亲疏性分析中，马红球菌Rhodococcus equistrain TB-60的多肽链中465位Trp的值为-2.156，亲水性最强，第283位Cys的值为2.089，疏水性最强(见图 2a)；赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis SC02的多肽链中第463位Asn的值是-3.344，是最低分，亲水性最强，第229位Leu值是1.978，为最高分，疏水性最强(见图 2b)；假丝酵母Candida parapsilosis的多肽链中第324位Pro的值为-3.244，亲水性最强，第453位Val的值为2.156，疏水性最强(见图 2c)；且在亲疏水性分析中三种微生物的EC水解酶都属于亲水性蛋白。
图 2(Figure 2)
图 2 EC水解酶的亲/疏水性分析Figure 2 Hydrophilicity/hydrophobicity analysis of urethane hydrolase2.3 EC水解酶的信号肽及跨膜区预测利用SignalP 5.0 server对三株菌的EC水解酶的氨基酸序列进行信号肽分析，都表示EC水解酶的氨基酸序列不含有信号肽(见图 3)。
图 3(Figure 3)
图 3 EC水解酶信号肽预测Figure 3 Signal peptide prediction of urethane hydrolase利用在线工具TMHMM 2.0 Server对三株菌的EC水解酶的跨膜区进行分析及预测，3株菌的EC水解酶在膜内的概率为0，在膜外的概率为100%(见图 4)，说明EC水解酶不存在跨膜结构域。
图 4(Figure 4)
图 4 EC水解酶跨膜结构域预测Figure 4 Prediction of transmembrane domain of urethane hydrolase2.4 EC水解酶的磷酸化位点预测磷酸化作为蛋白质翻译后的修饰之一，在细胞的信号转导中起着重要的作用[18]。蛋白质的磷酸化主要集中在肽链中具有游离羟基的酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸残基上，这些残基本身不带电荷，当磷酸化作用后，便具有了电荷，从而使结构发生变化，进一步引起蛋白质活性的变化。通过在线软件NetPhosK 3.1 Server对EC水解酶的氨基酸序列进行预测。EC水解酶氨基酸序列磷酸化位点(见表 5)。Rhodococcus equistrain TB-60的EC水解酶中含有15个丝氨酸位点、10个苏氨酸位点、6个酪氨酸位点；Lysinibacillus fusiformis SC02的EC水解酶中含有23个丝氨酸位点、11个苏氨酸位点、7个酪氨酸位点；Candida parapsilosis的EC水解酶中含有30个丝氨酸位点、16个苏氨酸位点、12个酪氨酸位点。
表5(Table 5)
表 5 EC水解酶氨基酸序列磷酸化位点统计Table 5 Statistics of phosphorylation sites of amino acid sequence of urethane hydrolase 微生物种类 磷酸化位点个数 丝氨酸 苏氨酸 酪氨酸
Rhodococcus equistrain TB-60 15 10 6
Lysinibacillus fusiformis SC02 23 11 7
Candida parapsilosis 30 16 12
表 5 EC水解酶氨基酸序列磷酸化位点统计Table 5 Statistics of phosphorylation sites of amino acid sequence of urethane hydrolase
2.5 二级结构分析蛋白的二级结构一般由α-螺旋、β-链、β-转角和无规则卷曲等结构原件组成[19]。通过SOPMA在线工具对3株菌的EC水解酶的二级结构进行预测，结果(见图 5)。Rhodococcus equistrain TB-60的EC水解酶中α-螺旋占41.53%，延伸链占7.63%，β-转角占3.39%，无规则卷曲占47.46%；Lysinibacillus fusiformis SC02的EC水解酶中α-螺旋占48.09%，延伸链占10.59%，β-转角占3.6%，无规则卷曲占37.71%；Candida parapsilosis的EC水解酶中α-螺旋占39.34%，延伸链占11.07%，β-转角占3.45%，无规则卷曲占46.10%。
图 5(Figure 5)
图 5 EC水解酶二级结构的预测Figure 5 Prediction of secondary structure of urethane hydrolase注：蓝色代表α-螺旋; 绿色代表β-转角; 红色代表延伸链; 紫色代表无规则卷曲.2.6 保守结构域分析通过CDD和SMART对EC水解酶的保守结构域分析得出，来自于三种不同菌的EC水解酶都含有与酰胺酶家族相同的Amidase结构域(见图 6)。
图 6(Figure 6)
图 6 EC水解酶结构域分析Figure 6 Urethane hydrolase domain analysis2.7 蛋白质三级结构的预测与评价2.7.1 蛋白质三级结构在NCBI上检索到的完整的EC水解酶的氨基酸序列有3条。利用NCBI上的blastp功能在蛋白质PDB数据库中分别获得与现存的EC水解酶序列相似度最高的氨基酸序列。Rhodococcus equistrain TB-60的EC水解酶氨基酸序列与Bacterium CSBL00001的芳基酰基酰胺酶(PBD：4YJ1_A)同源性最高，为33.81%。Lysinibacillus fusiformis SC02的EC水解酶氨基酸序列与Pseudomonas aeruginosa PAO1的谷氨酰胺基转移酶A亚基(PDB：4WJ3_A)同源性最高，为39.47%。Candida parapsilosis的EC水解酶氨基酸序列与Rattus norvegicus的脂肪酸酰胺水解酶(PBD: 1MT5_A)同源性最高，为27.98%。由于使用SWISS-MODEL进行建模时，同源序列要大于30%，故对Candida parapsilosis的EC水解酶进行建模时，使用I-TASSER。预测得到的三维结构中(见图 7a、7b、7c)，α-螺旋用红色表示，β-折叠用黄色表示，绿色为无规则卷曲，总体来看，EC水解酶的三维结构均以α-螺旋以及无规则卷曲为主，这预测结果与二级结构预测相对应。
图 7(Figure 7)
图 7 EC水解酶三维结构模型与拉氏构象图Figure 7 Three-dimensional structure model and Ramachandran plot of urethane hydrolase2.7.2 蛋白质三维模型的评价使用在线软件SAVES中的Verify_3D以及拉氏构象图对模型进行评价。Rhodococcus equistrain TB-60的EC水解酶的Verify_3D评分为87.80%；Lysinibacillus fusiformis SC02的EC水解酶的Verify_3D评分为89.44%；Candida parapsilosis的EC水解酶的Verify_3D评分为84.39%。
拉氏构象图简称拉氏图(Ramachandran Plot)，其作用是体现出氨基酸残基在拉氏图中的区域分布。拉氏构象图分为四个区，红色区域是最合适区域，该区域内氨基酸数目越多，则表示该蛋白模型的骨架结构越合理；黄色区域是允许区域；浅黄色区域是最大允许区；而白色区域是不允许区，该区域氨基酸的构象是不合理的。从图 7a、7b、7c可知使用SWISS-MODEL以及I-TASSER所建的EC水解酶模型，处于允许区的氨基酸残基都大于90%，并且不允许区都小于5%。
2.8 蛋白质多序列比对分析利用在线软件Clustal Omega中的多序列比对功能对3个EC水解酶与Bacterium CSBL00001的芳基酰基酰胺酶的氨基酸序列进行比对(见图 8)。三个EC水解酶的序列相似度为29.17%。来自于真菌Candida parapsilosis的EC水解酶氨基酸序列与两个来源于细菌的相似度较低，与Rhodococcus equistrain TB-60序列相似度为14.49%，与Lysinibacillus fusiformis SC02序列相似度为15.22%，而来源于细菌的两菌株氨基酸序列相似度为31.3%。从图中可见位于160位左右的氨基酸残基保守性较强，特别是GGSSGG，这些氨基酸残基在酰胺酶进化过程中具有较强的保守性。
图 8(Figure 8)
图 8 EC水解酶的多序列比对结果Figure 8 Results of multiple sequence alignment of urethane hydrolase3 讨论EC作为2A类致癌物质，广泛存在于酒精饮料等发酵食品中。应用微生物酶法去消除EC具有直接、高效的特点。EC水解酶有三个完整的氨基酸序列得以鉴定，且所发现的EC水解酶在酸性或者乙醇存在条件下不稳定，不能在酒精饮料中得到广泛的应用。如果能利用分子生物学的手段对EC水解酶进行改造，使其能被应用于食品生产过程中，降低食品中EC的浓度，具有重要意义。
生物信息学作为一门交叉学科，利用数学、计算机科学、生命科学技术理论和工具，在生物科学领域的信息获取、加工、储存、分析等方面发挥着重要的作用。本研究利用生物信息学相关方法，在NCBI中查找到三条完整编码EC水解酶的基因序列，对其编码的氨基酸序列组成、基本理化性质进行分析，通过软件预测蛋白的亲疏水性、信号肽、跨膜域，更进一步预测了蛋白的二级以及三维结构。结果表明，三个蛋白序列都具有与酰胺酶家族相同的Amidase保守结构域，证明了目前已公布的EC水解酶都是酰胺酶，与刘庆涛所说的一致[6]。使用计算机进行分析蛋白质的稳定性时，蛋白质的不稳定系数是一个重要的表征。不稳定指数是对蛋白质在实验中的稳定性评估，当蛋白质的不稳定系数大于40时，推测该蛋白质为不稳定蛋白，当小于40时为稳定蛋白[20]。氨基酸序列理化性质分析表明，除Rhodococcus equistrain TB-60的EC水解酶为较稳定蛋白，其余两种蛋白均表现为不稳定蛋白。在蛋白质中，氨基酸之间的亲/疏水性相互作用是形成其三级结构最重要作用力之一，亲疏水作用可以驱使蛋白质进行折叠，有利于蛋白质三级结构的稳定。亲疏水性预测结果显示，三个EC水解酶蛋白均属于亲水性蛋白。对蛋白的信号肽以及跨膜域分析表明，三株菌的EC水解酶都不含有跨膜域以及信号肽。蛋白质二级结构预测发现，EC水解酶都以α-螺旋、无规则卷曲为主。蛋白质空间结构预测，对其结构与功能的研究具有较为重要意义[21]。本研究通过同源建模的方式得到了EC水解酶的三维结构，除对Candida parapsilosis的EC水解酶进行建模时，使用I-TASSER，其余两种均使用SWISS-MODEL进行建模。三维结构模型的合理性通过Verify_3D以及Ramachandran Plot进行验证。Verify_3D用于评估模型的三维结构与氨基酸一级序列结构的相容性，检测氨基酸侧链构象的合理性，SAVES获得的评分≥80%，表明侧链构象合理[22]。三个蛋白的三维结构的Verify_3D评分都大于80%，说明侧链构象合理。在Ramachandran Plot中，模型评价要求处于允许区的氨基酸大于90%，如果二面角中有高于90%的都位于一般允许区，则可表明其空间结构具有一定的稳定性[23-24]。三个蛋白质三维结构模型中处于允许区的氨基酸均大于90%，表明模型中所有氨基酸均形成了一个合理的二面角稳定构型。
4 结论1) EC水解酶基因编码472~551 aa，分子量在50~62 kD之间，理论等电点(pI)在5左右，均为酸性亲水性蛋白；
2) 目前EC水解酶无跨膜区和信号肽；
3) 二级结构预测结果显示EC水解酶的氨基酸都以α螺旋以及无规则卷曲为主，螺旋与折叠排列有序；
4) 目前发现的EC水解酶均属于酰胺酶家族；
5) 对EC水解酶进行三维模型的构建，预测结果质量评估均较好，并使用同源比对的方法，分析出EC水解酶高保守氨基酸残基。利用生物信息学相关软件对EC水解酶蛋白进行预测和分析，为挖掘新的EC水解酶、进一步研究EC与EC水解酶结合位点以及对EC水解酶的改造提供了理论依据。
参考文献
[1] FORKERT P G. Mechanisms of lung tumorigenesis by ethyl carbamate and vinyl carbamate[J]. Drug Metabolism Reviews, 2010, 42(2): 355-378. DOI:10.3109/03602531003611915 (
0)[2] ZHAO X R, DU G C, ZOU H J, et al. Progress in preventing the accumulation of ethyl carbamate in alcoholic beverages[J]. Trends in Food Science & Technology, 2013, 32(2): 97-107. DOI:10.1016/j.tifs.2013.05.009 (
0)[3] LACHENMEIER D W. Consequences of IARC re-evaluation of alcoholic beverage consumption and ethyl carbamate on food control[J]. Deutsche Lebensmittel Rundschau Zeitschrift Für Lebensmittelkunde Und Lebensmittelrecht, 2007, 103(7): 307-311. DOI:10.5281/zenodo.3463116 (
0)[4] GOWD V, SU H, KARLOVSKY P, et al. Ethyl carbamate: An emerging food and environmental toxicant[J]. Food Chemistry, 2018, 248: 312-321. DOI:10.1016/j.foodchem.2017.12.072 (
0)[5] WEBER J V, SHARYPOV V I. Ethyl carbamate in foods and beverages: a review[J]. Environmental Chemistry Letters, 2009, 7(3): 233-247. DOI:10.1007/s10311-008-0168-8 (
0)[6] 刘庆涛, 康振, 堵国成. 微生物酶法消除黄酒中氨基甲酸乙酯研究进展[J]. 生物工程学报, 2019, 35(4): 567-576.
LIU Qingtao, KANG Zhen, DU Guocheng. Advances in microbial enzymatic elimination of ethyl carbamate in Chinese rice wine[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2019, 35(4): 567-576. DOI:10.13345/j.cjb.180386 (
0)[7] KOBASHI K, TAKEBE S, SAKAI T. Urethane-hydrolyzing enzyme from Citrobacter sp.[J]. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 1990, 38(5): 1326-1328. DOI:10.1248/cpb.38.1326 (
0)[8] AKUTSU-SHIGENO Y, ADACHI Y, YAMADA C, et al. Isolation of a bacterium that degrades urethane compounds and characterization of its urethane hydrolase[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 70(4): 422-429. DOI:10.1007/s00253-005-0071-1 (
0)[9] 李京京, 方芳, 张继冉, 等. 氨基甲酸乙酯水解酶的分离纯化及酶学性质[J]. 食品与生物技术学报, 2014, 33(12): 1239-1245.
LI Jingjing, FANG Fang, ZHANG Jiran, et al. Purification and characterization of an urethanase[J]. Journal of Food Science and Biotechnology, 2014, 33(12): 1239-1245. DOI:10.13345/j.cjb.130277 (
0)[10] ZHOU N D, GU X L, TIAN Y P. Isolation and characterization of urethanase from Penicillium variabile and its application to reduce ethyl carbamate contamination in Chinese rice wine[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2013, 170(3): 718-728. DOI:10.1007/s12010-013-0178-2 (
0)[11] 刘晓慧, 方芳, 夏小乐, 等. 定点突变改造提高纺锤形赖氨酸芽孢杆菌氨基甲酸乙酯水解酶稳定性[J]. 生物工程学报, 2016, 32(9): 1233-1242.
LIU Xiaohui, FANG Fang, XIA Xiaole, et al. Site-directed mutagenesis to improve the stability of urethane hydrolase in Spindle-shaped Bacillus lysine[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2016, 32(9): 1233-1242. DOI:10.13345/j.cjb.150527 (
0)[12] MASAKI K, MIZUKURE T, KAKIZONO D, et al. New urethanase from the yeast Candida parapsilosis[J]. Journal of Bioence and Bioengineering, 2020, 130(2): 115-120. DOI:10.1016/j.jbiosc.2020.03.005 (
0)[13] ANGAMUTHU K, PIRAMANAYAGAM S. Evaluation of in silico protein secondary structure prediction methods by employing statistical techniques[J]. Biomedical and Biotechnology Research Journal, 2017, 1(1): 29-36. DOI:10.4103/bbrj.bbrj_28_17 (
0)[14] SCHULTZ J, MILPETZ F, BORK P, et al. SMART, a simple modular architecture research tool: identification of signaling domains[J]. Canadian Metallurgical Quarterly, 1998, 95(11): 5857-5864. DOI:10.1186/gb-2000-1-1-reports234 (
0)[15] ARNOLD K, BORDOLI L, KOPP J, et al. The SWISS-MODEL workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling[J]. Bioinformatics, 2006, 22(2): 195-201. DOI:10.1093/bioinformatics/bti770 (
0)[16] LASKOWSKI R A, RULLMANN J A, MACARTHUR M W, et al. AQUA and PROCHECK-NMR: Programs for checking the quality of protein structures solved by NMR[J]. Journal of Biomolecular NMR, 1996, 8(4): 477-486. DOI:10.1007/BF00228148 (
0)[17] MADEIRA F, PARK Y M, LEE J, et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019[J]. Nucleic Acids Research, 2019, 47(1): 636-641. DOI:10.1093/nar/gkz268 (
0)[18] 杨莉莉, 李辉, 张慧. 鸡RB1基因的结构与功能分析[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2017(5): 16-19.
YANG Lili, LI Hui, ZHANG Hui. Analysis of the structure and function of the RB1 gene in chicken[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine, 2017(5): 16-19. DOI:10.13881/j.cnki.hljxmsy.2017.0758 (
0)[19] 孟翔燕, 孟军, 葛家麒. 蛋白质二级结构预测方法的评价[J]. 生物信息学, 2010, 8(3): 206-209.
MENG Xiangyan, MENG Jun, GE Jiaqi. A method for assessing methods for protein secondary structure prediction[J]. China Journal of Bioinformatics, 2010, 8(3): 206-209. DOI:10.3969/j.issn.1672-5565.2010.03.006 (
0)[20] 李晓曼, 乳清蛋白的肽谱和蛋白质组研究[D]. 哈尔滨市: 哈尔滨工业大学, 2018. DOI: CNKI:CDMD:2.1018.893243.
LI Xiaoman, The peptide profile and proteomics of whey protein[D]. Harbin: Harbin Institute of Technology, 2018. DOI: CNKI:CDMD:2.1018.893243. (
0)[21] BENKERT P, BIASINI M, SCHWEDE T, et al. Toward the estimation of the absolute quality of individual protein structure models[J]. Bioinformatics, 2011, 27(3): 343-350. DOI:10.1093/bioinformatics/btq662 (
0)[22] 王东东, 幽门螺杆菌GyrB的同源建模和分子对接研究[D]. 沈阳: 沈阳化工大学, 2018. DOI: CNKI:CDMD:2.1019.803584.
WANG Dongdong. Homologous modeling and molecular docking of helicobacter pylori gyrB protein[D]. Shenyang: Shenyang University of Chemical Technology, 2018. DOI: CNKI:CDMD:2.1019.803584. (
0)[23] 谢勇, 洪晓昆, 鄢仁祥, 等. 重组琼胶酶rAgaN3基因的生物信息学分析[J]. 生物信息学, 2017, 15(1): 16-26.
XIE Yong, HONG Xiaokun, YAN Renxiang, et al. Bioinformatics analysis of the recombinant rAgaN3 gene of agarase[J]. Chinese Journal of Bioinformatics, 2017, 15(1): 16-26. DOI:10.3969/j.issn.1672-5565.2017.01.201608003 (
0)[24] 张一菡, 李卿, 张磊, 等. 西红花MADS-box基因家族的生物信息学分析[J]. 基因组学与应用生物学, 2019, 38(7): 3140-3154.
ZHANG Yhan, LI Qing, ZHANG Lei, et al. Bioinformatics Analysis of MADS-box Gene Family in Crocus sativus[J]. Genomics and Applied Biology, 2019, 38(7): 3140-3154. DOI:10.13417/j.gab.038.003140 (
0)