考研论坛 dengshq_12282005-01-13
Chap.7 微生物的生长与控制
概念：
●个体生长： 细胞原生质总量的增加。
● 繁殖：微生物生长而产生新的子代。
● 生长(群体生长):微生物群体数量和重量的增加。
§.1 测定生长繁殖的方法
一、研究M生长繁殖的意义：
1、生长繁殖是M和外界环境因素相互作用的综合反映，生长繁殖情况可作为 M生理、生化和遗传研究的重要指标。
2、生产实践：M的应用（菌体~酵母/产物合成）、 致病菌/霉腐
二、测定生长繁殖的方法
测定方法主要有两类--测生长量和计繁殖数
（一）测生长量：适用一切M
1．测体积2．称干重3．间接法：比浊法、生理指标法（测含N,/C,/P/DNA等）
二）计繁殖数：（适用：单细胞M/丝状M的孢子）
1、直接法：血球计数板法2、间接法：（活菌计数法）
●平板菌落计数法（计算cfu）●最大可能数量法 （MPN法）
§2、微生物的生长规律
一、细菌的同步生长与同步培养
1、同步生长：群体中所有的个体细胞处于同样的细胞生长和分裂周期的状态。
2、同步培养：细胞群体中每个个体都处于同步生 长状态的培养 方法。4、同步培养方法
①诱导法：变换温度、光脉冲、营养供应
②选择法：Helmstetter-cummings的膜洗脱技术
③同步培养方法的选择视M种类和研究目的：
a.生理学研究中，选择法优于诱导法。
b.诱导法，常用来研究DNA复制和细胞分裂机制等。
二、典型生长曲线（growth curve）
定义：描述单细胞M群体规律性生长的曲线。
1．延滞期（Lag phase）
特点：生长速率为0，细胞数目不增加，但个体产生变化。
缩短缩短延滞期的措施：
①取对数期接种龄的种子接种。
②加大接种量，缩短延滞期（10%接种量）
③接种到营养丰富的天然培养基（种子/发酵培养基成分尽量相近）。
2．指数期/对数期
特点： ●对数期M的应用：
①作为代谢、生理研究的良好材料。②增殖噬菌体的最适宿主菌龄。
③发酵生产中作为种子的最佳种龄。算术值与对数值不同方法表示的对数期的生长曲线
3．稳定期（最高生长期）
特点： ①生长速率常数R=0，菌体产量达最高；
②菌体生长产量常数Y= （x―菌体干重，c―限 制性营养物浓度）；
③处于稳定期细胞内出现贮存物（糖原、异染颗粒、脂肪）、芽孢或开始合成抗生素等次级代谢产物。
细胞在指数期后，如得不到特殊条件，必然进入稳定期。
原因：
①营养物质耗尽 ②营养物比例失调（C/N不合适）
③有害代谢物积累④pH氧化还原势等物化条件不适宜。
发酵工业中，延 长产物合成时间，避免菌体过早衰老，常采用中间补 料工艺（C、N、无机盐等）。
4．衰亡期
特点：生长速率常数为负数（R为负值），个体死亡速度＞新生的速度。
三、微生物的连续培养
1.定义： 微生物菌体数目和生长速率维持恒定的培 养过程。
2.提出连续培养的根据：
在研究典型生长曲线的基础上，认识稳定期到来的原因，采取相应有效措施而实现。
恒浊器 恒化器
工作原理：培养液浊度与菌浓度成正比 限制性营养物与菌生长速度正比。
控制方法：改变流量，使培养液浊度恒定 恒定流量，使限制性营养物浓度恒定。
流入培养基成分：各种营养成分都很充分 限制性营养物浓度低，其他成分充分。
容器内菌的生长速率：最大生长速率 低于最大生长速率
5．连续发酵优点及时限
优点：自控、高效、产品质量稳定，节约人力、动力、汽、水等成本。
时限：数月~1,2年。原因：菌种退化、染菌。
§3.影响微生物生长的主要因素
一、 温度
生长温度——最低生长温度（一般-5～-10℃，极端-30℃）
三基点：——最适生长温度 嗜冷菌：-10～20℃中温菌：20～45℃嗜热菌：45～95℃
——最高生长温度（一般80～95℃，极端105～300℃）
●从M整体看，微生物生长温度范围：-30～300℃，很广；但从某一具体M来说，则不尽相同，有宽温M和窄温M之分。
●最适生长温度：微生物生长速率最高时的培养温度。 ●不同生理过程存在不同的最适温度
例：谷a.a发酵：北京棒状杆菌（菌体生长32℃，谷a.a合成33～35℃：33～35℃,谷a.a脱氢酶活力最高）
二、氧气
1、专性好氧菌：绝大多数真菌，许多细菌。
●特点：必须在O2条件下生长，以O2作最终H受 体，完 整呼吸链。 含超氧化物岐化酶（SOD superoxidedismutase）和过氧化氢酶。
2、兼性厌氧菌：许多酵母菌、细菌。●特点：有O2/无O2均能生长，胞内有SOD、过氧化氢酶。
3．微好氧菌●特点：只能在较低的氧分压下正常生长的微生物。
4．耐氧菌●特点：可在O2存在下营厌氧生活的厌氧菌，胞内存在SOD，过氧化物酶，缺过氧化氢 酶。
5．厌氧菌●特点： 分子氧对它们有毒害，只有在深层的固体/半固体培养基中生长；生命活动所需 能量靠发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵提供；胞内缺乏SOD、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶。
五种微生物类群主要产能途径和解毒酶系
类群 主要产能途径 SOD 过氧化氢酶
专性好氧菌 氧化磷酸化 + +
兼性好氧菌 氧化磷酸化 /底物 + +
磷酸化
微好氧菌 氧化磷酸化 +（弱） +（弱）
耐氧菌 底物磷酸化 + （有过氧化物酶）
专性厌氧菌 底物（光合）磷酸化 - -
●氧对厌氧菌毒害作用的机制--SOD学说。
厌氧菌缺乏SOD，受超氧阴离子自由基（ ）毒害，对各种重要的生物高分子和膜破坏作用；形成其它活性氧化物
三、pH
●总体情况，M绝大多数种类都生长在pH 5～9之间；多数真菌和酵母菌偏酸生长；细菌和放线菌偏碱。
●同一种M，菌体生长阶段和产物合成阶段，往往要求不 同的最适pH，例
因此，发酵生产上对pH的控制很重要。
●微生物培养过程，引起pH值改变的原因：
1、培养基中性成分被M利用的结果，一般培养基培养时间延长，变酸。
2、与培养基C/N比值有关，C/N高（真菌培养基），培养后pH↓； C/N低（细菌）pH↑
●生产实践中保证M生长处在较稳定和合适pH，方法：
pH调节措施 治标（酸碱中和）
治本——过酸：适当N源（尿素、NaNO3、NH4OH等）通气量↑
——过碱：糖、乳酸、油脂等C源；通气量↓
§4.微生物培养法
一、实验室常规的微生物培养
1.固体培养
1.1好氧微生物：●斜面●培养皿●茄子瓶●浅盘
1.2厌氧微生物：●高层琼脂柱●亨盖特氏滚环技术
●厌氧罐（袋）●厌氧手套箱
厌氧罐（袋）工作原理
●除氧
柠檬酸+NaCO3——H2O+CO2 KBH4+H2O——H2
H2+O2——H2O（钯粒催化剂）
●除水●密闭系统（美兰指示剂）
2.液体培养
2.1好氧微生物
●摇瓶●小型发酵罐
2.1厌氧微生物
● 液体培养
一、工业生产的微生物培养
1.固体培养●曲法培养●堆积培养
2.液体培养●浅盘●深层液体通气培养（发酵罐）
§5.有害微生物的控制
一、概念
●灭菌：采用强烈的理化因素，使处理物体内外一切微生物永远丧失繁殖能力的措施。
● 消毒：采用较温和理化因素，杀死有害病原菌。
●防腐：利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖。
●化疗：利用高度选择毒力的化学物质抑制宿主体内病原微生物生长繁殖的治疗措施。
二、高温灭菌种类及操作
1.干热灭菌法：金属制品：150～170℃，2hr，烘箱；接种环火焰灼烧。
2．湿热灭菌法：
●常压法--巴氏消毒法、煮沸消毒法、间歇灭菌法。
●加压法--常规加压灭菌法，连续加压灭菌法（连消法）
三、影响加压蒸汽灭菌效果的因素
● 物体的含菌量● 灭菌锅内空气排除程度
● 灭菌对象pH：● 灭菌对象体积
● 加热与散热速度（上磅/下磅）
四、高温对培养基成份的有害影响及其防止
1.有害影响
●形成沉淀物;（有机物：多肽类，无机物：碳酸盐、磷酸盐沉淀）
●破坏营养，提高色泽；（氨基糖、焦糖、黑色素-褐变）
●改变培养基pH；（pH↓一般状况）
●降低培养基浓度。（冷凝水）
2.防止措施：
●采用特殊加热灭菌法：
●过滤除菌法：膜过滤、石棉板过滤、硅藻土过滤
●其他方法：按配方逐一加入（顺序很重要），此外，螯合剂防止金属离子沉淀。
五、化学杀菌剂或抑菌剂
1．表面消毒剂：石碳酸（3～5%）、酒精（75%）、新洁尔灭（0.05～0.1%）
2．磺胺类药物：磺胺类药物具有高度选择毒力性能·机理：
病原菌：二氢喋啶酰焦磷酸+PABA（二氢叶酸合成酶；二氢叶酸、合成酶；二氢叶酸、还原酶）——四氢叶酸（COF,转移-碳基的重要辅酶）
● 磺胺与病原菌生长因子（PABA）结构类似，可竞争与另一底物
二氢喋啶酰焦磷酸）结合→假二氢叶酸·病原菌无法合成叶酸，无 法正常生长。
● 磺胺增效剂―三甲基苄二氨嘧啶（TMP）抑制二氢叶酸还原酶活性，与磺胺配合对四氢叶酸合成起双重阻断·双保险。
● 人类缺四氢叶酸合成有关酶类，必须在营养物中直接提供。因此，磺胺对人 类无毒。
3．抗生素
●定义：
一类由M及其它生物在生命活动中合成的次级代谢产物或人工合成衍生物，它们在很低的浓底时就能抑制或干扰它种生物的生命活动，因而可用作优良的化学治疗剂。
●抗生素的效价及计量单位
