1 天津科技大学，天津 300457;
2 中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308
收稿日期：2018-04-03;接收日期：2018-06-01 基金项目：国家自然科学基金(No. 31701534)，中国科学院重点部署项目(Nos. KFJ-STS-ZDTP-016，KFZD-SW-211)，天津市科技计划项目(Nos.16YFZCSY00790，16YFXTSY00530，15YFYssy00040)资助
摘要：转运核糖核酸(tRNA)是蛋白质合成过程中重要参与成分之一，为了探索稀有密码子对应的tRNA (稀少tRNA)丰度改变对外源基因表达量的影响，文中构建了毕赤酵母稀少tRNA基因与外源基因共表达体系。首先在GFP基因中添加由4个连续脯氨酸稀有密码子CCG组成的阻遏区，结果显示该GFP基因的表达量明显降低。然后将带有阻遏区的GFP基因和tRNACCGPro基因顺次连接于pPIC9K载体上，在毕赤酵母GS115中共表达，结果使GFP表达量提高了4.9%；另将带有阻遏区的GFP基因和tRNACCGPro基因分别连接于pPIC9K和pFLDα载体，在毕赤酵母GS115中共表达，GFP表达量最高提高了12.5%；应用同样方式将tRNACCGPro基因与NFATc3T-GFP融合基因共表达，其表达量提高了21.3%。可见，tRNACCGPro在毕赤酵母GS115中确为稀少tRNA，通过共表达tRNACCGPro基因可显著提高带有连续该密码子的外源基因表达量，并且，文中构建的共表达体系将同样适用于其他稀少tRNA基因的筛选和验证。
关键词：毕赤酵母稀少tRNA丰度tRNACCGPro基因共表达
Expression of Pichia pastoris tRNACCGPro and its function
Meng Peng1,2*, Ming Tan2*, Yan Zeng2, Hongchen Zheng2, Hui Song2
1 Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China;
2 Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China
Received: April 3, 2018; Accepted: June 1, 2018
Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31701534), Key Deployment Project in Chinese Academy of Sciences (Nos. KFJ-STS-ZDTP-016, KFZD-SW-211), Tianjin Science & Technology Planning Project (Nos. 16YFZCSY00790, 16YFXTSY00530, 15YFYssy00040)
Corresponding author:Hui Song. Tel/Fax: +86-22-84861934; E-mail: song_h@tib.cas.cn
*These authors contributed equally to this study
Abstract: Translocation ribonucleic acid (tRNA) is one of the important components in protein synthesis. In order to explore the effect of the changes of tRNAs corresponding to rare codons (rarity tRNAs) on the expression of exogenous genes, the co-expression system of rare tRNA gene and exogenous gene in Pichia pastoris was constructed. The expression of GFP in P. pastoris can be greatly reduced when a repressor region composed of four continuous proline rare codon CCG was added into the GFP gene. The expression amount of the repressed GFP could be increased about 4.9% when tRNACCGPro gene was cointegrated to the 3' of the repressed GFP gene through pPIC9K to the genome of P. pastoris GS115. Meanwhile, the expression amount of the repressed GFP increased about 12.5% by integrating the repressed GFP gene and tRNACCGPro gene to the genome of P. pastoris GS115 through pPIC9K and pFLDα, respectively. Using the same method, NFATc3T-GFP fusion gene and tRNACCGPro gene were co-expressed in P. pastoris GS115 resulting in 21.3% increased of the expression amount of NFATc3T-GFP fusion protein. In conclusion, tRNACCGPro gene has been confirmed to be a kind of rare tRNAs in P. pastoris GS115. Through co-expression of tRNACCGPro gene and heterologous genes which containing the continuous rare codon CCG, the expression of the repressed heterologous genes could be increased significantly. Furthermore, this co-expression system would contribute to screening and determining the other rare tRNAs.
Keywords: Pichia pastorisrare tRNA abundancetRNACCGPro geneco-expression
转运核糖核酸(tRNA)是在生物体内广泛存在的一类非编码RNA分子[1]。在基因表达过程中，tRNA是遗传信息传递过程中的重要参与者，是连接核苷酸序列和氨基酸序列的重要纽带[2]。细胞内每种tRNA的数量存在显著差异，由于密码子简并性的存在，生物体内的高表达基因均采用了数量相对丰富的tRNA所对应的密码子以保证表达过程的高效顺利完成，这些密码子称为偏好密码子；与此对应的，数量相对稀少的tRNA对应的密码子生物体一般较少采用，称为稀有密码子[3]。这种生物对于使用部分密码子的倾向性现象被称为密码子偏好性，不同生物的密码子的偏好性存在着显著差异[4]。将一种生物来源的基因转入另外的宿主中进行外源表达时，经常面临基因来源生物与宿主生物密码子偏好性不同的问题，这将导致外源基因在核糖体上的翻译过程因为宿主体内对应tRNA短缺而出现停滞现象，造成基因低表达或不表达。一般通过将外源基因按照宿主密码子偏好性进行改造的方式解决[5-6]。另外一种方式是通过提高宿主体内稀少tRNA的丰度，从而提高外源基因表达几率和表达量[7-8]。
例如，精氨酸密码子AGA/AGG是真核生物中常见的密码子，但在大肠杆菌中特别罕见[9-11]。Dieci等[12]通过使用携带大肠杆菌argU基因(argU基因编码的稀少tRNA识别AGA/AGG密码子)的质粒来克服这种限制。用含有大肠杆菌argU基因的质粒转化已含有外源核糖体蛋白基因的大肠杆菌，使5种真核生物来源的细胞质核糖体蛋白表达量提高至总细菌蛋白质的50%。Kleber等[13]在细菌中表达不同的花生过敏原时发现，Arah 1、2、6的成熟基因中含有8%–10%稀有密码子AGA/AGG，其表达量比含0.8%同样稀有密码子AGA/AGG的Arah 5要低很多。在不改变基因密码子含量的情况下，通过在大肠杆菌细胞中增加稀少tRNA argU、ileY和lueW基因的拷贝数，使Arah 1、2、6表达量提高了100多倍。Robert等[14]通过补充大肠杆菌缺乏的6种稀少tRNA，构建了商业化的Rosseta大肠杆菌表达系统。实验结果验证Rosseta表达系统能够缓解由密码子偏好性导致的蛋白表达量低的问题，可以提高外源基因尤其是真核基因在原核系统中的表达水平[15-17]。Constanze等[18]在巨大芽孢杆菌中通过共表达稀少tRNA基因，外源细胞外水解酶(TFH)蛋白质产量增加了18倍。但在目前应用较广泛的毕赤酵母真核表达系统中还未有相关研究报道。
为了实现在毕赤酵母中提高稀少tRNA丰度提高外源基因表达量的目的，需要获得准确的毕赤酵母稀少tRNA基因。目前，tRNA基因主要依靠软件预测技术进行发掘，其中应用最为广泛的是tRNAScan-SE软件[19]。其预测结果被大多数基因组作为测序分析tRNA基因的注释依据而采用。但由于真核生物tRNA基因的转录后修饰较为复杂，依靠识别基因组中tRNA基因的第34–37位碱基作为反密码子的预测方式偏差较大[20]，因此需要对预测出的毕赤酵母tRNA基因结果进行实验验证。
Constanze等在巨大芽孢杆菌构建了一种以GFP为报告基因的tRNA基因验证方法，该验证方法在GFP基因序列5'端15个碱基后加入多个连续稀有密码子，在GFP基因序列之后加入待验证的稀有密码子对应tRNA的基因，构建表达载体后转入巨大芽孢杆菌共表达。若与未转入tRNA基因的带有连续稀有密码子的GFP对照组相比GFP的表达量有提高，则表明待验证的tRNA基因转录出的成熟tRNA可识别相应稀有密码子，能够克服由于连续稀有密码子对其表达造成的阻遏效果[18]。
NFATc3T是活化T细胞核因子NFAT家族成员，是一组在哺乳动物组织细胞中广泛表达的转录因子，在免疫反应中对诱导基因转录起重要作用[21]。NFAF在多种免疫细胞中均有表达，如T细胞、B细胞、NK细胞、肥大细胞、单核细胞和嗜酸粒细胞等，在细胞分化、生长过程中起重要作用，已成为肿瘤研究中的热点，并有可能成为新的肿瘤治疗靶点[22]。NFAT保守型较高，在氨基端约100个残基区域为一个很强的转录活化区(Trans-activation domain，TAD)，在该区域基因内有多个连续脯氨酸稀有密码子CCG，进行毕赤酵母外源表达时会造成极大概率的翻译提前终止[23]。
本研究在毕赤酵母中优化了以GFP为报告基因的稀少tRNA基因验证方法，比较了将带有连续稀有密码子阻遏区的GFP基因和待验证tRNA基因使用同一载体共表达和使用不同载体共表达两种方式，并对毕赤酵母tRNACCGPro基因进行了验证。完成了人类活化T细胞核因子TAD区域NFATc3T和GFP融合基因与tRNACCGPro基因在毕赤酵母GS115中的共表达。验证了在毕赤酵母中表达tRNACCGPro基因对连续稀有密码子CCG导致翻译提前终止现象的去阻遏作用。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株与质粒毕赤酵母GS115 (P. pastoris GS115)，大肠杆菌DH5α (Escherichia coli DH5α)及穿梭质粒pPIC9K、pFLDα均为中国科学院天津工业生物技术研究所工业酶工程研究组实验室保存。
1.1.2 主要试剂与耗材D-葡萄糖、YNB、氨苄青霉素(Amp)、博来霉素(Zeosin)购自Solarbio (美国)。生物素(D-Biotin)购自BIO BASIC INC公司(加拿大)；甲醇购自国药集团化学有限公司。
限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自NEB (美国)；高保真DNA聚合酶购自康为世纪生物科技有限公司(中国)。
质粒小提试剂盒、酵母基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司(中国)。
PCR所需引物均由北京华大基因公司合成。
1.2 方法1.2.1 表达载体的构建为了在毕赤酵母GS115中建立tRNA表达体系，选择绿色荧光蛋白GFP基因作为报告基因。GFP基因由安徽通用生物公司进行全序列合成，并克隆到穿梭质粒pPIC9K多克隆位点EcoRⅠ和NotⅠ之间，构建重组质粒pPIC9K-GFP (简写pGFP)。同时在GFP基因序列5'端的15个碱基对下游插入4个连续的毕赤酵母脯氨酸稀有密码子CCG作为基因表达的阻遏区，构建基因GFP4CCG (图 1)。
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| 图 1 PCR扩增得到的基因序列 Fig. 1 The gene sequence amplified by PCR. The gray broken arrow represents the open reading frame of GFP. Four identical consecutive rare codons CCG are integrated into the coding region of GFP. The blue arrow indicates the tRNA gene. |
| 图选项 |
人类活化T细胞核因子TAD区域NFATc3T基因(Gene ID: 100458008)及绿色荧光蛋白GFP基因的融合基因NFATc3T-GFP由安徽通用生物公司进行全序列合成，并克隆到穿梭质粒pPIC9K多克隆位点的EcoRⅠ和NotⅠ之间，构建重组质粒pPIC9K-NFATc3T-GFP。
利用tRNAScan-SE 2.0软件检索GS115基因组序列后获得待验证的tRNACCGPro基因序列以及作为对照组的tRNAGCAAla基因序列。设计PCR引物(表 1)后，以酵母基因组DNA提取试剂盒提取的毕赤酵母GS115基因组为模板PCR扩增获得tRNACCGPro基因和tRNAGCAAla基因(图 1)。
表 1 实验所用引物Table 1 PCR primers used in the experiment
| Amplified by PCR | Primer sequence (5'–3') |
| GFP4CCGF | TACGTAGAATTCATGTCGAAAGGGGAACCG |
| GFP4CCGR | AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTATTTGTACAA |
| GFP4CCG-tRNACCGProF | CCGGAATTCATGTCGAAAGGGGAACCGCCGCGCCGGAATTATTCACT |
| GFP4CCG-tRNACCGProR | AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTCGAATCTGATTCTTAGAAAAAATTGAACTCGGG |
| tRNACCGProF | CGCGGATGCACAAAACAATAGAATCAAGA |
| tRNACCGProR | CGCGGATCCTAGGAGGGCATTAGC |
| tRNAGCAAlaF | CGCGGATGCATAAAAGCATTGAGCACG |
| tRNAGCAAlaR | CGCGGATGCATCTATTGGAAAAGTGACGAT |
| Underlines indicate the cleavage site of restriction endonuclease. | |
表选项
在Constanze等的同一载体共表达方法中，带稀有密码子阻遏区的GFP基因与待验证tRNA基因距离太近，tRNA基因回文序列可能对GFP基因的转录和表达造成影响[24]。为了验证这一影响，分别构建了利用同一载体表达GFP4CCG基因和tRNACCGPro基因的载体pPIC9K-GFP4CCG-tRNACCGPro (简写为pGFP4CCG-tRNACCGPro)，以及利用不同载体表达GFP4CCG基因和tRNACCGPro基因的载体pPIC9K-GFP4CCG (简写pGFP4CCG)和pFLDα-tRNACCGPro (简写ptRNACCGPro)。
为了给待验证的tRNACCGPro基因提供对照，构建了包含不能识别密码子CCG的tRNAGCAAla的基因的载体pFLDα-tRNAAla GCA (简写ptRNAGCAAla)。
1.2.2 电击转化及转化子鉴定重组质粒pPIC9K-GFP、pPIC9K-GFP4CCG、pPIC9K-GFP4CCG-tRNACCGPro以限制性内切酶SalⅠ作为线性化位点酶切后进行浓缩，通过电击转化将质粒转入毕赤酵母GS115中，通过在MD筛选培养基上培养分别获得GS115/pGFP、GS115/pGFP4CCG和GS115/pGFP4CCG-tRNACCGPro转化子。
重组质粒经pFLDα-tRNACCGPro、pFLDα-tRNAAla GCA以限制性内切酶NsiⅠ作为线性化位点酶切后进行浓缩，电击转化将质粒转入毕赤酵母GS115/pGFP4CCG中。通过YPD (Zeosin，100 μg/mL)筛选培养基上培养获得GS115/pGFP4CCG/ptRNACCGPro、GS115/pGFP4CCG/ptRNAGCAAla转化子。
电击转化：取80 μL毕赤酵母GS115感受态细胞与10 μL (约2 μg)线性化DNA混合，转入预冷的0.2 cm电击杯中，在冰上放置5 min，电压1 500 V进行电击，立即加入1 mL预冷的1 mol/L山梨醇至电转杯中，将内容物涂于筛选平板，在30 ℃培养箱培养至单克隆产生。
转化子鉴定：挑取筛选平板上的单菌落接种于3 mL YPD液体培养基中，29 ℃、220 r/min培养24 h，取出1 mL用于保菌后，剩余菌液采用酵母基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。并以酵母基因组DNA为模板，以通用引物AOX和FLDα引物(pFLDα骨架引物，于tRNA基因上下游各150 bp处设计引物) (表 2)对转化子进行PCR验证。PCR扩增体系：5×Cobuddy HF缓冲液10 μL，dNTPs 1 μL，上下游引物各1.5 μL，模板1 μL，Cobuddy 0.5 μL，补ddH2O至50 μL。PCR反应条件：98 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃终止。1%琼脂糖凝胶电泳120 V、30 min，凝胶成像系统检测。
表 2 AOX与FLDα引物Table 2 Primers: AOX and FLDα
| Primer name | Primer sequence (5'–3') |
| 5'AOX F | GACTGGTTCCAATTGACAAGC |
| 3'AOX R | GCAAATGGCATTCTGACATCC |
| FLDα F | CTCGTACGAGCTTGCTCCTGA |
| FLDα R | CCGTCAGGGCGCGTCAGC |
表选项
1.2.3 菌株培养及GFP基因甲醇诱导表达大肠杆菌培养：将验证正确的转化子接种于LB培养基中(Amp，100 μg/mL)，37 ℃、220 r/min摇床中过夜培养，用于质粒提取。
毕赤酵母培养及诱导：将重组毕赤酵母菌株划线于YPD平板，30 ℃培养箱培养2–3 d至单菌落长出，挑取单菌落于10 mL BMGY液体培养基(100 mL三角瓶)，于29 ℃、220 r/min培养40 h，转接于20 mL BMMY液体培养基(250 mL避光挡板三角瓶)测每个菌液OD600光吸收值，并将每个菌液调到同一个OD600水平。29 ℃、220 r/min，每隔24 h添加甲醇至终浓度为2%诱导培养，同时测OD600光吸收值作菌液生长曲线。
1.2.4 GFP4CCG基因与tRNA基因共表达的荧光检测每隔24 h取2 mL诱导表达菌液于包有铝箔的避光EP管中，12 000 r/min离心10 min，无菌注射器小心吸取菌液上清，用已灭菌的0.22 μm的滤器进行过滤除菌及杂质。并将过滤后的上清转至新的包有铝箔的避光EP管，分别取200 μL样品于96孔荧光酶标板，以BMMY培养基(已过滤除菌)为空白对照，采用连续多功能酶标仪Flex Station 3进行荧光值的检测，检测激发光为485 nm，发射光为523 nm。
荧光显微镜下观察毕赤酵母细胞内荧光，取诱导表达相同时间的重组毕赤酵母菌液，12 000 r/min离心10 min，收集菌体，ddH2O悬浮菌体，洗涤，离心收集菌体，重复洗涤3遍，重悬菌体于1 mL ddH2O，荧光显微镜下观察细胞内荧光。
1.2.5 SDS-PAGE验证三氯乙酸沉淀：取发酵上清液1 mL，加入100%三氯乙酸(TCA)溶液150 μL (终浓度13%)，充分混匀，–20 ℃沉淀10 min，4 ℃沉淀12–24 h，12 000 r/min离心10 min，弃上清，加入1 mL丙酮吹悬洗涤沉淀，12 000 r/min离心10 min，弃上清，重复洗涤3次，室温干燥至丙酮完全挥发，所得沉淀即为蛋白样品。
SDS-PAGE验证：将所得到的蛋白样品用20 μL 6 mol/L的尿素溶解，并加入7 μL 4×蛋白上样缓冲液混匀，100 ℃煮沸10 min；待样品冷却后，短暂离心，取12 μL蛋白样品上样并开始电泳。电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色液染色2 h，然后换脱色液，脱色至条带清晰可见，期间更换1–2次脱色液。
2 结果与分析2.1 重组毕赤酵母菌株的构建GFP4CCG基因和GFP4CCG-tRNACCGPro基因分别克隆到穿梭质粒pPIC9K多克隆位点EcoRⅠ和NotⅠ之间，得到的重组质粒pPIC9K-GFP4CCG、pPIC9K-GFP4CCG-tRNACCGPro分别转入毕赤酵母GS115菌株，应用AOX引物(表 2)进行PCR筛选转化子，阳性转化子在琼脂糖凝胶电泳中可见两条带，一条为含有目的基因加492 bp AOX部分基因序列的基因片段，其中GFP4CCG和GFP4CCG-tRNACCGPro的基因验证条带大小应分别为1 221 bp (729 bp+492 bp)和1 374 bp (882 bp+492 bp)，另一条为AOX1基因片段，大小约为2 200 bp (图 2A，2B)。将验证正确的重组菌株送样测序，从而成功得到重组菌株GS115/pGFP4CCG和GS115/pGFP4CCG-tRNACCGPro。
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| 图 2 重组毕赤酵母的PCR验证 Fig. 2 PCR identification of the positive recombinant P. pastoris strains. M: nucleic acid molecular weight marker; +: positive control; –: negative control. (A) 1, 2: recombinant strain GS115/pGFP4CCG. (B) 1, 2: recombinant strain GS115/pGFP4CCG- tRNACCGPro. (C) 1, 2: recombinant strain GS115/pGFP4CCG/ptRNACCGPro; 3: recombinant strain GS115/pGFP4CCG/ptRNAGCAAla. |
| 图选项 |
同样，将tRNACCGPro基因和tRNAGCAAla基因克隆到穿梭质粒pFLDα多克隆位点BamHⅠ处，得到的重组质粒pFLDα-tRNACCGPro、pFLDα-tRNAAla GCA分别转入到重组菌株GS115/pGFP4CCG中，经FLDα引物(表 2) PCR筛选转化子，tRNACCGPro基因和tRNAGCAAla基因大小分别为147 bp和150 bp，加上pFLDα骨架上的300 bp，目的条带分别为447 bp和450 bp (图 2C)。将验证正确的重组菌株送样测序，最终成功构建了重组菌株GS115/pGFP4CCG/ptRNACCGPro和GS115/ pGFP4CCG/ptRNAGCAAla。
2.2 重组毕赤酵母表达水平检测2.2.1 重组毕赤酵母的生长曲线在BMGY培养基中培养的菌体转接至BMMY培养基中进行甲醇诱导培养，诱导培养前将各个菌液的OD600调整为同一水平(7.35左右)。在诱导过程中，各个重组表达菌株生长状态情况(图 3)基本一致，添加tRNA基因与目的基因共表达没有对菌株的生长产生负面影响。
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| 图 3 重组毕赤酵母生长曲线 Fig. 3 The growth curve of recombinant P. pastoris. |
| 图选项 |
2.2.2 带有连续稀有密码子阻遏的GFP表达通过荧光显微镜(图 4)和SDS-PAGE (图 5)比较诱导培养72 h左右菌株GS115/pGFP和GS115/pGFP4CCG受激发光源激发后荧光值和GFP表达水平(GFP理论分子量约为27 kDa)，结果显示，加入连续稀有密码子后，GFP的表达受到了明显阻遏。
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| 图 4 GS115/pGFP转化子和GS115/pGFP4CCG转化子荧光对比 Fig. 4 Fluorescence comparison between GS115/pGFP and GS115/pGFP4CCG. |
| 图选项 |
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| 图 5 SDS-PAGE比较GFP基因添加连续稀有密码子前后表达水平 Fig. 5 Comparing the expression levels of GFP gene before and after adding continuous rare codons by SDS-PAGE. M: protein molecular weight marker; 1: GS115/Pgfp; 2: GS115/pGFP4CCG. |
| 图选项 |
2.2.3 tRNACCGPro基因效果验证各重组毕赤酵母的表达水平通过报告基因GFP的荧光值来体现。采用连续多功能酶标仪在485 nm激发光源照射下，检测523 nm发射光数据作为荧光值。诱导表达过程中各重组毕赤酵母的荧光值变化趋势高度一致。
其中同载体共表达菌株GS115/pGFP4CCG-tRNACCGPro与对照菌株GS115/pGFP4CCG相比，GFP表达量平均提高4.9%，不同载体共表达菌株GS115/ pGFP4CCG/ptRNACCGPro与对照菌株GS115/pGFP4CCG相比GFP表达量平均提高12.5%。而共表达GFP4CCG和tRNAGCAAla的菌株荧光值与对照菌株GS115/pGFP4CCG相比有所降低(图 6)。
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| 图 6 重组毕赤酵母表达GFP荧光值对比 Fig. 6 Comparison of fluorescence values of GFP expressed in recombinant P. pastoris. *P≤0.05, **P≤0.01 and ***P≤0.001(Student's t-test). Error bars indicate standard deviations from three parallel experiments. |
| 图选项 |
取诱导表达168 h的各菌液上清，通过SDS-PAGE检测各重组毕赤酵母菌株中目的蛋白最终表达水平(图 7)。GFP理论分子量约为27 kDa，从图中可以看出4个重组毕赤酵母菌株都成功表达了GFP，其中GS115/pGFP4CCG/ptRNACCGPro菌株的GFP表达量最高，其次是GS115/pGFP4CCG-tRNACCGPro，都高于GS115/pGFP4CCG，而GS115/pGFP4CCG/ptRNAGCAAla菌株的GFP表达量最低。经软件Quantity One对蛋白胶图进行定量分析，其中，菌株GS115/pGFP4CCG、GS115/pGFP4CCG-tRNACCGPro和GS115/ pGFP4CCG/ptRNACCGPro的蛋白表达量分别为2.43、2.45、2.99 μg/mL，与检测的荧光值结果一致。
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| 图 7 SDS-PAGE比较GFP表达水平 Fig. 7 Comparing the expression levels of GFP by SDS-PAGE. M: protein molecular weight marker. 1: GS115/pGFP4CCG. 2: GS115/pGFP4CCG-tRNACCGPro. 3: GS115/ pGFP4CCG/ptRNAGCAAla. 4: GS115/pGFP4CCG/ptRNACCGPro. |
| 图选项 |
2.3 tRNA共表达系统验证2.3.1 融合基因NFATc3T-GFP表达菌株的构建重组质粒pPIC9K-NFATc3T-GFP以限制性内切酶SalⅠ作为线性化位点酶切后进行浓缩，通过电击转化将质粒转入毕赤酵母GS115和毕赤酵母重组菌株GS115/pFLDα-tRNACCGPro中，通过在MD筛选培养基上培养获得转化子GS115/pNFATc3T-GFP和GS115/pNFATc3T-GFP/ptRNACCGPro。其中，融合基因NFATc3T-GFP序列全长为1 170 bp，由北京华大基因公司测序验证正确。
2.3.2 NFATc3T-GFP融合蛋白表达水平检测诱导表达过程中各重组毕赤酵母的荧光值变化见图 8，荧光值变化趋势高度一致。重组菌株GS115/pNFATc3T-GFP/ptRNACCGPro表达NFATC3T-GFP融合蛋白的荧光值与重组菌株GS115/pNFATC3T-GFP相比，平均提高了21.3%。
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| 图 8 重组毕赤酵母表达NFATC3T-GFP融合蛋白的荧光值对比 Fig. 8 Fluorescence contrast of NFATc3T-GFP expressed in recombinant P. pastoris. *P≤0.05, **P≤0.01 and ***P≤0.001 (Student's t-test). Error bars indicate standard deviations from three parallel experiments. |
| 图选项 |
取诱导表达168 h的菌液上清，通过SDS-PAGE检测各重组毕赤酵母中目的蛋白最终表达水平(图 9)。NFATc3T-GFP融合蛋白理论分子量约为43 kDa，从图中可以看出2个重组菌株均成功表达出了目的蛋白。通过软件Quantity One对蛋白胶图进行定量分析，菌株GS115/pNFATc3T-GFP/ptRNACCGPro的融合蛋白表达量约为2.59 μg/mL，与菌株GS115/pNFATC3T-GFP的融合蛋白表达量2.19 μg/mL相比，提高了18.3%，与检测的荧光值结果相近。
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| 图 9 SDS-PAGE比较NFATc3T-GFP融合蛋白表达水平 Fig. 9 Comparing the expression levels of NFATc3T-GFP by SDS-PAGE. M: protein molecular weight marker. 1: GS115/pNFATc3T-GFP/ptRNACCGPro; 2: GS115/pNFATc3T-GFP. |
| 图选项 |
3 讨论本文以带有连续稀有密码子CCG的GFP基因为报告基因，分别构建了利用同载体表达GFP4CCG基因和tRNACCGPro基因的载体pPIC9K-GFP4CCG-tRNACCGPro，以及利用不同载体表达GFP4CCG基因和tRNACCGPro基因的载体pPIC9K-GFP4CCG和pFLDα-tRNACCGPro，并将重组载体转入毕赤酵母中进行表达。结果显示，与单独表达GFP4CCG相比，两种共表达方式的GFP表达量均有提高，同载体共表达GFP表达量可提高4.9%，不同载体共表达GFP表达量可提高12.5%。采用不同载体共表达的方式优于同一个载体共表达方式，SDS-PAGE定量分析GFP表达量的结果也得到相同结论。这一结果显示tRNA基因与预表达的目的基因不在同一转录单元下表达，有利于其发挥抗阻遏的作用，这与Shin等[25]在大肠杆菌中获得的结果一致。
为了进一步验证不同载体共表达稀少tRNACCGPro基因的毕赤酵母表达体系可以提高含连续稀有密码子CCG外源基因的表达，以含有多个连续脯氨酸稀有密码子CCG的NFATc3T基因为例，构建融合基因NFATc3T-GFP表达菌株GS115/pNFATc3T- GFP/ptRNACCGPro和GS115/pNFATc3T-GFP。实验结果表明，通过不同载体共表达NFATc3T-GFP融合蛋白的表达水平可提高21.3%。此结果进一步验证了共表达稀少tRNACCGPro基因对提高含连续稀有密码子CCG外源基因表达量的有效性。
在动植物中，基因上游出现连续多个毕赤酵母稀有密码子的情况是较为常见的，例如本文中表达的活化T细胞核因子NFATc3T基因(含连续CCG)、菊科植物糖基转移酶UGT76G1基因(含连续CGG)、拟南芥蔗糖转运蛋白SUC1编码基因(含连续GCG)等。这些基因在毕赤酵母中进行外源表达时，连续的稀有密码子极易导致表达过程的提前终止。文中在毕赤酵母细胞中初步建立了提高外源基因表达的稀有tRNA共表达系统，并验证了其有效性，通过该策略可有效改善毕赤酵母表达过程中由于连续稀有密码子存在导致的表达提前终止现象。
与目前普遍采用的密码子优化后进行全基因合成的方法相比，文中提供的策略在实验周期和成本方面具有一定优势，可作为一种备选和补充方案。同时，本策略更适用于除基因合成外的各种功能基因的高通量筛选工作，理论上可有效提高功能基因表达的成功率，进而扩大筛选库的容量，提高筛选目的基因的成功率。
同时，在部分表达系统中，共表达多个优化的稀少tRNA提高了宿主总体mRNA的翻译效率，提高了部分已经过密码子优化的基因的表达和分泌量[18]。目前毕赤酵母中是否同样会出现这种情况还有待研究。
将含有稀有密码子的目的基因与对应tRNA共表达以提高表达量的策略在原核表达系统中有较多报道，例如前文提到的Stratagene等[13]的大肠杆菌CodonPlus菌株、Novagen等[14]的大肠杆菌Rosetta菌株、以及Finger等[18]报道的巨大芽孢杆菌等，均是通过共表达多个经优化后的稀少tRNA，最终显著提高了目的蛋白表达量。本研究完成了在毕赤酵母表达系统中目的基因与稀少tRNA共表达的初步探索，为下一步工作提供了研究基础，经不断优化稀少tRNA的种类和数量，将会达到更为理想的效果，极具研究潜力和开发前景。
4 结论本研究通过同一载体和不同载体两种共表达方式，构建了毕赤酵母稀少tRNA基因与外源基因共表达体系。得到一种适用于含连续稀有密码子CCG的基因与tRNACCGPro基因共表达的毕赤酵母表达体系，提高了外源基因表达量，从而为提高外源基因表达量提供新的思路。该方法不局限于含连续稀有密码子CCG的外源基因与稀少tRNACCGPro基因共表达，还可给其他含连续稀有密码子的外源基因与其相对应的稀少tRNA基因在毕赤酵母中共表达提供方法。
从基因工程的角度改变tRNA丰度能够影响毕赤酵母基因表达水平，对于完善毕赤酵母表达系统和提高外源基因的表达量都具有十分重要的意义。
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