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基于功能宏基因组学技术的金黄色葡萄球菌生物被膜抑制物的发现与活性分析

本站小编 Free考研考试/2021-12-26

朱莹, 柴树茂, 曹明明, 王绍琛, 冯治洋
南京农业大学 食品科技学院, 江苏 南京 210095

收稿日期:2017-02-20;接收日期:2017-05-02 基金项目:国家自然科学基金(Nos.31370088,31500035)资助
作者简介:冯治洋 南京农业大学教授、博士生导师。2006年博士毕业于名古屋大学, 获农学博士学位。博士研究生期间开始微生物次级代谢产物的生物合成研究。2006-2012年先后在威斯康星大学麦迪逊分校和洛克菲勒大学进行博士后研究。研究方向包括:1) 环境微生物来源的活性天然产物的发现及其生物合成机理研究; 2) 微生物抗生素抗性基因的发现、耐药机制以及风险评估。研究成果多次发表在Proc Natl Acad Sci USA、J Am Chem Soc等刊物, 并被C & En News、Science Daily等评述和报道

摘要:宏基因组学方法直接提取环境中的全部微生物基因组DNA,并使其得到功能性表达,为微生物天然产物的开发利用提供了新的方法。利用功能宏基因组学技术,使用大肠杆菌-链霉菌穿梭载体构建四川峨眉山土壤宏基因组文库,并将文库菌中所携带的环境DNA接合转移到链霉菌宿主中。通过活性筛选获得两个具有抗菌活性的阳性链霉菌克隆,其发酵粗提物对金黄色葡萄球菌生物被膜的形成均有很好的抑制作用,当浓度达到2 MIC(Minimum inhibitory concentration)时,抑制作用超过90%;同时,两种粗提物样品对金黄色葡萄球菌生物被膜也存在显著的清除作用,其中EM110样品对金黄色葡萄球菌生物被膜的清除率高于EM123样品。本文通过功能宏基因组学技术,直接从土壤中筛选获得了对金黄色葡萄球菌生物被膜有较强抑制及清除作用的活性物质。
关键词:宏基因组学 接合转移 表型筛选 金黄色葡萄球菌 生物被膜抑制剂
Discovery and analysis of Staphylococcus aureus biofilm inhibitors using functional metagenomics approach
Zhu Ying, Chai Shumao, Cao Mingming, Wang Shaochen, Feng Zhiyang
College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China

Received: February 20, 2017; Accepted: May 2, 2017
Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31370088, 31500035)
Corresponding author:Zhiyang Feng.Tel:+86-25-84399511;E-mail:zfeng@njau.edu.cn


Abstract: Although most microbes are not readily cultured in the lab, microbial DNA can be extracted directly from an environmental sample and be functionally expressed in a suitable host for natural products discovery, and this approach has been termed "metagenomics". An E'mei Mountain soil metagenomic library was constructed using an Escherichia coli-Streptomyces shuttle vector for functional based screening of anti-bacterial clones in Streptomyces albus host. Two active clones were obtained and their fermentation broths were studied for the inhibitory effect on Staphylococcus aureus biofilm. Their fermentation products have a good inhibitory effect on the formation of S. aureus biofilm, and the inhibitory effect could exceed 90% when the concentration of sample was 2 MIC (Minimum Inhibitory Concentration). In addition, two samples had significantly effect on S. aureus biofilm dispersal, and the clearance rate of EM110 was higher than EM123. In conclusion, substances with strong bioactivities on biofilm formation and dispersal of S. aureus could be discovered by using metagenomics technology.
Key words: metagenomics conjugation phenotypic screening Staphylococcus aureus biofilm inhibitors
金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus广泛存在于空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中,作为一种典型的革兰氏阳性致病菌,在世界范围内造成了大量感染性疾病[1-2]。生物被膜是金黄色葡萄球菌等致病菌的浮游菌株在特定生长条件下经附着、聚集、聚丛和生产胞外多糖,逐渐形成的生物膜结构[3-4]。该结构可显著增加金黄色葡萄球菌对宿主免疫应答和抗生素的抵抗力,使被膜菌较浮游菌的耐药性增大1 000倍,且容易造成二次感染[5-7]。微生物天然产物一直是抗感染药物的重要来源[8],并且通过基因重组[9]、调节微生物代谢[10]等方式可以获得一定的微生物代谢产物。但是,由于只有1%的微生物可以在现有的条件下进行培养研究,从而导致了天然产物重复发现,新结构的天然产物的发现越来越困难[11]。因此,研究新的方法和策略来发掘微生物天然产物资源势在必行。
功能宏基因组学技术直接从环境样品中提取总DNA (Environmental DNA,eDNA),通过构建宏基因组文库并功能表达文库中的eDNA来获得新的生物活性产物,从而有效克服了传统方法对微生物次级代谢产物发现的局限性[12-14]。目前,功能宏基因组技术大多应用大肠杆菌作为筛选宿主,而作为次级代谢产物表达的模式宿主链霉菌,由于技术上的限制,直到最近才见报道[15]。本研究以四川省峨眉山土壤为样品,以链霉菌为宿主,通过功能宏基因组学的方法获得了抗菌活性产物,并分析其对生物膜态金黄色葡萄球菌的抑制作用,以期为抗菌物质发现提供新的技术方法。
1 材料与方法1.1 材料与试剂土壤样品采自四川省峨眉山市黄湾乡龙门村;克隆宿主菌JTU007/pUZ8002及穿梭载体pJTU2554[16]由上海交通大学陶美凤研究员馈赠;卡那霉素、安普霉素购自上海捷瑞生物有限公司;T4 DNA ligase购自Thermo公司;质粒提取试剂盒和琼脂糖胶回收试剂盒购自TIANGEN有限公司;pWEB-TNCTM Cosmid Cloning Kit为EPICENTRE公司产品;胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂粉等试剂购自上海生工生物有限公司。白色链霉菌S. albus、金黄色葡萄球菌S. aureus由本实验室保存。
1.2 仪器与设备Gel X1520凝胶成像仪,购自上海欧翔科学仪器有限公司;CT15RT高速冷冻离心机,购自上海天美;UV-2600紫外可见分光光度计,购自日本岛津公司;GYY-6C稳压稳流电泳仪,购自北京六一生物科技有限公司;LDZM-40KOS立式压力蒸汽灭菌锅、DNP-9162电热恒温培养箱,购自上海申安医疗器械有限公司;SW-CJ-1FD超净工作台,购自苏州苏洁净化设备有限公司;HYG-C型摇床,购自太仓实验设备厂;SL2001N型电子天平,购自上海民桥精密科学仪器有限公司。岛津LC-20A高效液相色谱仪,购自日本岛津公司。
1.3 方法1.3.1 土壤宏基因组文库的构建将采集的土壤样品先后通过不同孔径的筛网筛理后,经过裂解液和SDS缓冲液直接裂解抽提其中微生物的总DNA,然后通过电泳确定其浓度和纯度大小后,使用pWEB-TNCTM Cosmid Cloning Kit试剂盒中的末端修复酶对DNA末端修饰补平后,与制备的平末端穿梭表达载体pJTU2554连接,连接产物经噬菌体蛋白包装后侵染文库宿主菌,取10 μL侵染混合液铺在含50 μg/mL安普霉素的LB平板上,37 ℃培养过夜,计数计算滴度,按所计算滴度,将侵染获得的文库菌分装到培养试管,使每管含约500克隆,37 ℃过夜培养后备用。
1.3.2 阳性克隆筛选将上述过夜培养的文库菌接种到新的LB培养基培养至OD600达到0.4-0.8 (生长状态)后,与热激促萌发的白色链霉菌孢子混合。随后将混合菌液均匀涂布在含10 mmol/L MgCl2的MS固体平板上,置于30 ℃培养16-18 h。随后涂布含有萘啶酮酸(0.5 mg/mL)和安普霉素(0.4-0.5 mg/mL)的水溶液,继续培养3-5 d。用灭菌纱布将接合子分别影印至R5、MS、ISP4固体培养基上,继续培养5-7 d后,在上层覆盖含金黄色葡萄球菌的琼脂含量为0.6%-0.7%软固体培养基。待上层琼脂凝固后,继续置于30 ℃培养1-2 d后观察上层琼脂有无出现透明抑菌圈的区域,如果出现透明抑菌圈,挑出此克隆划线再次验证其抗菌活性。
1.3.3 阳性克隆发酵及产物提取采用不同的培养基对阳性克隆进行发酵,通过对培养基种类和发酵时间进行优化,最终决定采用MS作为种子培养基、ISP4 (含树脂)作为发酵培养基,使发酵产物活性最高。称取一定量的豆粉加入纯净水煮沸2 h后用纱布过滤,收集滤液,再加入D-mannitol溶解,配制成MS液体培养基,定容后进行分装,每个250 mL锥形瓶中分装50 mL培养基,用8层纱布封口后高温灭菌。按照终浓度50 μg/mL加入安普霉素、接种孢子后,于225 r/min、28 ℃条件下培养3 d。培养基变为棕褐色,按照1%比例转接ISP4 (树脂含量3%-5%)培养基,225 r/min、28 ℃继续培养12 d。树脂吸附发酵产物,洗涤培养基,回收树脂,晾干后,用甲醇溶解吸附树脂上的产物,旋蒸后收集产物,备用。其中,以插入空载体的白色链霉菌的发酵产物为对照组。
1.3.4 粗提物对金黄色葡萄球菌生物被膜的影响菌株的预处理:吸取5 μL金黄色葡萄球菌原始菌液,置于5 mL含2.5% (质量分数)葡萄糖的TSB培养基中,37 ℃培养24 h后,涂布100 μL菌液于倒有20 mL LB培养基的9 cm平板上,37 ℃条件下培养24 h,挑取单个菌落接种于刚果红培养基,37 ℃培养48 h,筛选出菌落变为黑色带晶体且生长状况良好的菌株用于后续实验。
最小抑菌浓度MIC值的测定:采用肉汤常量稀释法[17-19]测定粗提物对金黄色葡萄球菌的MIC值。
粗提物对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制作用:参照文献中的方法[20],具体操作如下。用含有2.5% (质量分数)葡萄糖的TSB培养基配制浓度为A600=0.05的金黄色葡萄球菌菌液,分别添加浓度为2、1、1/2、1/4、1/8、1/16 MIC的样品液,各取200 μL接种入96孔板中,每个样品浓度设6个复孔,空白对照孔6个复孔(只加培养基),另设阴性对照孔6个复孔(未加粗提物的生物被膜生长对照),37 ℃培养48 h后,弃去上清液并用磷酸钾缓冲盐(PBS,pH 7.4) 清洗3次。用0.1%结晶紫染色30 min,弃去结晶紫染液,用蒸馏水洗至澄清;加入无水乙醇溶液200 μL溶解,酶标仪测定各孔于波长570 nm处的吸光度。
粗提物对成熟金黄色葡萄球菌生物被膜的清除作用:根据文献中的方法进行测定[20]。向96孔板中加入200 μL用含有2.5% (质量分数)葡萄糖的TSB培养基配制浓度为A600=0.05的金黄色葡萄球菌菌液,37 ℃培养24 h,弃去培养基及悬浮菌,再用PBS清洗3次,用含有2.5% (质量分数)葡萄糖的TSB培养基配制浓度分别为2、1、1/2、1/4、1/8、1/16 MIC的粗提液样品,依次每孔加入200 μL,相同浓度的样品设6个复孔,空白对照孔6个复孔(只加培养基),另设阴性对照孔6个复孔(未加粗提物的生物被膜生长对照),37 ℃培养48 h后,弃上清液并用PBS清洗3次。用0.1%结晶紫染色30 min,弃结晶紫染液,用蒸馏水洗至澄清;加入无水乙醇溶液200 μL溶解,酶标仪测定各孔于波长570 nm处的吸光度。
粗提物对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制率或清除率按下式计算:
抑制率或清除率(%)=(A2-A1)/(A2-A0)×100
式中:A0为空白对照组A570的吸光值;A1为样品作用组A570的吸光值;A2为阴性对照组A570的吸光值。
1.3.5 数据统计分析所有数据利用Microsoft Excel进行统计处理,用SAS 9.2进行ANOVA分析,不同平均值之间利用LSD法进行差异显著性检验。
1.3.6 粗提物的高效液相法(High-performance liquid chromatography,HPLC)分析称取少量发酵粗提物,加入一定量体积的甲醇,配制成浓度为1 mg/mL的溶液,取10 μL用于HPLC分析。色谱条件:Diamonsil C18 (5 μm,4.6 mm×250 mm)色谱柱,柱温25 ℃,检测波长254 nm,流动相甲醇:水由10:90到100:0梯度洗脱1 h,流速1 mL/min。
2 结果与分析2.1 表型筛选到的阳性克隆鉴定通过筛选80 000个转化子,获得了2个对金黄色葡萄球菌有较强抑制作用(抑菌圈半径约为0.2 mm)的阳性克隆EM110和EM123 (图 1)。为避免假阳性的存在,将EM110和EM123克隆在相应抗性MS平板划线纯化后,对其抗菌活性进行确定,EM110和EM123克隆仍然有抑制金黄色葡萄球菌作用,检测平板上出现抑菌圈。
图 1 筛选后的阳性克隆 Figure 1 Positive clones obtained by functional based screening.
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随后,以含空载体的S. albus为对照,对EM110和EM123进行发酵,并对发酵产物进行了活性分析(图 2)。结果表明,发酵产物样品能明显抑制金黄色葡萄球菌的生长(抑菌圈半径约为0.3 mm)。该结果说明样品中含有抑菌活性物质。
图 2 克隆发酵产物的抗菌活性 Figure 2 Anti-bacterial activity of the fermentation extracts from two positive clones.
图选项




2.2 粗提物对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用2.2.1 粗提物对金黄色葡萄球菌的MIC值阳性克隆EM110与EM123发酵产物的活性分析证明了其发酵产物对金黄色葡萄球菌的抑制作用。利用“肉汤常量稀释法”对EM110与EM123的发酵粗提物进行了最小抑菌浓度分析。结果表明,样品EM110和EM123对金黄色葡萄球菌的MIC值分别为1.30 mg/mL和1.00 mg/mL,显著低于对照组的18 mg/mL。说明两种样品对金黄色葡萄球菌有良好的抑制作用。
2.2.2 粗提物对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制作用浮游态金黄色葡萄球菌在不同基质中形成生物被膜存在复杂的生长过程,在该过程中,浮游态菌体不断被细胞外基质和基质网所包被,形成完整的具有群体效应的生物被膜[21]。这些细胞外基质包含了水、胞外多糖、胞外核酸、胞外蛋白质等成分。因此,金黄色葡萄球菌形成生物被膜的过程并不是简单的致病菌细胞集合,而是具有类似于高等生物组织功能的组合体。并且研究表明,致病菌生物被膜的形成需要不同菌体之间的群体行为,该行为与菌体的浓度及菌体外的密度信号感应(Quorum sensing)有关,类似于高等生物的发育周期[22-23]。因此,研究抑菌剂对金黄色葡萄球菌生物被膜形成过程的抑制作用可以为抑菌剂的有效抑菌提供理论支持。图 3为实验中不同提取物浓度对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制作用结果。
图 3 粗提物对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用 Figure 3 Inhibitory effect of the fermentation extracts on the formation of S. aureus biofilm.
图选项




图 3结果显示,不同浓度的样品对金黄色葡萄球菌生物被膜的形成均具有良好抑制作用。与对照相比,两种样品的不同浓度对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制率均显著高于对照组(P < 0.05)。另外,随着样品浓度的增大,两种样品对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制作用显著增强;在2 MIC浓度下,两种样品对生物被膜的抑制率都超过了90%,在1/4 MIC浓度下,两种样品对生物被膜的抑制率仍达到60%以上,在1/4-2 MIC浓度范围内,两种样品对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用无显著差异(P > 0.05)。
2.2.3 粗提物对金黄色葡萄球菌生物被膜的清除作用研究表明,在成熟的金黄色葡萄球菌生物被膜中可以形成具有三维结构的微菌落(Microcolony)[24-25],这些三维结构将单个菌体构成一个复杂的“群居体”,从而增加了致病菌的耐药性及抵抗宿主自身免疫系统的能力。其耐药性具体表现为生物被膜的渗透限制作用和生物被膜的主动外排机制,这些机制增加了抑菌剂的使用要求[26]。在本研究中,通过功能宏基因组学技术筛选获得的活性成分对金黄色葡萄球菌生物被膜具有有效的清除作用(图 4)。
图 4 粗提物对金黄色葡萄球菌生物被膜的清除作用 Figure 4 Effect of fermentation extracts on S. aureus biofilm dispersal.
图选项




图 4结果表明,与对照组相比,不同浓度的两种样品对金黄色葡萄球菌生物被膜均有显著的清除作用(P < 0.05),并且随着样品浓度的增加,清除作用显著增加;在1 MIC浓度时,EM110样品对生物被膜清除率超过30%,EM123样品在2 MIC浓度时对生物被膜的清除率达到33.56%±1.24%。另外,当样品浓度增加至大于1/8 MIC时,EM110样品对金黄色葡萄球菌生物被膜的清除率显著高于EM123样品(P < 0.05)。
2.3 阳性克隆发酵粗提物的HPLC检测为检测阳性克隆表达的活性产物,对阳性克隆发酵粗提物进行了HPLC (图 5)。与对照相比,EM123样品可检测到微弱的特异峰,但产量较低。虽然EM110的发酵粗提物的生物被膜活性要高于EM123,但EM110样品没有检测到明显的克隆特异峰(结果未显示),原因可能是EM110中的活性物质产量很低,未来通过发酵优化提高产量和改进检测方法的手段将可能发现新的活性单体化合物。
图 5 阳性克隆EM123发酵粗提物的HPLC分析 Figure 5 HPLC UV (254 nm) traces of EM110 and EM123 fermentation extracts. Star markers indicate the clone specific peaks.
图选项




3 结论以链霉菌为表达宿主,利用功能宏基因组学技术获得了两个对金黄色葡萄球菌均有良好的抑制作用的克隆,其发酵产物对金黄色葡萄球菌的MIC值分别为1.30 mg/mL和1.00 mg/mL。克隆发酵产物对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用显著,并且在1/4-2 MIC浓度范围内,两种样品对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用无显著差异。同时,两种样品对金黄色葡萄球菌生物被膜也存在显著的清除作用(P < 0.05),当样品浓度大于1/8 MIC时,EM110样品对金黄色葡萄球菌的清除率高于EM123样品。

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    王全民,马遥,刘丽钧,朱军,刘智华中科技大学生命科学与技术学院,湖北武汉430074收稿日期:2017-02-11;接收日期:2017-05-02;网络出版时间:2017-05-17基金项目:国家自然科学基金(No.81572050)资助作者简介:刘智华中科技大学生命科学与技术学院教授,博士生导师, ...
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  • 白念珠菌生物被膜形成的遗传调控机制
    郭东东1,岳慧珍2,魏羽佳1,黄广华21贵州医科大学附属医院,贵州贵阳550004;2中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室,北京100101收稿日期:2017-03-28;接收日期:2017-07-19;网络出版时间:2017-08-24基金项目:贵州省优秀科技教育人才省长专项资金(No.[2 ...
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  • 基于Lux型群体感应系统干预的生物被膜调控在污水处理中的研究进展与前景
    赵畅1,王宁1,王文昭1,2,徐期勇11北京大学深圳研究生院环境与能源学院,广东深圳518055;2福瑞莱环保科技(深圳)股份有限公司,广东深圳518055收稿日期:2017-04-18;接收日期:2017-06-20;网络出版时间:2017-08-10基金项目:深圳市科技计划项目(Nos.JCYJ ...
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  • 黄色粘球菌基于复杂社会性细胞行为的生物被膜
    王川东1,王艳1,郑悦1,张坤梅1,胡玮1,施文元2,李越中11山东大学生命科学学院微生物技术国家重点实验室,山东济南250100;2加州大学洛杉矶分校牙学院,美国洛杉矶CA90095收稿日期:2017-05-15;接收日期:2017-06-27;网络出版时间:2017-08-04基金项目:国家自然 ...
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  • 生物被膜在病原细菌与植物识别中的作用
    宋丽阳1,2,方荣祥1,贾燕涛11中国科学院微生物研究所植物基因组学国家重点实验室,北京100101;2中国科学院大学,北京100049收稿日期:2017-02-28;接收日期:2017-05-05;网络出版时间:2017-05-24基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)(No.2015C ...
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  • 2017兽医生物技术专刊序言
    仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,黑龙江哈尔滨150069收稿日期:2017-08-09作者简介:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研究员、博士研究生导师、猪病研究室主任、猪烈性传染病团队首席科学家。主要从事猪瘟、伪狂犬病等猪烈性传染病的基础和应用研究。任《生物工程学报》和《中国农业科学》编委、农业 ...
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  • 基于质谱技术的神经肽研究进展
    姬倩悦1,2,马敏1,2,彭鑫1,贾辰熙2,李灵军1,31天津大学生命科学学院,天津300072;2国家蛋白质科学中心北京蛋白质组研究中心蛋白质组学国家重点实验室放射与辐射医学研究所,北京102206;3美国威斯康星大学麦迪逊分校药学院和化学系,美国威斯康星麦迪逊53705收稿日期:2016-12- ...
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  • 循环长链非编码RNA作为生物标志物在肿瘤分子诊断中的应用
    江楠1,田海华1,2,潘金昌1,龚朝辉11宁波大学医学院生物化学与分子生物学研究所,浙江宁波315211;2宁波市康宁医院检验科,浙江宁波315201收稿日期:2016-11-30;接收日期:2017-01-24;网络出版时间:2017-02-13基金项目:浙江省自然科学基金(No.LY15C060 ...
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  • 两株绿脓杆菌对石油污染土壤的修复作用
    黄磊,赵婷婷,贺赟,刘一琳,刘畅,靳大耀,贾晓强天津大学化工学院生物工程系系统生物工程教育部重点实验室,天津300072收稿日期:2016-12-08;接收日期:2017-03-20;网络出版时间:2017-04-11基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)(No.2014CB745100) ...
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