常亚南¹, 刘浩², 冯成宝¹, 何晓亮¹, 周晓辉¹
1 河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050000;
2 河北科技大学 继续教育学院，河北 石家庄 050000

收稿日期：2016-09-26;接收日期：2017-01-17 基金项目：河北省“****”项目 (No. E2012100005)，教育部留学回国人员科研启动基金，河北省自然科学基金 (No. C2012208019) 资助

摘要： 为了提高本课题组前期构建的Ⅱ型胶原蛋白-透明质酸-硫酸软骨素的人工三维软骨支架对软骨细胞生长的促进作用，采用乳化交联法以壳聚糖为原料，加入细胞转化生长因子TGF-β1，并通过真空冷冻干燥技术制备了包裹TGF-β1的壳聚糖微球。然后分别将其与空白壳聚糖微球整合进软骨支架中，并接种小鼠软骨细胞ATDC-5，通过观察细胞生长状态来评价缓释微球在人工软骨支架中对软骨细胞生长是否具有促进作用。结果显示所制得的壳聚糖微球球体表面光滑，分散均匀，直径在100 nm左右，吸水率良好可达983.73%±4.38%，抗酶解作用较强，第28天时降解率仅达到51.0%±1.8%。由TGF-β1累积释放曲线可知TGF-β1在开始的24 h内释放最快，之后逐渐减慢，在120 h之后进入平台期，具有缓释效果。MTT试验以及荧光染色试验充分表明，由Ⅱ型胶原蛋白、透明质酸以及硫酸软骨素构建的三维软骨支架适合ATDC-5细胞的生长增殖，并且壳聚糖微球对TGF-β1的缓释能够显著促进细胞的生长。
关键词： 组织工程 软骨支架 壳聚糖微球 转化生长因子 小鼠软骨细胞
ATDC-5 growth promoted by sustained-releasing chitosan microspheres loading TGF-β1 in artificial cartilage scaffolds
Ya'nan Chang¹, Hao Liu², Chengbao Feng¹, Xiaoliang He¹, Xiaohui Zhou¹
1 School of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050000, Hebei, China;
2 School of Continuing Education, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050000, Hebei, China

Received: September 26, 2016; Accepted: January 17, 2017
Supported by: "100 Talent Program" of Hebei Province (No. E2012100005), Scientific Research Staring Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars, Ministry of Education of China, Natural Science Foundation of Hebei Province (No. C2012208019)


Abstract: In order to promote the growth of chondrocyte ATDC-5 in collagen type II-hyaluronic acid-chondroitin sulfate composite scaffolds constructed previously in vitro, the sustained-releasing chitosan microspheres loading TGF-β1 were prepared by emulsification and cross-linking. In addition, ATDC-5 was inoculated into the scaffolds incorporating the chitosan microspheres with TGF-β1. Results show that the morphology of microsphere was round and uniform, mean diameter was about 100 nm, absorption rate was up to 983.7%±4.38%.When the microsphere was incubated under the condition of 10⁷ U/L lysozyme, the degradation rate was only 51.0%±1.8% on day 28. Moreover, to compare the effect of TGF-β1, the growth of ATDC-5 in different scaffolds was observed by MTT assay and fluorescence staining test. According to the cumulative release curve, TGF-β1 was released quickly at initial 24 h, then gradually decelerated, finally reached the plateau after 120 h. MTT assay and fluorescence staining test demonstrated that the scaffolds were suitable for ATDC-5 growth and proliferation, as well as, suggested that the sustained-releasing chitosan microspheres loading TGF-β1 could significantly promote the growth of ATDC-5.
Key words: tissue engineering cartilage scaffolds chitosan microsphere transforming growth factor mouse chondrocyte
关节软骨的损伤和病变是临床骨科的常见疾病。由于软骨组织自身修复能力有限，一旦发生损伤病变，必须进行修复或置换，如何有效地修复关节软骨损伤始终是医学界尚待解决的难题之一^[1]。近年来快速发展的组织工程技术为关节软骨缺损的修复治疗提供了新思路和新方法，研究者们纷纷把目光聚集到构建人工软骨支架的研究中^[2]。
转化生长因子β(Transforming growth factor β，TGF-β) 是由一类结构、功能相关的多肽生长因子亚族组成的大家族^[3]。其中TGF-β1是一个多功能蛋白，调节细胞的多种功能，比如细胞的增殖、分化以及细胞外基质的代谢并可以抑制软骨形成过程中软骨细胞的终末分化^[4]。有关细胞因子对成骨细胞的作用研究表明，单独将细胞因子植入体内并不能显著地促进骨的生成，这是因为细胞因子易被体液稀释、降解等，因此需要有合适的缓释体系才能有效地发挥细胞因子的作用^[5-6]。
本课题组已经初步构建了Ⅱ型胶原蛋白-透明质酸-硫酸软骨素的人工三维软骨支架^[7]。为了进一步提高该支架的生物学性能，本研究利用生物相容性好、无细胞毒副作用的壳聚糖作为载体材料^[8-10]来制备缓释微球，用于包裹TGF-β1，然后将空白壳聚糖微球和包裹有TGF-β1的壳聚糖微球分别整合进软骨支架中，接种小鼠软骨细胞ATDC-5，通过观察细胞生长状态来分析缓释微球在人工软骨支架中对软骨细胞生长是否具有促进作用。旨在探索性能良好的人工软骨支架，为将来临床应用奠定实验基础。
1 材料与方法1.1 主要试剂及仪器TGF-β1 (Peprotech)，壳聚糖 (Solarbio)，溶菌酶 (北京科百奥生物科技有限公司)，ELISA试剂盒 (联科生物技术有限公司)，DMEM : F12细胞培养基 (Gibco)，胎牛血清 (Hyclone)，谷氨酰胺 (Solarbio)，Hoechest 33342 (Sigma)，FITC (Sigma)，Span 80 (Solarbio)，胰蛋白酶 (Solarbio)，DMSO (MP)；小鼠软骨细胞ATDC-5，购自南京科佰生物科技有限公司。
真空冷冻干燥机 (Gene)，CO₂培养箱 (Thermo)，扫描电子显微镜 (Hitachi)，倒置荧光显微镜 (Olympus)。
1.2 壳聚糖缓释微球的制备将2.5 mL壳聚糖溶液和20 μL TGF-β1溶液加入到5% Tween80液体石蜡混合液中，磁力搅拌器高速搅拌2 h至溶液均一。然后缓慢滴加浓度为5%、pH 2.5的三聚磷酸钠溶液6.25 mL，高速搅拌2 h至溶液成为均一的乳浊液。高速冷冻离心机4 ℃、12 000×g条件下离心15 min，小心弃掉上层溶液，所得微球沉淀用异丙醇洗2次，每次均使用高速冷冻离心机在4 ℃、12 000 ×g条件下离心15 min，再用双蒸水洗4次，每次均按上述条件离心，沉淀置于-20 ℃冷冻，最后使用真空冷冻干燥机冻干后置于-20 ℃保存。
1.3 壳聚糖缓释微球参数测定1.3.1 扫描电子显微镜观察微球形貌冷冻干燥后的微球粉末进行上机喷金，然后进行扫描电子显微镜检测，加速电压为3 kV。
1.3.2 吸水率测定称量20 mg左右壳聚糖微球分别置于4个EP管中，分别称重。每管加入1 mL PBS溶液，将其置于培养箱中，37 ℃、130 r/min条件下振荡，分别在0.5、1.0、1.5、2.0 h时间段取出，3 000 r/min离心后弃上清并弃去表面残留的水分后再次称重。试验前质量记为m₁，试验后质量记为m₂。按以下公式计算吸水率。
?吸水率 (%)=(m₂-m₁)/m₁×100%
?式中，m₁为吸水前壳聚糖微球的质量 (g)；m₂为吸水后壳聚糖微球的质量 (g)。
1.3.3 降解率测定分别准确称取20 mg壳聚糖微球，置于6个EP管中，分别称重。加入含溶菌酶10⁷ U/L的磷酸缓冲液 (PBS) 溶液，于培养箱中37 ℃、130 r/min条件下气浴振荡，分别在1、3、7、14、21、28 d取出，10 000 r/min离心5 min，弃上清后用双蒸水漂洗沉淀2遍，-20 ℃冷冻，然后一起冷冻干燥，分别称重。试验前质量记为m₃，试验后质量记为m₄。按以下公式计算降解率。
?降解率 (%)=(m₃-m₄)/m₃×100%
?式中，m₃为降解前壳聚糖微球的质量 (g)；m₄为降解后壳聚糖微球的质量 (g)。
1.3.4 TGF-β1累积释放曲线测定分别称取10 mg TGF-β1壳聚糖微球于1.5 mL EP管中，加入1 mL PBS，37 ℃条件下135 r/min振荡，分别于2 h、4 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d取出后，10 000 r/min离心5 min。取出150 μL样品，-20 ℃保存备用，并补加150 μL PBS溶液继续试验。7 d后采用ELISA试剂盒 (Human TGF-β1 Sunny Elisa) 测定吸光值，记为A1。同时另取10 mg TGF-β1壳聚糖微球溶于2 mL 2%乙酸溶液中，制成待测样本，测定吸光值，记为A2，并计算10 mg微球中包裹的生长因子总量。试验重复进行3次。
以释放时间为横坐标，A1/A2为纵坐标测定绘制累积释放率曲线、绘制标准曲线，并按照下面公式分别计算包封率和载药量。
?载药量=溶液中药物含量/微球质量
?包封率 (%)=载药量×微球总量/总投药量×100%
1.4 三维复合软骨支架的制备称取TGF-β1壳聚糖微球1 mg，将其分散在100 μL的90%乙醇中，然后加入到已构建的三维软骨支架中，-80 ℃冷冻后利用真空冷冻干燥机冻干，-20 ℃保存备用，以上为试验组，对照组将不含有TGF-β1的壳聚糖微球按照同样的方法进行试验。
1.5 细胞在三维复合软骨支架上的培养采用24孔板来培养细胞，实验组在孔中加入含有TGF-β1的三维复合软骨支架，对照组中加入不含有TGF-β1的三维复合软骨支架。取生长状态良好的细胞ATDC-5，消化后计数，调整细胞浓度至2.5×10⁴/mL，按照2.5×10⁴/孔的密度接种到放有三维复合软骨支架的孔板中培养。
1.6 MTT法检测细胞活力小心弃去孔中的培养基，实验组和对照组均加入200 μL不含血清的新鲜培养基，每孔加入MTT溶液20 μL，于CO₂培养箱中避光条件下37 ℃培养4 h。然后每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，在490 nm条件下测定吸光值。分别在3、5、7、14 d利用MTT法检测细胞活力。试验平行进行3次，记录数据，进行统计学分析。
1.7 荧光染色法观察细胞生长状态小心弃去孔中的培养基，加入1 mL浓度为0.01 mol/L的PBS溶液洗支架，弃去PBS溶液，再加入990 μL浓度为0.01 mol/L的PBS溶液和10 μL浓度为5 mg/mL的FITC溶液，小心混匀。置于CO₂培养箱中避光条件下37 ℃染色15 min。FITC染色结束后，用浓度为0.01 mol/L的PBS溶液洗支架2-3次，每次3-5 min。然后加入990 μL浓度为0.01 mol/L的PBS溶液和10 μL浓度为1 mg/mL的Hoechst 33342溶液，小心混匀。置于CO₂培养箱中避光条件下37 ℃染色20 min，染色结束后，使用浓度为0.01 mol/L的PBS溶液洗支架2-3次，每次3-5 min。分别在第3、5、7、14天进行染色试验，并用倒置荧光显微镜观察支架中的细胞，拍照记录。
2 结果与分析2.1 扫描电子显微镜观察微球形貌通过真空冷冻干燥机冻干的壳聚糖微球为淡黄色粉末状，粒度极细。由图 1可以看出，所制备的微球外观为球状，球体表面光滑，分散较好，大小均匀，直径在100 nm左右。

图 1 壳聚糖微球扫描电子显微镜图 Figure 1 The scanning electron microscopy of chitosan microspheres.

图选项

2.2 壳聚糖缓释微球的吸水率经实验测定，壳聚糖缓释微球在0.5、1.0、1.5、2.0 h所对应的吸水率分别为301.21%±2.35%、976.32%±9.41%、977.67%±7.51%、983.73%±4.38%。可以看出，在0.5 h的时候壳聚糖微球的吸水率约为自身重量的3倍，在1.0 h时达到平衡，约为自身重量的9.8倍，吸水率较高，具有很好的吸水膨胀性能，能够增强壳聚糖微球的缓释效果。
2.3 壳聚糖缓释微球的降解率经实验测定，壳聚糖缓释微球在1、3、7、14、21、28 d的降解率分别为4.5%±0.6%、7.0%±0.8%、11.0%±1.6%、19.5%±1.6%、32.0%±1.5%、51.0%± 1.8%，如图 2所示。随着溶菌酶对壳聚糖微球作用时间的延长，壳聚糖微球逐渐被降解，并且降解速率在增加，降解速率的变化可能是因为随着酶解时间的延长，壳聚糖微球的表面逐渐被酶解，逐渐破坏其乳化交联的结构，内部结构逐渐暴露，溶菌酶对壳聚糖的降解作用更容易发挥。但第28天时降解率仅达到51.0%±1.8%，表明所制得的壳聚糖微球就有较强的抗酶解能力。

图 2 壳聚糖微球降解率统计图 Figure 2 Degradation rate of chitosan microspheres.

图选项

2.4 TGF-β1累积释放曲线、包封率和载药量对包裹有TGF-β1壳聚糖微球缓慢释放TGF-β1体系连续监测7 d，利用ELISA试剂盒检测并绘制体外累积释放曲线，如图 3所示，在最初的24 h内TGF-β1的释放率最大，24-120 h释放量还在增加，但速率较最初的24 h减慢，在120 h之后，曲线平缓，表明释放进入平台期，保持稳定。7 d的累积释放率为57.57%±1.32%。结合累积释放曲线通过公式计算得壳聚糖微球载药量为 (25.6±0.23) μg/g，包封率为80.21%±0.02%。

图 3 TGF-β1壳聚糖微球体外累积释放曲线 Figure 3 Cumulative release curve of TGF-β1 chitosan microspheres in vitro.

图选项

2.5 MTT法检测ATDC-5细胞活力对实验组和对照组的细胞定期利用MTT法检测细胞活力，经统计学分析如图 4所示。整体来看，试验组细胞的活力均高于对照组细胞的活力。第3天时，实验组和对照组之间的细胞活力相差较小，这是因为刚开始培养时，细胞数目均相对较少，且吸收TGF-β1后有一个短暂的适应期，在第3天开始表现出差异。随培养时间的延长，细胞紧贴三维复合软骨支架生长，数目逐渐增加，且TGF-β1的释放量趋于稳定，对照组和实验组之间细胞活力的差异逐渐表现出来，并且越来越显著，在细胞培养2周时，差异极其显著 (P＜0.01)。以上结果充分说明，由Ⅱ型胶原蛋白、透明质酸以及硫酸软骨素构建的三维软骨支架适合ATDC-5细胞的生长增殖，并且壳聚糖微球对TGF-β1的缓释能够显著促进细胞的生长。

图 4 MTT法检测ATDC-5细胞增殖活力统计图 Figure 4 ATDC-5 cells proliferation vigor by MTT. Statistically significant difference is marked (*P < 0.01).

图选项

2.6 荧光染色法观察细胞生长状态将对照组和实验组的细胞定期进行荧光染色后利用倒置荧光显微镜拍照，如图 5所示，其量化结果见表 1。支架通过荧光照射呈现绿色，细胞通过荧光照射呈现蓝色，可以清楚看出支架为三维立体状，细胞均匀吸附在三维立体支架中，生长状态良好。图 5中分别记录了培养3、5、7、14 d细胞的生长过程。接种细胞后3 d时，对照组和试验组细胞均较少，这是因为刚开始培养时，细胞数目均相对较少且需经过一个短暂的适应期，并且在试验初期TGF-β1的释放量较小。但是可以看出试验组细胞数目多于对照组，随培养时间的延长，细胞生长速率增加，细胞在三维支架中均匀分散，且由于TGF-β1对细胞生长的促进作用，试验组细胞数目较对照组细胞数目多，差异随培养时间的延长越来越明显。在培养14 d时，支架中细胞数目更多，细胞均匀分散在支架中，密度很大，且试验组尤其明显。充分说明由Ⅱ型胶原蛋白、透明质酸以及硫酸软骨素构建的三维软骨支架适合ATDC-5细胞的生长增殖，并且壳聚糖微球对TGF-β1的缓释能够显著促进细胞的生长。

图 5 支架上培养的软骨细胞ATDC-5荧光染色图 (×400) Figure 5 Fluorescence staining of ATDC-5 chondrocytes cultured on scaffolds (×400). Letter a showed control group; b showed experimental group; arrow showed ATDC-5 cells.

图选项

表 1 ATDC-5荧光染色细胞数目统计表Table 1 Number of ATDC-5 chondrocytes by fluorescence staining

Group	3 d	5 d	7 d	14 d
Control group	25±3	45±2	87±5	133±6
Experimental group	31±2	78±3	158±5	314±7

表选项


3 讨论目前，国内外对关节软骨损伤和缺损修复的研究主要集中在以下几个方面：关节镜清创术^[11]、软骨细胞移植^[12]、组织工程化软骨^[13-15]和凝胶类关节软骨修复材料^[16-18]。其中，组织工程化关节软骨被认为是最有应用前景的关节软骨修复材料。因此，组织工程化软骨中新型支架材料的开发成为一个热点研究方向。应用在组织工程的支架材料主要有胶原蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、壳聚糖和羟基磷灰石等。许多****纷纷致力于新型软骨支架的开发研究^[19-23]。
本课题组前期实验构建了Ⅱ型胶原蛋白-透明质酸-硫酸软骨素的三维人工软骨支架，孔径为 (83.33±7.20) μm，孔隙率为86.63%±0.67%。研究人员普遍认为组织工程软骨支架的孔径应为 (60-200) μm，孔隙率应在70%-90%^[24-26]。因此，自制软骨支架符合上述条件，有利于支架内外营养物质的输送，对于支架内细胞的生长代谢以及软骨修复都有着重要意义。
本实验通过制备包裹生长因子TGF-β1具有缓释作用的壳聚糖微球，并将其整合到软骨支架上用以培养小鼠软骨细胞ATDC-5。MTT试验以及荧光染色试验结果充分证明该三维软骨支架适合ATDC-5细胞的生长增殖，并且壳聚糖微球对TGF-β1的缓释能够显著促进细胞的生长，随培养时间的延长，试验组细胞生长速率显著高于对照组，且在三维支架中分散均匀，培养14 d时，细胞密度增殖最大，较对照组高出近3倍。这为将来人工软骨支架更好地应用于医学领域提供了参考依据。至于该自制人工软骨支架在动物体内的生物相容性及慢性毒性等评价待进一步研究。

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