李新1,2, 张月超1,2, 刘芳华1
1. 中国科学院烟台海岸带研究所, 海岸带生物学与生物资源利用重点实验室, 山东 烟台 264003;
2. 中国科学院大学, 北京 100049
收稿日期：2019-09-18；修回日期：2019-11-08；网络出版日期：2020-01-21
基金项目：国家自然科学基金(91751112, 41573071);山东省自然科学****基金(JQ201608);"泰山****"青年专家计划(tsqn20161054)
*通信作者：刘芳华, Tel/Fax:+86-535-2109268;E-mail:fhliu@yic.ac.cn.
摘要：[目的] 探究以单环刺螠为代表的海洋环节动物肠道中电活性微生物的存在情况，并表征其生理学及电化学特性。[方法] 采用平板划线法、16S rRNA基因测序技术分离纯化菌株并进行菌株鉴定。利用扫描电镜表征菌株形态。高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）检测其无氧呼吸底物氧化及产物生成情况。通过菲啰嗪和甲醛肟显色法检测菌株的异化Fe（Ⅲ）和Mn（Ⅳ）还原能力。借助单室微生物燃料电池（single-chamber microbial fuel cells，SCMFCs）及循环伏安法检测菌株的电化学活性。[结果] 从单环刺螠肠道中成功分离得到了一株兼性厌氧菌，16S rRNA基因序列比对结果显示该菌株与Shewanella marisflavi的相似性达99.93%。扫描电镜结果显示其为杆状，长约2μm，宽度约为0.5μm。HPLC检测结果表明，该菌能以乳酸钠为电子供体，富马酸为电子受体进行无氧呼吸并伴随代谢产物乙酸钠和琥珀酸产生。菲啰嗪和甲醛肟显色法结果证实，该菌具有异化铁、锰还原能力。单室MFCs检测结果发现该菌的最大电流输出密度为146 mA/m2，循环伏安法检测结果显示该菌在0.14 V和-0.51 V位置处分别存在氧化峰和还原峰。[结论] 本研究结果证实以单环刺螠为代表的海洋环节动物肠道中存在以Shewanella marisflavi UU-3-2为代表的电活性微生物。表明电化学活性微生物在海洋环节动物肠道中广泛存在。
关键词：肠道微生物单环刺螠Shewanella marisflavi异化铁、锰还原电化学活性
Physiological characteristics of an intestinal electroactive strain Shewanella marisflavi UU-3-2 from Urechis unicinctus
Li Xin1,2, Zhang Yuechao1,2, Liu Fanghua1
1. Key Laboratory of Coastal Biology and Bioresource Utilization, Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, Shandong Province, China;
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Received: 18 September 2019; Revised: 8 November 2019; Published online: 21 January 2020
*Corresponding author: Fanghua Liu, Tel/Fax:+86-535-2109268;E-mail:fhliu@yic.ac.cn.
Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China(91751112, 41573071), by the Natural Science Foundation of Shandong Province for Distinguished Young Scholars(JQ201608) and by the Young Taishan Scholars Program of Shandong Province(tsqn20161054)
Abstract: [Objective] To explore the electroactive microorganism in the intestinal tract of marine annelids represented by Urechis unicinctus and characterizing its physiological and electrochemical properties. [Methods] The strain was isolated using plate scribing and identified by 16S rRNA gene sequencing. The morphology of the isolate was depicted by scanning electron microscope. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to analyze the metabolites. The quantifications of Fe(Ⅱ) and Mn(Ⅱ) reduction were carried out by ferrozine and formaldoxime assays, respectively. Single-chamber microbial fuel cells (SCMFC) were used to test the electrochemical activity by cyclic voltammetry. [Results] A facultative anaerobic bacterium, Shewanella marisflavi UU-3-2 (with the similarity of 99.93%), was successfully isolated which was a rod bacterium with the length about 2 μm and width about 0.5 μm. The metabolic analysis showed that this strain could use sodium lactate as an electron donor, fumarate as an electron acceptor for anaerobic respiration with acetate and succinate production. Ferrozine and formaldoxime assays illustrated that Fe(Ⅲ)/Mn(Ⅳ) in the Fe2O3/MnO2 were reduced. The maximum current density was 146 mA/m2, and the results of cyclic voltammetry revealed that the oxidation peak and reduction peak happened at 0.14 V and -0.51 V, respectively. [Conclusion] An electrochemical activity microbe, Shewanella marisflavi UU-3-2, was successfully isolated from marine animals represented by Urechis unicinctus, indicating the widespread existence of electrochemical activity microorganisms in marine annelids' intestine.
Keywords: Intestinal microbesUrechis unicinctusShewanella marisflavidissimilatory Fe(Ⅲ)/Mn(Ⅳ)-reductionelectrochemical activity
1987年，Lovley等分离得到一株具有电活性的金属还原地杆菌，命名为Geobacter metallireducens GS-15[1]。1988年，Myers和Nealson分离到一株能够利用MnO2作为电子受体进行厌氧呼吸的电活性希瓦氏菌，命名为Shewanella oneidensis MR-1[2]，由此开启了30多年的电活性微生物研究，以电活性微生物为基础的微生物胞外电子传递理论的研究也自此拉开序幕。微生物胞外电子传递(extracellular electron transfer，EET)是一种新型的微生物能量代谢方式，在厌氧条件下，微生物将胞内有机物氧化产生的电子经电子呼吸链传递给胞外电子受体。微生物胞外电子传递不仅参与多种元素(C、Fe和Mn等)的生物化学循环[3]，且在重金属迁移转化[4]、有机污染物降解和清洁能源生产[5]等领域展现出广阔的应用前景。
电活性微生物广泛分布于自然及人工环境中，如海洋沉积物、湿地沉积物、厌氧土壤和厌氧消化池等[6]。2012年Khan等[7]发现肠道厌氧菌Faecalibacterium prausnitzii能够以核黄素-硫醇为氧化还原介质进行电子传递，表明电活性微生物不仅存在于自然环境中，还存在于人类肠道中。已知肠道电活性微生物大多是致病菌和兼性厌氧菌，如普拉梭菌、粪肠球菌等[7-8]。在自然环境中电活性微生物能够以铁锰矿物为末端电子受体进行EET进而支持其生存所需的能量代谢过程，然而Light等[9]研究称由于肠道中缺乏大量的铁锰氧化物，因此存在于肠道中的食源致病性电活性微生物单增李斯特菌Listeria monocytogenes利用肠道生境中丰富的核黄素进行EET从而产生电流。Naradasu等[10]也从人类肠道中成功分离出Enterococcus avium和Klebsiella pneumoniae两种既能以乙酸盐和乳酸盐为电子供体进行EET又能结合葡萄糖发酵进行EET的电活性微生物。此外，Wang等[11]通过循环伏安法分析小鼠、大鼠及豚鼠肠道微生物群发现无论在体内还是体外都出现明显的催化峰，证实了肠道菌群中EET现象在哺乳动物中普遍存在。迄今为止，肠道电活性微生物的分离主要集中在人类及其他哺乳动物肠道中，关于海洋动物肠道电活性微生物的研究还很少。
海洋中生存着大约200万种动物[12]，海洋中所有的生物都与微生物保持相互作用的关系。在海洋长期的演化中，微生物与海洋生物形成了寄生、共生等关系，从而直接或间接参与了海洋生物的物质循环、能量流动[13]。单环刺螠(Urechis unicinctus)又名海肠，属于螠虫动物门螠纲无管螠目刺螠科，主要分布在黄渤海沿岸潮间带及潮下带[14]。单环刺螠营养成分丰富，其体壁肌中含有18种氨基酸(其总量占体壁肌干重的57.39%)，包括人体必需氨基酸及鲜味氨基酸，具有很高的营养价值和食用价值[15]。
本研究以海洋环节动物单环刺螠为例，通过对其肠道微生物的分离、纯化和鉴定获得了一株具有电化学活性的菌株Shewanella marisflavi UU-3-2并对其生理代谢和电化学特性进行了表征。本研究证实了海洋环节动物肠道中电活性微生物的存在，并为研究肠道电活性微生物的生理病理学研究提供了新的思路。
1 材料和方法 1.1 样品来源 本实验所用单环刺螠于2019年3月购买自烟台市莱山区烟大农贸市场，共买3尾通体呈淡粉色、体长约为20 cm、体重约为35 g的健康单环刺螠。购买后1 h内置于实验室无菌操作台进行快速肠道解剖。
1.2 富集培养 新鲜肠道剪碎后投掷于灭菌的海水LB培养基并利用抽真空装置抽换空气。具体操作为：借助抽滤装置将新鲜海水于0.22 μm滤膜过滤。用过滤后的海水配置LB培养基100 mL，并分装到40 mL体积的厌氧瓶中，每瓶20 mL。利用抽换气装置对每个厌氧瓶抽真空1 min，充氮气0.5 min，并重复操作7次，将厌氧瓶中的空气替换为高纯氮气(N2含量99.99%)，用铝盖密封厌氧瓶口后于121 ℃灭菌20 min。将投加肠道样品后的除氧西林瓶置于30 ℃恒温孵育室中培养过夜。将过夜后的富集培养物转接1 mL到新的40 mL体系无菌厌氧海水LB培养基中过夜培养。本实验所用天然海水采自烟台大学东门海域(北纬37°28′25″东经121°26′24″)。
1.3 细菌的分离与鉴定 涂布：在厌氧操作箱中用一次性无菌注射器抽取约0.05 mL的肠道富集培养物滴在固体海水LB培养基上，用灭菌的涂布棒均匀涂布，待菌液自然晾干后，倒置于厌氧操作箱中，30 ℃恒温培养。平板划线：在厌氧操作箱中用灭菌的接种环挑取涂布平板上长出的单菌落(挑选不同颜色、大小、形态、透明度的单菌落)进行平板划线，后续重复平板划线以纯化单菌落。将纯化后的不同单菌落接入灭菌的海水LB培养基培养。菌液PCR：取2 μL菌液作为DNA模板进行PCR扩增。PCR反应体系(50 μL)为：10×Taq buffer 5 μL，dNTPs (2.5 mol/L) 4 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.25 μL。扩增引物为细菌16S rRNA基因通用引物Ba27F (5′-GAGTTTGMTCCTGGCTCAG-3′) 2 μL，Ba1492R (5′-ACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′) 2 μL，无菌去离子水34.75 μL。PCR反应程序为：95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1.5 min，循环30次。16S rRNA基因序列分析：将扩增产物送往英潍捷基(上海)贸易有限公司进行16S rRNA测序分析，将序列拼接后提交到NCBI数据库中，序列号为MN421995。利用NCBI网站的BLAST功能对所测序列进行相似性比对分析，确定亲缘关系，再利用MEGA 7.0构建邻接法(Neighbor-Joining)进行1000次步长计算，并构建系统发育树。
1.4 菌株的形态观察 扫描电子显微镜观察菌株形态，电镜样品处理方法为：取2 mL对数期菌液，6000 r/min离心4 min，弃上清；加入0.1 mol/L PBS缓冲液2 mL进行清洗，吹打后6000 r/min离心4 min，重复清洗5遍；加2.5%戊二醛1 mL吹打后于4 ℃冰箱过夜；取过夜后的菌液，6000 r/min离心4 min，弃上清；依次加入30%、50%、70%、90%的乙醇进行梯度脱水，每次脱水10 min后于8000 r/min离心4 min；最后用100%乙醇脱水2次，每次10 min，最后一次脱水结束后，吸取0.1 mL菌液滴加到洁净盖玻片上，放于超净工作台吹干；样品充分干燥后，用扫描电子显微镜观察菌株形态。
1.5 代谢分析 由于LB培养基的成分比较复杂，营养过于丰富，所以将测序后的菌液转接到新的改良培养基LFM中[16]：30 mmol/L乳酸钠，9 mmol /L硫酸铵，5.7 mmol/L磷酸氢二钾三水，3.3 mmol/L磷酸二氢钾，2 mmol/L碳酸氢钠，30 mmol/L HEPES，0.2 g/L胰蛋白，30 mmol/L富马酸，1.5 g/L氯化钠，同时添加10 mL/L的氨基酸溶液和10 mL/L的微量矿物质溶液；调节pH 7.2±0.2。配置500 mL的LFM培养基，分装到40 mL体积的厌氧瓶中，每瓶20 mL，利用抽换气装置将厌氧瓶中的空气替换为高纯氮气(N2含量99.99%)，用铝盖密封厌氧瓶口后121 ℃灭菌20 min。将菌株活化传代3次，取对数期菌液接入LFM培养基(5%接种量)，间隔3 h取1 mL样品，共取7次，取好的样品经0.22 μm的滤膜过滤后，用高效液相色谱仪检测。检测条件为：示差检测器(RID)，设置温度为55 ℃；5 mmol/L硫酸为流动相，设置流速为0.6 mL/min；HPLC-Hi-Plex H为检测柱，规格为7.7 mm×300 mm，设置柱温为60 ℃。
1.6 生长及异化铁、锰还原能力检测
1.6.1 生长曲线绘制: 取冻存于超低温冰箱(-80 ℃)中的菌株接种于LFM培养基中并活化三代后接种(5%接种量)至新鲜培养基中，30 ℃培养，每隔3 h取样，将紫外分光光度计波长设置为600 nm，测定菌液吸光度值。
1.6.2 异化铁还原能力检测: 本研究所用α型Fe2O3粒径为30 nm，纯度为99.5%，采购自阿拉丁生化科技股份有限公司。将Fe2O3配成母液，添加到LFM培养基中至终浓度分别为10 mmol/L和20 mmol/L。将对数期的菌液以5%接种量转接至含Fe2O3的培养基中，30 ℃培养，每隔8 h取样，对照组为不接菌的10 mmol/L Fe2O3培养基。用菲啰嗪显色法[17]检测溶液中的Fe(Ⅱ)含量。具体方法为：取0.1 mL样品加入0.9 mL浓度为0.5 mol/L的盐酸溶液，黑暗条件下静置24 h后，8000 r/min离心5 min，取上清100 μL加入到1.9 mL含0.1%菲啰嗪的200 mmol/L的HEPES缓冲液中，室温反应5 min后，在562 nm波长下用紫外分光光度计测定吸光度并根据标准曲线换算Fe(Ⅱ)浓度。
1.6.3 异化锰还原能力检测: 本实验所用MnO2粒径为50 nm，纯度为99.9%，采购自北京德科岛金科技有限公司。将MnO2配成母液，添加到LFM培养基中至终浓度分别为10 mmol/L和20 mmol/L。将生长至对数期的菌液转接至含MnO2的培养基中，30 ℃培养，每隔8 h取样，对照组为不接菌的10 mmol/L MnO2培养基。用甲醛肟法[18]检测溶液中的Mn(Ⅱ)含量。具体方法为：称取4 g盐酸羟胺加入80 mL蒸馏水中溶解，向溶液中加2 mL甲醛，加蒸馏水定容至100 mL，最后将上述溶液与40 mL氨水混合配置成甲醛肟溶液。取0.5 mL样品5000 r/min离心3 min，取0.1 mL上清液加入含1.9 mL甲醛肟的离心管中，室温反应5 min后，在450 nm波长下用紫外分光光度计测定吸光度并根据标准曲线换算Mn(Ⅱ)浓度。
1.7 电化学活性检测
1.7.1 单室微生物燃料电池: 构建单室微生物燃料电池(single-chamber microbial fuel cells，SCMFCs)，在电池中插入钛丝连接的碳布(20 mm×20 mm× 0.32 mm)作为工作电极和对电极，以饱和甘汞电极作为参比电极。在厌氧操作箱中将钛丝连接的两碳布电极穿过丁基橡胶塞，旋上空心螺纹盖。将组装好的单室燃料电池于121 ℃灭菌20 min。在厌氧操作箱中将饱和甘汞电极插入灭菌后的电池。向洁净的灭菌单室电池中接种10%菌液和新鲜培养基，以不接菌的空白培养基作为对照组。除氧后，将电池连入多通道恒电位仪(上海辰华CHI 1030C)检测菌株的电化学信号。参数设置为：0.4 V电压，5 s/次检测电流，灵敏度为1.0×10-3 A/V，每个通道独立运行。
1.7.2 循环伏安扫描: 采用循环伏安扫描法(cyclic voltammetry)检测单室燃料电池中产电体系的氧化还原特性。将单室电池从CHI 1030C电化学工作站转移到CHI 660E电化学工作站。设置参数为：起始电压1.0 V，最终电压-0.8 V，最高电压1.0 V，最低电压-1.0 V，扫速为50 mV/s，扫描循环3次，0.001 s/次记录数据，灵敏度为1.0×10-3 A/V。
2 结果和分析 2.1 菌株16S rRNA序列分析及系统发育树的构建 测定菌株的16S rRNA基因序列并进行序列比对。测定的基因片段长度为1424 bp；序列比对结果显示该菌与菌株Shewanella marisflavi SDRB-Na1 (MG456898.1)具有99.93%的相似性。根据比对结果选取与该菌株相似性较高的序列，在MEGA 7.0上用邻位联结法(Neighbor-Joining)构建系统发育树(图 1)，结果表明该菌的16S rDNA与Shewanella marisflavi SDRB-Na1 (MG456898.1)处于系统发育树的同一分支，同源性最高，亲缘关系最接近。因此鉴定结果初步确认该菌株为Shewanella marisflavi，并命名为Shewanella marisflavi UU-3-2。
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| 图 1 基于16S rRNA基因构建的菌株Shewanella marisflavi UU-3-2系统发育树 Figure 1 Neighbor-Joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene fragments of strain Shewanella marisflavi UU-3-2 and reference species. |
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2.2 形态观察 菌株平板划线后过夜培养(30 ℃)，在LB固体平板上观察到单菌落为不规则的圆形，边缘较为整齐且菌落表面光滑呈现淡黄色不透明状(图 2-A)。扫描电镜观察结果显示，该菌呈短杆状，长度约为1.5-2.5 μm，宽度约为0.5 μm，有端生鞭毛(图 2-B，箭头所示)。
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| 图 2 Shewanella marisflavi UU-3-2的单菌落形态(A)及扫描电镜图像(B) Figure 2 The images of signal colony (A) and scanning electron microscope (B) of Shewanella marisflavi UU-3-2. |
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2.3 代谢分析 液相色谱检测Shewanella marisflavi UU-3-2的无氧呼吸产物，结果显示随着电子供体乳酸钠、电子受体富马酸的消耗，无氧呼吸产物乙酸钠、琥珀酸的量逐渐积累。乳酸钠和富马酸的初始浓度约为30 mmol/L，生长至第12 h时，各物质的浓度基本不再变化，底物消耗和产物生成达到平衡状态。18 h时，乳酸钠消耗量约为18 mmol/L，富马酸消耗量约为27 mmol/L，富马酸几乎全部消耗完，乳酸钠消耗量约为初始浓度的1/2；同时，产物乙酸钠生成量约为11 mmol/L，琥珀酸生成量约为25 mmol/L (图 3)。底物乳酸钠的消耗量大于产物乙酸钠的生成量，表明乳酸钠不能被Shewanella marisflavi UU-3-2完全氧化变成乙酸钠，在此过程中还有其他产物的生成。
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| 图 3 电子供体乳酸钠消耗量及乙酸钠生成量(A)、电子受体富马酸的消耗量及琥珀酸的生成量(B) Figure 3 Electron donor sodium lactate consumption and sodium acetate production (A), electron acceptor fumaric acid consumption and succinic acid production (B). |
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2.4 异化铁、锰还原能力表征 生长曲线显示(图 4-A)，Shewanella marisflavi UU-3-2在液体培养基中经历小于2 h的延滞期后随即进入指数期并持续约20 h，随后到达稳定期，OD600最大值为0.4。对菌株的异化铁、锰还原能力检测结果(图 4-B、C)显示，与不含Fe2O3/MnO2的对照组相比，实验组中Fe(Ⅱ)/Mn(Ⅱ)的含量都随着时间的增加而逐渐积累；且不同浓度的Fe2O3/MnO2中Fe(Ⅲ)/Mn(Ⅳ)的还原量不同，随着Fe2O3/MnO2浓度的增加Fe(Ⅱ)/Mn(Ⅱ)积累量也增加。结合生长曲线可知，前24 h菌株呈指数型增长，Fe(Ⅱ)/Mn(Ⅱ)积累量迅速升高；24 h之后，菌株生长进入稳定期，Fe(Ⅲ)/Mn(Ⅳ)还原速率减慢；以上结果说明Shewanella marisflavi UU-3-2不仅可以还原Fe2O3/MnO2中的Fe(Ⅲ)/Mn(Ⅳ)，且还原能力随着Fe2O3/MnO2浓度的升高而增加，同时其还原速率与菌株的生长状态有关。相比还原Fe2O3中的Fe(Ⅲ)，Shewanella marisflavi UU-3-2更倾向于还原MnO2中的Mn(Ⅳ)。可能的原因是Mn4+/Mn2+的氧化还原电势(0.8 V)比Fe3+/Fe2+的氧化还原电势(0.2 V)更高，因此MnO2更易被Shewanella marisflavi UU-3-2还原。综上所述，Shewanella marisflavi UU-3-2能够还原Fe2O3和MnO2，且其异化铁、锰还原能力随Fe(Ⅲ)/Mn(Ⅳ)添加浓度的增加而增加。表明Shewanella marisflavi UU-3-2是一株同时具备异化铁、锰还原能力的金属还原微生物。
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| 图 4 Shewanella marisflavi UU-3-2生长曲线(A)及Fe(Ⅱ)(B)和Mn(Ⅱ)(C)物质的量变化曲线 Figure 4 Dynamics of growth curve(A), Fe(Ⅱ)(B) and Mn(Ⅱ)(C) concentration. |
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2.5 电化学活性测试 构建单室微生物燃料电池并利用循环伏安扫描法对Shewanella marisflavi UU-3-2的电化学活性进行检测。单室燃料电池检测结果(图 5-A)显示与不接菌的对照组相比，Shewanella marisflavi UU-3-2实验组能够产生电流，且电流的上升速度很快，在10 h之内即可达到最大电流密度146 mA/m2，随后电流呈现缓慢降低的趋势，整个产电过程可持续近60 h，表明Shewanella marisflavi UU-3-2的产电时间较长。这与Shewanella marisflavi UU-3-2的生长情况相符，在对数生长期时电活性最高，稳定期后电流随之下降。60 h后燃料电池检测结束，循环伏安扫描检测该体系的氧化还原特征。CV扫描结果显示(图 5-B)，该体系在-0.51 V位置有一处明显的还原峰，在0.14 V位置有一处平缓的氧化峰，表明体系中存在氧化还原物质。该结果进一步说明Shewanella marisflavi UU-3-2具有电化学活性。
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| 图 5 Shewanella marisflavi UU-3-2的电化学活性(A)和氧化还原特征(B) Figure 5 The electrochemical activity(A) and redox characters(B) of Shewanella marisflavi UU-3-2. |
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3 讨论 希瓦氏菌能将有机物质的分解与环境中末端电子受体(如铁锰氧化物、腐殖酸等)的还原相耦合，是C、N、Fe和Mn等生物地球化学循环过程中的重要驱动者之一，且在环境污染修复和微生物燃料电池等领域具有巨大的应用潜势[19]。自1988年第一株能够以MnO2为末端电子受体进行厌氧呼吸的希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR-1被分离以来，目前希瓦氏菌属已经成功分离出69种(参考List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature(LPSN)http://www.bacterio.net)。希瓦氏菌分布广泛，如海水的好氧区或厌氧区[20]、海洋沉积物[21]、原油管道[22]等。虽然近年来陆续从鱼类、对虾等海洋生物的肠道中分离得到不同种的希瓦氏菌[23-26]，但相比起土壤、沉积物和污泥等环境，关于海洋生物肠道中希瓦式菌电活性特征的报道相对较少。本研究从海洋生物单环刺螠肠道中成功分离得到一株电活性希瓦氏菌，经16S rRNA基因测序比对后，鉴定为Shewanella marisflavi UU-3-2。
希瓦氏菌Shewanella marisflavi UU-3-2代谢物分析结果表明，该菌能以乳酸钠作为电子供体，富马酸为电子受体，产生代谢物乙酸钠和琥珀酸。以乳酸钠为电子供体时，希瓦氏菌不能将乳酸盐完全氧化而是生成中间代谢产物乙酸盐[27]。根据Scott和Nealson提出的Shewanella oneidensi MR-1乳酸盐中心代谢途径可知，乳酸盐首先转化为丙酮酸，随后丙酮酸大部分转化为乙酰辅酶A，乙酰辅酶A可以进入三羧酸循环(TCA)，合成生物质成分(例如氨基酸)，或者可逆地转化为乙酸盐同时伴随三磷酸腺苷(ATP)的生成[28]。此外，随着乙酸逐渐生成，乙酸与乙酰辅酶A相互转化时会与乳酸竞争CoA基团，导致乳酸的利用率降低，且乙酸浓度升高会导致菌株生长速度变慢[29-30]。本实验中以富马酸为电子受体时琥珀酸的转化量为92.6%，与Tang等[31]报道的通过同位素标记检测到的富马酸还原为琥珀酸的转化量为95%相一致，该过程在富马酸还原酶的催化作用下，富马酸中的2个电子转移到琥珀酸，从而将周质中的富马酸还原为琥珀酸[32]。
Shewanella marisflavi UU-3-2异化铁、锰还原检测结果表明，该菌不仅具备将不溶性Fe2O3和MnO2固体中的Fe(Ⅲ)和Mn(Ⅳ)分别还原为Fe(Ⅱ)和Mn(Ⅱ)的异化铁、锰还原能力，且电活性检测结果发现该菌具有电化学活性。随着Fe2O3和MnO2浓度增加，Fe(Ⅱ)和Mn(Ⅱ)生成量增加，然而其最大还原率有限(Fe2O3、MnO2还原率分别为0.65%和1.5%)。在富马酸浓度为30 mmol/L的LFM培养基中生长时，菌株优先还原可溶性的电子受体，使不溶性铁、锰还原量降低。Wang等[33]利用代谢组学分析表明，电子受体的比例影响Shewanella oneidensis还原偶氮染料的能力，当菌株在电子受体(富马酸盐)浓度限制条件下生长时，还原染料的能力的显著增加；而随着电子受体(富马酸盐)浓度升高，还原偶氮染料的能力降低。此外，细胞数量也影响其还原量，Shewanella marisflavi UU-3-2在稳定期时最大OD600值为0.4(图 4)，低于Tang等[30]报道的Shewanella oneidensis生长曲线检测结果0.8-0.9；Myers和Nealson证明Shewanella oneidensis对MnO2的还原量与细胞数量成正比，高细胞浓度下MnO2的还原量增大[2]。
目前已知肠道中分离的电活性微生物的电流密度约为5300 mA/m2[34]，本实验利用单室微生物燃料电池测得Shewanella marisflavi UU-3-2的最大电流密度为146 mA/m2；已知分离自环境中的电活性微生物的最大电流密度约为9900 mA/m2[35]，而Shewanella oneidensis DSP10的最大电流密度约为6500 mA/m2[36]。相比自然环境中的电活性微生物，肠道电活性微生物的产电能力相对较弱。研究表明，在燃料电池中，电子供体类型及其浓度、接种菌液中的细胞浓度以及溶液导电率都会影响产电的大小[35-37]。
Shewanella marisflavi UU-3-2具有胞外电子传递能力，不仅可以利用铁、锰氧化物作为电子受体，还可以在微生物燃料电池中以碳布电极作为电子受体，从而产生电流。目前已知能进行胞外电子传递的电活性微生物大多分离于自然环境，对肠道电活性微生物(尤其是海洋中动物肠道电活性微生物)的分离及其胞外电子传递机制的研究还处于起始阶段。以地杆菌属(Geobacter)和希瓦氏菌属(Shewanella)为模式菌的研究结果表明，电活性微生物的胞外电子传递机制的主要方式是以导电纤毛和细胞色素为代表的直接接触[38]，以及以核黄素、醌酮等为介体的间接传递方式[39]。Pankratova等[8]发现革兰氏阳性乳酸菌粪肠球菌(Enterococcus faecalis)能够直接或间接地将发酵代谢过程中产生的电子转移到电极上，并能够在去甲基甲喹酮的参与下进行胞外电子传递，且细胞色素bd的参与会使EET过程减弱。Khan等[7]研究发现在好氧-厌氧界面，兼性厌氧菌普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)能够分泌电子穿梭体核黄素和硫醇，且当核黄素加入到燃料电池阳极室后可快速产生电流。除此之外，Light等[9]发现病原性革兰氏阳性菌单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)同样利用基于核黄素的胞外电子传递机制将电子传递给Fe(Ⅲ)或电极。在希瓦氏菌中，细胞色素和核黄素是其参与EET的主要方式，根据循环伏安扫描结果可知，接种Shewanella marisflavi UU-3-2的电化学体系中存在氧化还原介质，在0.14 V存在氧化峰，这与已报道的希瓦式菌Shewanella oneidensis外膜细胞色素(MtrC和OmcA)的标准电位0.0-0.1 V基本一致[40-41]；此外在-0.51 V存在还原峰，与Roy等[42]报道的检测Shewanella oneidensis中核黄素的位置-0.45 V较为接近。以上实验结果暗示，Shewanella marisflavi UU-3-2可以分泌电子穿梭体核黄素。
本研究从海洋环节动物单环刺螠肠道中分离得到了一株同时具备异化铁、锰还原能力的电活性希瓦氏菌Shewanella marisflavi UU-3-2。该菌的分离丰富了海洋环节动物肠道电活性微生物的研究，为了解肠道电活性微生物的致病性控制及其对宿主健康的影响提供了新的视角，同时对揭示胞外电子传递在生物肠道生境中发挥作用的机制有重要的参考价值。
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