李磊
, 李福春, 刘璐, 张宠宏, 吕杰杰 南京农业大学资源与环境科学学院, 江苏 南京 210095
收稿日期：2016-07-28；修回日期：2016-09-28；网络出版日期：2016-12-06
基金项目：国家自然科学基金（41673083，41172308）；中国科学院黄土与第四纪地质国家重点实验室开放课题（SKLLQG1309，SKLLQG1511）；中国科学院知识创新工程重大项目（KZZD-EW-04-02）
*通信作者：李福春, Tel:+86-25-84395014;E-mail:fchli@njau.edu.cn
摘要： [目的]为了探讨细菌对碳酸盐矿物种类和形态的影响。[方法]本文利用丛毛单胞菌HJ-1菌株进行了持续50 d的培养实验。在实验过程中，对细菌数量、沉淀物重量、培养液中Ca2+和Mg2+浓度等进行了动态监测。利用扫描电子显微镜对矿物形态进行了观察，并利用X-射线衍射仪对矿物成分进行测定。[结果]丛毛单胞菌HJ-1菌株具有显著的诱导碳酸盐矿物沉淀的能力，碳酸盐矿物的重量随着培养时间的延长而逐渐增加。X-射线衍射结果表明，形成的碳酸盐沉淀主要由文石和高镁方解石组成，其中文石的最高含量达86%。上述矿物在形态上复杂多样，主要有杆状、柱状、哑铃形、球状和板状以及不规则状和鳞片状集合体。[结论]通常，在Mg/Ca≤2并且有微生物参与的条件下极少形成文石。本文在Mg/Ca为2，不含碳酸根离子的培养基中培养HJ-1菌株的过程中发现了文石。作者认为，低Mg/Ca条件下文石的形成主要与HJ-1菌株分泌较多的胞外多糖有关。
关键词： 丛毛单胞菌 文石 高镁方解石 胞外多糖 生物矿化
Curvibacter sp. strain HJ-1 induced the formation of aragonite under the condition of low Mg/Ca ratio
Lei Li
, Fuchun Li, Lu Liu, Chonghong Zhang, Jiejie Lü College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu Province, China
Received 28 July 2016; Revised 28 September 2016; Published online 06 December 2016
*Corresponding author: Fuchun Li, Tel:+86-25-84395014;E-mail:fchli@njau.edu.cn
Supported by the National Natural Science Foundation of China (41673083, 41172308), by the Open Project of the State Key Laboratory of Loess and Quaternary Geology (SKLLQG1309, SKLLQG1511) and by the Knowledge Innovation Project of the Chinese Academy of Sciences (KZZD-EW-04-02)
Abstract: [Objective]To study the effects of bacteria on the species and morphology of carbonate minerals.[Methods]We conducted a series of cultural experiments in the medium with initial Mg/Ca ratio of 2 but without carbonate ion using Curvibacter sp. strain HJ-1 for 50 days. During the cultivation, bacterial density, precipitate quantities, calcium and magnesium concentration were determined. The morphologies of precipitated carbonates were observed using scanning electron microscopy, and mineral species of carbonate were determined by X-ray diffraction.[Results]Strain HJ-1 could induce the precipitation of carbonate minerals, the quality of carbonate gradually increased with the incubation time. XRD patterns showed that the mineral precipitates consisted of high-Mg calcite and aragonite. The percentage of aragonite in the precipitates was up to 86%. The morphology of carbonate minerals was multiform, including rod-shaped, dumbbell-shaped, spherical, tabular, as well as irregular and flake. [Conclusions] The formation of aragonite under the condition of low Mg/Ca ratio has a close correlation with extracellular polysaccharide secreted by Curvibacter sp. strain HJ-1.
Key words: Curvibacter sp. Aragonite High-Mg calcite Extracellular polysaccharide Biomineralization
目前已发现有80余种生物成因的矿物 (生物矿物)，其中碳酸钙矿物的分布最为广泛[1]。碳酸钙矿物是浅海沉积物和大陆表生环境中最常见的矿物系列之一。自然界中最常见的生物成因碳酸钙矿物是方解石和文石[2]。此外，生物成因的球霰石也陆续被发现[3-4]。方解石为热力学稳定相，是碳酸钙最常见的矿物相。文石为热力学亚稳定相，而球霰石为不稳定相，受动力学因素控制。在一定条件下，文石和球霰石会迅速向方解石转变[5]。
自然界中的方解石或多或少都含镁。方解石中镁的含量一般以MgCO3的摩尔百分比计，通常以4% (摩尔比) 为界将方解石分为低镁方解石 (LMC) 和高镁方解石 (HMC)[6]。LMC为热力学稳定相，而HMC与文石一样为亚稳定相。HMC和文石在成岩过程中极易转变为LMC。因此，古老地层中的钙镁碳酸盐矿物主要以LMC、白云石和菱镁矿等形式产出[7]。在现代浅海沉积物中，碳酸盐矿物以文石为主、以HMC为次[7-8]，而在湖泊和河流的现代碳酸盐沉积物中，最主要的碳酸盐矿物却是LMC[7]。这些有趣的现象吸引了许多科研工作者不断地探索方解石、文石等矿物在水溶液中沉淀和相变的机理。对碳酸钙矿物在水溶液中的溶解和沉淀等化学行为的研究，可为了解海洋CO2体系、海相和陆相碳酸钙的成因等提供有用的信息[9]。在显生宙，碳酸盐岩约占沉积岩总量的20%左右[10]。现已认识到，世界上60%左右的油气储量与碳酸盐岩储层有关[10]。因此，研究碳酸盐矿物的形成和转变过程对于理解碳酸盐成岩作用、油气形成和储存机制以及全球碳循环也具有十分重要的意义。
微生物是地球表层系统中最为活跃的成员之一，在该系统中几乎无处不在。因此，碳酸钙矿物在自然条件下的溶解和沉淀过程在一定程度上都受到微生物及其分泌物的影响。研究表明，微生物能够通过自身的新陈代谢活动影响细胞周围微环境的pH值并为矿物的形成提供成核模板[11]。近年来，微生物参与的碳酸盐矿化过程的研究日益增多。Guo等[11]在培养一株胶质芽孢杆菌的过程中发现沉淀物中存在HMC和少量的文石。费正彬等[12]根据实验结果推测，耐辐射奇球菌细胞表面的氨基具有抑制方解石晶体生长的作用而促进了文石的形成。以上实例说明，微生物和二价金属阳离子均有可能对碳酸盐矿物的种类产生显著的影响。
从目前的研究现状来看，微生物对碳酸盐矿物种类的调控机制还远未阐述清楚。但从前人的研究报道中可见，微生物分泌的胞外多糖 (EPS) 有可能影响碳酸盐矿物的沉淀过程：在电子显微镜下观察到大量的纳米级球状晶体生成于EPS之中[13]；EPS含量越高越有利于方解石和球霰石的形成[14]；碳酸盐沉淀速率与EPS含量呈显著的正相关关系[2]。
对海洋碳酸盐矿物沉淀过程的研究结果表明，Mg/Ca (摩尔比) 是影响碳酸盐矿物种类的主要因素之一[15-16]。当Mg/Ca < 2时，形成LMC相；当Mg/Ca≥2时，形成由HMC和文石构成的混合物[15]。可见，在无微生物参与的条件下，决定矿物组合的重要Mg/Ca节点位于2附近。为了探讨细菌对碳酸盐矿物相的影响，本文选择在Mg/Ca为2的条件下，在不含碳酸根离子的培养基中对分泌EPS较多的丛毛单胞菌HJ-1菌株进行培养实验，并试图探究细菌对碳酸盐矿物种类的影响及其机制。
1 材料和方法 1.1 培养基 实验所用培养基 (M2培养基) 主要成分：9.0 g单水乙酸钙，21.4 g四水乙酸镁，10.0 g胰蛋白胨和1.0 L去离子水。培养基的Mg/Ca摩尔比值为2。利用0.5 mol/L的NaOH溶液和盐酸将上述培养基的pH值调至8.0，在121条件下灭菌20 min。在液体培养基中加入2%的琼脂即得到固体培养基。
1.2 菌株的分离、筛选和鉴定 在无菌条件下，将少许取自南京农业大学牌楼实验田的土壤 (黄棕壤) 加入无菌水中制成菌悬液，稀释并取0.1 mL涂布于平板上，然后将平板倒置于30培养箱中进行恒温培养。3 d后，挑取平板上形态不同的菌落并分别进行划线，经多次划线纯化后得到若干菌株并分别编号。其中，HJ-1菌株的培养液最为粘稠，作者估计其分泌的EPS可能最多，因而被选为实验用菌株。HJ-1菌株在固体培养基上形成透明隆起的菌落，表面光滑，边缘整齐，革兰氏染色阴性反应。细菌细胞呈杆状，直径约0.5–1.0 μm，长度约1.5–2.0 μm，未见芽孢和鞭毛 (图 1)。根据16S rRNA基因序列构建的HJ-1菌株的系统发育树 (图 2) 及相似性分析结果表明，HJ-1菌株与Curvibacter lanceolatus(AB 681931) 相似度为99.6%。可以认为，HJ-1菌株为丛毛单胞菌属 (Curvibacter) 的lanceolatus种。为慎重起见，本文暂称之为丛毛单胞菌属 (Curvibacter sp.)。我们为该菌株在NCBI上申请的登录号为KX 815269。
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| 图 1. HJ-1菌株细胞的TEM照片 Figure 1. TEM image of the strain HJ-1. |
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| 图 2. 基于16S rRNA基因序列构建的HJ-1菌株与相关菌株的系统发育树 Figure 2. Phylogenetic tree of strain HJ-1 based on 16S rRNA gene sequence comparison with related genera. Numbers in parentheses represent the sequences' accession number in GenBank. The number at each branch point is the percentage supported by bootstrap. Bar, 0.5% sequence divergence. |
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1.3 实验方法 挑取单菌落接种于M2液体培养基中，在30条件下在摇床内以180 r/min转数培养24 h，获得种子液。在装有90 mL液体培养基的若干三角瓶中分别加入10 mL的种子液制成培养液 (初始的细菌数量约3.4×107CFU/mL)。将上述三角瓶置于恒温培养箱中，在30条件下静置培养。每隔一定时间 (在第6天之前为1 d，之后间隔逐渐增大，分别为2、3、5、7 d) 结束一个实验，直至第50天。每个实验设有3个重复。实验结束后用手充分摇动三角瓶 (以尽量克服菌膜对所测细菌数量的影响)，然后用离心法将培养液与固相分开，并分别进行相关指标的测定。以无菌水代替种子液作为对照实验 (CK)。
1.4 测定方法 采用稀释平板法测定了细菌数量。具体方法为：将培养液摇匀后分成4份，分别稀释为原浓度的10–4、10–5、10–6和10–7；分别取稀释后的菌液0.1 mL，涂布于M2固体培养基上，并将其倒置于30的恒温培养箱中进行培养；培养2 d后记录平板上的细菌菌落，并换算成细菌数量。使用万分之一电子天平称量沉淀物的质量。使用pHS-3C型pH计和DDB-303A电导率仪分别测定培养液的pH值和电导率。利用醇析的方法提取EPS[17]，以硫酸-蒽酮混合液为溶剂、利用UV-1100型分光光度计在625 nm波长处测定吸光度并计算EPS含量[18]。利用Thermo-6000电感耦合等离子发射光谱仪 (ICP-OES) 测定培养液中Ca2+和Mg2+浓度。利用H-7650型透射电子显微镜 (TEM) 观察菌体形态。制样方法：将平板上的单菌落悬浮于双蒸水中，将悬浮液滴于铜网上之后加磷钨酸 (PTA) 负染10 s，待样品自然晾干后上机观察。矿物形态的观察在S-3000N型扫描电子显微镜 (SEM) 上完成。制样方法：将固相产物用蒸馏水清洗3次，用纯酒精浸泡后滴加于样品台上，自然风干后喷上约8 nm厚的金膜。利用理学Dmax-B型X-射线衍射仪 (XRD) 测定固相产物的矿物成分。制样方法为：用滴管将沉淀物涂在载玻片上，自然风干。测定条件：Cu靶，Kα，管压30 kV，管流20 mA，扫描速度2/min，步长0.02，测定范围10–60。
2 结果和分析 2.1 细菌数量的变化 HJ-1菌株在培养实验过程中生长良好，其细菌数量总体上呈现先升高后降低的趋势，第2天达到最大值，此时的细菌数量约为2.82×108CFU/mL。此后，随着培养时间的延长，细菌数量逐渐降低，第23天以后趋于稳定 (图 3)。
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| 图 3. 细菌数量的动态变化 Figure 3. Temporal change of the bacterial density. |
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2.2 培养液pH值和电导率的动态变化 在培养实验过程中，培养液pH值变化于7.23–9.11之间。总体趋势是：在初始阶段呈现小幅度降低，之后逐渐升高 (图 4-a)。培养液的电导率 (EC) 在第10天之前以较小的幅度波动 (无明显规律)，在第10–28天以较快的速率降低，此后缓慢降低直至第50天 (实验结束) (图 4-b)。CK实验的pH值和电导率均未发生明显的变化。
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| 图 4. 培养液pH值 (A) 和电导率 (B) 的动态变化 Figure 4. Temporal changes of the pH value (A) and electronic conductivity (B) in the medium. |
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2.3 Ca2+和Mg2+浓度及Mg/Ca的动态变化 培养液中Ca2+和Mg2+浓度均随着时间的延长而不断降低。第10天之前，Ca2+和Mg2+浓度降低较快，第10天以后降低较慢。CK的Ca2+和Mg2+浓度则基本上没有变化 (图 5-a)。培养液的Mg/Ca在第8天之前有较小的升降波动，之后逐渐升高的趋势十分明显。第33天达到最大值 (2.41)，远大于初始Mg/Ca (图 5-b)。
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| 图 5. 培养液中Ca2+和Mg2+浓度及Mg/Ca的动态变化 Figure 5. Temporal changes of the Ca2+, Mg2+ concentration (a) and the Mg/Ca ratio (b) in the medium. |
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2.4 胞外多糖含量的动态变化 在实验过程中，HJ-1菌株分泌的EPS逐渐增多，第23天以后不再增多。培养液中EPS含量在第4天时达到最大值 (2544.73 mg/L) (图 6)。
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| 图 6. 培养液中胞外多糖含量的动态变化 Figure 6. Temporal change of the EPS content in the medium. |
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2.5 沉淀物总量及其中碳酸盐重量的动态变化 在HJ-1菌株作用下，沉淀物的重量随着培养时间的延长而逐渐增加，第3天之后的增加尤为明显。为了解沉淀物中碳酸盐所占的比例，作者利用浓度为30%的双氧水对沉淀物进行了处理 (至不冒泡为止)。自然风干后测定反应残余物重量。反应残余物的重量可以大体上代表碳酸盐的重量，而与双氧水反应过程中被消耗的部分可以大体上代表死亡的细菌细胞以及细菌分泌物的沉淀部分。从图 7可见，第6天之前碳酸盐沉淀微乎其微。从第6天开始，碳酸盐沉淀随着培养时间的延长而逐渐增多。从图 7还可以看出，有机物质沉淀量仅在13–56 mg的微小范围内波动 (平均35 mg)。总体上来看，中-晚阶段的有机物质沉淀量低于早阶段。其原因可能有三：(1) 有机物质组成可能随着培养时间的延长变得越来越复杂，这使双氧水的氧化降解效果降低，导致出现了有机物质减少的“假象”；(2) 在中-晚阶段，矿物沉淀的速率较快，它们可能包裹了较多的有机物质；(3) 在中-晚阶段，细菌细胞及其分泌物发生降解。在CK实验中未收集到沉淀物。上述结果充分地说明，HJ-1菌株具有促进碳酸盐矿物形成的能力。
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| 图 7. 碳酸盐和有机物质质量的柱状图 Figure 7. Histograms of the quality of carbonate and organic substances. |
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2.6 矿物种类 XRD测定结果表明，第8天之前的沉淀物未显示出明显的衍射峰，从第8天开始直至实验结束 (第50天)，沉淀物的XRD图谱中均出现了d值分别为0.302、0.209、0.186 nm的衍射峰，这说明HJ-1菌株诱导形成了方解石。此外，上述XRD图谱中还存在文石的3个最强衍射峰，其d值分别为0.339、0.326、0.187 nm (图 8)。可见，在本实验的中-晚阶段，沉淀的碳酸盐矿物均以方解石和文石为主。
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| 图 8. 代表性实验中沉淀物的XRD图谱 Figure 8. X-ray diffraction patterns of the precipitates in the representative runs. A: 1 d, 2 d, 6 d; B: 8 d, 13 d, 18 d; C: 28 d, 38 d, 50 d. a: aragonite; c: calcite; standard diagram of calcite (PDF number is 05-0586) and aragonite (PDF number is 41-1475) are shown by red and blue vertical lines, respectively. |
| 图选项 |
2.7 矿物形态 从图 9和表 1可以看出，在HJ-1菌株作用下形成的矿物形态丰富多样。其中，鳞片状和不规则状是最主要的集合体形态 (图 9-a, b)。在第8天，矿物以鳞片状和长柱状集合体为主 (图 9-a)。在之后的实验中相继出现了哑铃形 (图 9-c)、杆状 (图 9-d)、球状 (图 9-e) 以及长板状 (图 9-f) 矿物。
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| 图 9. 碳酸盐矿物的扫描电子显微镜照片 Figure 9. Scanning electron microscope images of carbonate minerals. a: 8 d, flake and columnar aggregates; b: 13 d, irregular; c: 13 d, dumbbell-shaped; d: 18 d, rod-shaped; e: 38 d, spherical and irregular; f: 38 d, tabular and flake aggregates. |
| 图选项 |
表 1. 碳酸盐沉淀的组成、形态及方解石中镁的含量 Table 1. Mineral species and morphologies of the carbonate precipitates, and the percent of MgCO3 in calcite
| t/d | Aragonite/% | Calcite/% | d/nm | MgCO3/(mol%) | Morphology | Ratio relationship between the main morphologies |
| 1–6 | – | – | – | – | – | – |
| 8 | 2 | 98 | 0.2981 | 18.28 | flake rod-shaped | +++ +++ |
| 9 | 15 | 85 | 0.2997 | 13.03 | – | – |
| 10 | 46 | 54 | 0.2998 | 12.52 | – | – |
| 13 | 54 | 46 | 0.3009 | 9.08 | irregular spherical dumbbell-shaped | +++ ++ + |
| 18 | 86 | 14 | 0.3009 | 9.03 | irregular rod-shaped spherical | +++ +++ ++ |
| 23 | 77 | 23 | 0.3012 | 7.87 | – | – |
| 28 | 55 | 45 | 0.3011 | 8.37 | – | – |
| 33 | 40 | 60 | 0.3009 | 8.95 | – | – |
| 38 | 34 | 66 | 0.3006 | 10.03 | irregular flake spherical tabular | +++ +++ +++ + |
| 43 | 31 | 69 | 0.3003 | 11.04 | – | – |
| 50 | 30 | 70 | 0.3004 | 10.52 | – | – |
| +++: larger; ++: moderate; +: less; –: no observation results. | ||||||
表选项
3 讨论 本研究利用丛毛单胞菌HJ-1菌株在Mg/Ca为2的条件下进行了碳酸盐矿化实验。结果表明，在实验的初始阶段 (第8天以前)，沉淀物的XRD图谱中未见明显的衍射峰，即未形成结晶质矿物 (但有可能形成少量的非晶态碳酸钙)，在中-晚阶段形成了文石和方解石沉淀，二者始终并存于实验产物中。
3.1 形成文石+高镁方解石组合的原因 从本文2.3可知，自第8天开始一直到实验结束，沉淀物均由文石和方解石组成。当CaCO3样品中只含有文石和方解石两种矿物相时，文石相所占比例可用公式 (1) 计算。
 | 公式(1) |
 | 公式(2) |
在微生物参与下形成文石的报道很少，仅见几例在Mg/Ca较高的条件下形成HMC+文石组合的报道 (表 2)。到目前为止，未见在微生物参与、Mg/Ca≤2的条件下形成文石的报道。本研究中，在Mg/Ca为2的条件下形成了HMC+文石组合。我们推测，在Ca2+-Mg2+-CO32–体系中形成的碳酸盐矿物种类既与溶液的Mg/Ca有关，也与微生物种属有关。
表 2. 几种微生物培养基中EPS含量与所形成的碳酸盐矿物组合 Table 2. The EPS contents and the assembled of carbonate mineral formed in several media with bacteria
| Strain number | Bacterial species | Mg/Ca/(mol) | EPS/(mg/L) | Mineral | Reference |
| SN-1 | Sulfate-reducing bacteria | 2.0 | – | HMC | Su et al., 2010[31] |
| GW-2 | Lysinibacillus | 2.0 | 9–20 | HMC+HC | Xu et al., 2014[32] |
| MF-2 | Arthrobacter | 1.5 | 20–155 | HMC+LMC | Zhang et al., 2016[33] |
| HJ-1 | Curvibacter | 2.0 | 459–2545 | HMC+Aragonite | The study |
| GW-M | Clostridium | 6.0 | – | HMC+Aragonite | Guo et al., 2013[11] |
| MF-2 | Arthrobacter | 6.0 | 20–40 | HMC+Aragonite | Zhang et al., 2016[33] |
| –: indicates no calculation results. | |||||
表选项
在近溶解-沉淀平衡处，温度、CO2分压 (PCO2)、pH值和化学成分的微小变化均有可能影响碳酸盐的饱和度及其沉淀[8]。在本研究中，温度是不变量。微生物在生长代谢过程中会产生CO2，并且其产生的量会随着微生物生长周期的变化而发生一定的变化。同时，部分CO2会溶解于水最终形成碳酸根乃至碳酸盐矿物。这2个因素使PCO2的变化显得更加复杂。为了重点讨论Mg2+对矿物种类的影响，在本研究中我们暂时忽略PCO2变化的影响。因此，此处主要讨论pH值和化学成分对矿物种类的影响。
(1) pH值的影响。在实验初期 (第8天之前) 形成的沉淀物的XRD图谱中未见明显的衍射峰，即未形成结晶质矿物 (但有可能形成少量的非晶态碳酸钙)。第8天时，形成了文石和HMC。值得注意的是，此时溶液的pH值为7.89，接近现代海水的pH值 (8.1±0.1)[8]。在第8–50天时间段内，pH值介于7.89–9.11之间，可能该pH条件有利于文石和HMC的形成。特别值得一提的是，第13–28天时 (pH为8.2–8.5)，形成了类似于现代浅海沉积物中以文石为主、以HMC为次的组合。这有可能暗示，8.2–8.5是最有利于文石沉淀的pH条件。
(2) Mg2+的影响。研究表明，Mg/Ca决定了碳酸盐矿物的种类 (包括LMC、HMC和文石)[16]。在海洋环境中，碳酸盐矿物类型与海水化学成分存在关联：在富镁的海水中 (Mg/Ca > 2)，矿物以文石和HMC为主，在贫镁的海水中 (Mg/Ca < 2)，则有利LMC的形成[15]。例如在现代海水环境中 (Mg/Ca=5.2) 形成的文石约占57%，HMC约占43%[21]。陈友明等的化学实验结果表明，Mg/Ca < 5为镁方解石稳定区，Mg/Ca介于5–20之间为镁方解石和文石的混合区，当Mg/Ca介于20–30之间时仅有极少量的文石沉淀，当Mg/Ca > 30时，不形成任何碳酸盐矿物[7]。后来，Davis等[22]在较小的Mg/Ca范围内进行了更细致的实验研究。结果表明，当Mg/Ca < 1时，形成稳定的LMC相；当Mg/Ca为1–2时，形成亚稳定的HMC相；当Mg/Ca为2.0–5.3时，形成HMC相和文石相构成的混合物；当Mg/Ca > 5.3时，形成单一的文石相。
总之，Mg2+显著影响碳酸盐物相的观点早已得到国内外科学家的广泛认可，并被用于生产实践。在生产文石晶须的过程中发现，无论采用何种方法，只要体系中不含Mg2+，沉淀的矿物均主要为方解石。当体系中加入Mg2+时，则可以形成文石。Mg2+浓度越高，沉淀物中文石的相对含量越高[23-25]。因此，Mg2+被认为是CaCO3晶型的重要调节剂[22]。一般认为，Mg2+进入方解石晶格并改变其新生长面的热力学性质进而抑制方解石的生长[22]。
在本研究的实验过程中，碳酸盐矿物的沉淀导致溶液的Mg/Ca在较小的范围 (1.8–2.4) 内波动 (图 5-b)。在第8–13天之间，培养液的Mg/Ca < 2。若是在纯化学体系中，在该Mg/Ca条件下只形成HMC而不会形成文石。在第13天以后，培养液的Mg/Ca达到2以上。在该阶段形成文石符合碳酸盐矿物在化学体系中结晶的基本规律。由此可以看出，HJ-1菌株的存在降低了文石沉淀需要的Mg/Ca条件，这可能与细菌或其分泌的有机物质有关。
(3) 有机物质的影响。研究表明，许多有机分子可以抑制亚稳定相或不稳定相向方解石的转化。但是，不同有机分子所促进生长和稳定的相不同。实验结果表明，黄原胶和韦兰胶 (属于胞外多糖) 以及卵磷脂[5]的存在延迟了球霰石向方解石的转变[26]；乙二醇[27]、蛋白质[28]、聚丙烯酸[29]、β-环糊精[30]等有机物质的存在均有利于文石的形成。
从表 2可以看出，同样是在Mg/Ca≤2的条件下，不同细菌作用下形成的矿物种类有明显的区别。在硫酸盐还原细菌、赖氨酸芽孢杆菌和节杆菌作用下分别形成HMC[31]、碳钙镁石+HMC[32]和HMC+LMC (未发表)。在本研究中，丛毛单胞菌HJ-1菌株作用下形成了HMC+文石组合。我们注意到，丛毛单胞菌培养液中EPS含量比上述几种细菌培养液中EPS含量大1个数量级 (表 2)。一个很有趣的现象是，HJ-1菌株培养液中EPS含量的变化趋势与碳酸盐矿物中文石含量的变化趋势基本上一致，并且二者含量均在第18天时达到最高值 (图 10)。我们有理由认为，分泌较多的EPS可能是丛毛单胞菌诱导形成文石的主要原因。微生物分泌的EPS中含有羧基、羟基和氨基等官能团[14]。这些官能团能够吸引Ca2+和Mg2+等阳离子并通过阳离子键桥吸引碳酸根离子，最终创造出局部的碳酸盐过饱和环境。
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| 图 10. 碳酸盐沉淀物中文石和培养液中EPS含量的动态变化 Figure 10. Temporal changes of aragonite percent in the carbonate precipitate and the EPS content in the medium with bacteria. |
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化学成因的文石是热力学上亚稳定的矿物，在低温 (0和25) 的流体作用下向方解石转化的速度较快，老化10 min就转化为稳定的方解石相[9]。然而，本研究中形成的文石在50 d时间内仍保持稳定。这可能与有机物质有关。Mann认为，在生物参与的矿化作用过程中形成的亚稳相碳酸钙可以稳定地长时间地存在，这是由于生物体中的有机物质对生物矿物的形成、转化及稳定均有重要的调控作用[33]。在本研究中，HJ-1菌株在培养实验过程中分泌了较多的EPS。这些EPS势必会部分地被包裹进入生长中的文石晶体，并对其稳定性产生影响。EPS影响碳酸盐矿物种类和稳定性的问题还有待于进一步探索。
3.2 矿物形态多样的原因 本研究中形成的矿物形态丰富多样，包括了杆状、哑铃形、球状、长板状、柱状、鳞片状以及不规则状集合体等。在化学体系中，形成的方解石一般为菱面体形，文石则具有针状。因此，本实验产物中出现的形态多样性可能体现了细菌的影响力。不规则状矿物可能是以EPS为模板而形成的[11]。利用从2种芽孢杆菌培养液中提取出的EPS进行的矿化实验表明，生成的沉淀物被EPS胶结在一起，形成不规则状矿物集合体[34]。杆状、哑铃形以及球状矿物均可能与细菌细胞作为成核模板有关。以杆状细菌的细胞为成核模板，最初形成杆状矿物。研究表明，细菌菌体的两端比中间带有更多的负电基团[11, 35]，这使菌体的两端容易聚集更多的Ca2+和Mg2+，从而吸引CO32–向两端移动并与阳离子结合，因而杆状矿物经过哑铃形阶段逐渐发展为球状矿物[11]。一般来说，哑铃的两端大致相等[11]。有趣的是，在本研究产物中大部分哑铃的两端大小不等。其原因尚不清楚。
4 结论 目前，尚无关于丛毛单胞菌属细菌促进碳酸盐矿物形成的研究报道。本研究通过培养实验获得了以下几点认识。
(1) 在丛毛单胞菌HJ-1菌株的培养过程中，碳酸盐矿物重量随着培养时间的延长而增多，而对照实验中则未生成碳酸盐沉淀。这清楚地表明，HJ-1菌株对碳酸盐矿物的形成具有显著的促进作用。
(2) 在Mg/Ca为2的条件下，形成了文石+高镁方解石组合，其中文石含量最高达86%。碳酸盐矿物的形态复杂多样，主要是杆状、哑铃状、球状、长板状、柱状、鳞片状以及不规则状。
(3) 我们推测，丛毛单胞菌HJ-1菌株控制矿物种类和形态的途径主要是：①通过显著提高溶液的pH值，增大碳酸盐的过饱和度；②通过分泌较多的EPS，为矿物结晶提供有效的成核模板。
参考文献
| [1] | Qin S, Lu AH, Wang CQ. The minerals in the human body.Earth Science Frontiers, 2008, 15(6): 32–39(in Chinese).秦善, 鲁安怀, 王长秋. 人体中的矿物.地学前缘, 2008, 15(6): 32–39. |
| [2] | Xu QL, Zhang CH, Li FC, Ma F, Guo WW, Li XL, Li L, Liu L. Arthrobacter sp. strain MF-2 induces high-Mg calcite formation:Mechanism and implications for carbon fixation. Geomicrobiology Journal, 2016, Online, DOI:10.1080/01490451.2016.1155002. |
| [3] | Palchik NA, Moroz TN. Polymorph modifications of calcium carbonate in gallstones.Journal of Crystal Growth, 2005, 283(3/4): 450–456. |
| [4] | Zhou L, Jin ZD, Li FC. Mineralogy of the otoliths of naked carp Gymnocypris przewalskii (Kessler) from lake Qinghai and its Sr/Ca potential implications for migratory pattern.Science China Earth Sciences, 2012, 55(6): 983–990DOI:10.1007/s11430-012-4403-6. |
| [5] | Ni J, Zhou GT, Qu XF. Effect of phosphatidylcholine and glycylglycine on polymorph and surface microstructure of calcium carbonate.Geological Journal of China Universities, 2007, 13(4): 644–650(in Chinese).倪杰, 周根陶, 曲晓飞. 卵磷脂与双甘氨肽对碳酸钙变体和表面微结构的影响.高校地质学报, 2007, 13(4): 644–650. |
| [6] | Li F, Wu SQ, Liu K. Identification of ooid primary mineralogy:A clue for understanding the variation in paleo-oceanic chemistry.Acta Sedimentologica Sinica, 2015, 33(3): 500–511(in Chinese).李飞, 武思琴, 刘柯. 鲕粒原生矿物识别及对海水化学成分变化的指示意义.沉积学报, 2015, 33(3): 500–511. |
| [7] | Chen YN, Wang XL, Sha QA, Zhang NX. Experimental studies on the system Ca2+-Mg2+-HCO3--H2O at room temperature and pressure.Scientia Geologica Sinica, 1979, 14(1): 22–36(in Chinese).陈友明, 王秀兰, 沙庆安, 张乃娴. 室温常压下Ca2+-Mg2+-HCO3--H2O体系的试验研究.地质科学, 1979, 14(1): 22–36. |
| [8] | Tao XW, Pu XQ, Wang HQ, Yuan Z, Zhou B. Research on dissolution kinetics of calcite and aragonite in seawater with very low saturation state and near saturation.Acta Oceanologica Sinica, 2011, 33(3): 63–73(in Chinese).陶小晚, 蒲晓强, 王海强, 袁智, 周波. 极低饱和度和近饱和状态下海水中方解石和文石溶解动力学研究.海洋学报, 2011, 33(3): 63–73. |
| [9] | Zhou GT, Zheng YF. Chemical synthesis of CaCO3minerals and mineralogical mechanism of polymorphic transformation at low temperatures.Scientia Geologica Sinica, 2000, 35(3): 325–335(in Chinese).周根陶, 郑永飞. 碳酸钙矿物低温化学合成及其同质多象转变矿物学机理研究.地质科学, 2000, 35(3): 325–335. |
| [10] | K?rtzinger A, Mintrop L, Wallace DWR, Johnson KM, Neill C, Tilbrook B, Towler P, Inoue HY, Ishii M, Shaffer G, Saavedra RFT, Ohtaki E, Yamashita E, Poisson A, Brunet C, Schauer B, Goyet C, Eischeid G. The international at-sea intercomparison of fCO2 systems during the R/V Meteor Cruise 36/1 in the North Atlantic Ocean.Marine Chemistry, 2000, 72(2/4): 171–192. |
| [11] | Guo WW, Ma H, Li FC, Jin ZD, Li J, Ma F, Wang C. Citrobacter sp. strain GW-M mediates the coexistence of carbonate minerals with various morphologies.Geomicrobiology Journal, 2013, 30(8): 749–757DOI:10.1080/01490451.2013.769650. |
| [12] | Fei ZB, Liu MX, Huang T, He H, Zheng T, Huang MD. Effect of the surface amino modification of Deinococcus radiodurans on self-assembly of calcium strontium.Journal of Synthetic Crystals, 2016, 45(1): 259–266(in Chinese).费正彬, 刘明学, 黄婷, 何辉, 郑天, 黄茂迪. Deinococcus radiodurans表面氨基修饰对钙锶生物矿化自组装的影响.人工晶体学报, 2016, 45(1): 259–266. |
| [13] | Aloisi G, Gloter A, Krūger M, Wallmann K, Guyot F, Zuddas P. Nucleation of calcium carbonate on bacterial nanoglobules.Geology, 2006, 34(12): 1017–1020DOI:10.1130/G22986A.1. |
| [14] | Braissant O, Cailleau G, Dupraz C, Verrecchia EP. Bacterially induced mineralization of calcium carbonate in terrestrial environments:The role of exopolysaccharides and amino acids.Journal of Sedimentary Research, 2003, 73(3): 485–490DOI:10.1306/111302730485. |
| [15] | Sandberg PA. New interpretations of Great Salt Lake ooids and of ancient non-skeletal carbonate mineralogy.Sedimentology, 1975, 22(4): 497–537DOI:10.1111/sed.1975.22.issue-4. |
| [16] | Hardie LA. Secular variation in seawater chemistry:An explanation for the coupled secular variation in the mineralogies of marine limestones and potash evaporites over the past 600 m. y..Geology, 1996, 24(3): 279–283DOI:10.1130/0091-7613(1996)024<0279:SVISCA>2.3.CO;2. |
| [17] | Omoike A, Chorover J. Spectroscopic study of extracellular polymeric substances from Bacillus subtilis: Aqueous chemistry and adsorption effects.Biomacromolecules, 2004, 5(4): 1219–1230DOI:10.1021/bm034461z. |
| [18] | Adav SS, Lee DJ. Extraction of extracellular polymeric substances from aerobic granule with compact interior structure.Journal of Hazardous Materials, 2008, 154(1/3): 1120–1126. |
| [19] | Kontoyannis CG, Vagenas NV. Calcium carbonate phase analysis using XRD and FT-Raman spectroscopy.Analyst, 2000, 125(2): 251–255DOI:10.1039/a908609i. |
| [20] | Lumsden DN. Discrepancy between thin-section and X-ray estimates of dolomite in limestone.Journal of Sedimentary Research, 1979, 49(2): 429–435. |
| [21] | Ries JB, Anderson MA, Hill RT. Seawater Mg/Ca controls polymorph mineralogy of microbial CaCO3:A potential proxy for calcite-aragonite seas in precambrian time.Geobiology, 2008, 6(2): 106–119DOI:10.1111/gbi.2008.6.issue-2. |
| [22] | Davis KJ, Dove PM, De Yoreo JJ. The role of Mg2+ as an impurity in calcite growth.Science, 2000, 290(5494): 1134–1137DOI:10.1126/science.290.5494.1134. |
| [23] | Chen HX, Song YC. Preparation of aragonite style calcium carbonate whiskers.Journal of Materials Science and Engineering, 2004, 22(2): 197–200(in Chinese).陈华雄, 宋永才. 文石型碳酸钙晶须的制备研究.材料科学与工程学报, 2004, 22(2): 197–200. |
| [24] | Liu ZF, Yan MF, Zhang LH, Li HH. Study on the effect of magnesium ion on the crystal form of calcium carbonate.Technology of Water Treatment, 2011, 37(10): 60–62(in Chinese).刘振法, 闫美芳, 张利辉, 李海花. 镁离子对碳酸钙晶型影响研究.水处理技术, 2011, 37(10): 60–62. |
| [25] | Zhao LN, Wang XY, Kong ZG, Wang ZC. Biomimetic synthesis of dendrite-shaped aragonite calcium carbonate particles and its application in PVC.Chemical Journal of Chinese Universities, 2010, 31(12): 2329–2333(in Chinese).赵丽娜, 王秀艳, 孔治国, 王子忱. 枝状文石型碳酸钙的仿生合成及在PVC中的应用.高等学校化学学报, 2010, 31(12): 2329–2333. |
| [26] | Yin XS, Zhang H, Yang WZ, Tang YM, Wang JT. Investigation of CaCO3 crystallization induced by extracellular polysaccharide.Journal of Synthetic Crystals, 2010, 39(6): 1529–1534(in Chinese).尹晓爽, 张慧, 杨文忠, 唐永明, 王锦堂. 胞外多糖调控碳酸钙结晶的研究.人工晶体学报, 2010, 39(6): 1529–1534. |
| [27] | Flaten EM, Seiersten M, Andreassen JP. Polymorphism and morphology of calcium carbonate precipitated in mixed solvents of ethylene glycol and water.Journal of Crystal Growth, 2009, 311(13): 3533–3538DOI:10.1016/j.jcrysgro.2009.04.014. |
| [28] | Shen QM, Huang ZQ, Zhang GS. Biomimetic synthesis of aragonite crystals with spherical superstructure at ambient condition.Journal of Materials Science and Engineering, 2012, 30(3): 453–457(in Chinese).申巧敏, 黄增琼, 张刚生. 常温常压下文石球形超结构的仿生合成.材料科学与工程学报, 2012, 30(3): 453–457. |
| [29] | Chen YP, Yan Y, Hu ZH. Preparation of aragonite whisker and the effect of sulfur-containing compounds on CaCO3whisker.Journal of Synthetic Crystals, 2015, 44(5): 1347–1353(in Chinese).陈艳萍, 严云, 胡志华. 碳酸钙晶须的制备及含硫化合物对碳酸钙晶须影响的研究.人工晶体学报, 2015, 44(5): 1347–1353. |
| [30] | Zhang XY, Liao ZJ, Yang L, Hu ZG, Jiang K, Guo YM. Interaction between β-cyclodextrin and crystallization of calcium carbonate.Acta Chimica Sinica, 2003, 61(1): 69–73(in Chinese).张秀英, 廖照江, 杨林, 胡志国, 蒋凯, 郭玉明. β-环糊精与碳酸钙结晶的相互作用.化学学报, 2003, 61(1): 69–73. |
| [31] | Su N, Li FC, Ma H, Li XL. Effects of Mg/Ca ratios on the species and morphologies of microbial carbonate minerals.Acta Mineralogica Sinica, 2010, 30(1): 83–89(in Chinese).苏宁, 李福春, 马恒, 李学林. Mg/Ca比对微生物成因的碳酸盐矿物种类和形态的影响.矿物学报, 2010, 30(1): 83–89. |
| [32] | Xu QL, Li FC, Zhang CH, Li XL. Formation of huntite by Lysinibacillus sp. GW-2 strain.Acta Microbiologica Sinica, 2015, 55(5): 607–615(in Chinese).徐青龙, 李福春, 张宠宏, 李学林. 赖氨酸芽孢杆菌GW-2菌株作用下碳钙镁石的形成.微生物学报, 2015, 55(5): 607–615. |
| [33] | Epple M. Buchbesprechung:Biomineralization principles and concepts in bioinorganic materials chemistry. Von Stephen Mann.Angewandte Chemie, 2003, 115(4): 395. |
| [34] | Ercole C, Cacchio P, Botta AL, Centi V, Lepidi A. Bacterially induced mineralization of calcium carbonate:The role of exopolysaccharides and capsular polysaccharides.Microscopy and Microanalysis, 2007, 13(1): 42–50DOI:10.1017/S1431927607070122. |
| [35] | Warthmann R, Van Lith Y, Vasconcelos C, McKenzie JA, Karpoff AM. Bacterially induced dolomite precipitation in anoxic culture experiments.Geology, 2000, 28(12): 1091–1094DOI:10.1130/0091-7613(2000)28<1091:BIDPIA>2.0.CO;2. |
