, 王亚楠1,2
, 孙英杰1,2, 王华伟1,2, 徐榕1,2, 卞荣星1,2, 李卫华1,2, 宫渤海31. 青岛理工大学, 环境与市政工程学院, 青岛 266033;
2. 青岛市固体废物污染控制与资源化工程研究中心, 青岛 266033;
3. 青岛市市政公用科学技术研究院, 青岛 266033
收稿日期: 2020-06-23; 修回日期: 2020-07-21; 录用日期: 2020-07-21
基金项目: 国家自然科学基金(No.51908304, 51978350, 41907111);山东省自然科学基金博士基金(No.ZR2018BEE037)
作者简介: 开颜(1995-), 女, E-mail: 1318135253@qq.com
通讯作者（责任作者）: 王亚楠, E-mail: wangyanan1005@yeah.net
摘要：研究了青岛市小涧西垃圾填埋场表层（3~12 m）、中上层（15~24 m）、中下层（27~36 m）和底层（39~45 m）古细菌的多样性、群落组成与垂直分布特征，以及垃圾降解程度与古细菌群落结构演替变化的响应关系.结果表明：垃圾有机质和凯氏氮含量随填埋深度增加呈降低趋势，而pH呈微弱升高趋势.填埋场中下层的古细菌群落多样性和丰度显著高于其他填埋层.在填埋层各深度上，广古菌门（Euryarcharota）为优势菌门，相对丰度达到90%以上，甲烷微菌纲（Methanomicrobia）和热源体纲（Thermoplasmata）为优势菌纲，二者相对丰度之和达84.69%~99.67%.属水平上，甲烷囊菌属（Methanoculleus）的占比在38.16%~64.46%之间变化，且与有机质相关性不显著，表明该类氢营养型产甲烷菌在垃圾中分布广泛，受垃圾降解程度影响较小.马赛球菌属（Methanomassiliicoccus）的相对丰度自表层的50%降至底层的20%，且与有机质呈显著正相关（r=0.95，p < 0.05），表明该类甲基营养型产甲烷菌的分布受有机质降解程度影响较大.以乙酸裂解产甲烷的甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）和甲烷丝菌属（Methanothrix）在填埋场中也占有重要地位，但二者相对丰度整体低于Methanoculleus.Methanosarcina自表层至底层所占比重逐渐升高，与有机质呈显著负相关（r=-0.96，p < 0.05）；而Methanothrix仅在中下层有较高的丰度，与有机质相关性不显著，主要与两种菌属对乙酸亲和性的差异有关.不同填埋深度上产甲烷菌群落结构的演替变化反映了不同类型产甲烷菌对垃圾降解产物与稳定化程度的响应.
关键词：垃圾填埋场古细菌产甲烷菌垃圾降解垂直分布
Archaea vertical distribution in landfill and its response characteristics to waste degradation degree
KAI Yan1,2
, WANG Yanan1,2, SUN Yingjie1,2, WANG Huawei1,2, XU Rong1,2, BIAN Rongxing1,2, LI Weihua1,2, GONG Bohai31. School of Environmental and Municipal Engineering, Qingdao University of Technology, Qingdao 266033;
2. Solid Waste Pollution Control and Resource Engineering Research Center, Qingdao 266033;
3. Qingdao Municipal Public Science and Technology Research Institute, Qingdao 266003
Received 23 June 2020; received in revised from 21 July 2020; accepted 21 July 2020
Abstract: The diversity, community composition and vertical distribution characteristics of archaea in the surface layer (3~12 m), upper middle layer (15~24 m), lower middle layer (27~36 m), and bottom layer (39~45 m) in Qingdao Xiaojianxi municipal solid waste landfill site were investigated, and the relationships between waste degradation degree and the succession of archaea community structure were also clarified. The results showed that the diversity and abundance of archaea community in the lower middle layer were significantly higher than those in other layers. At each depth of the landfill layer, Euryarcharota was the dominant phylum with a relative abundance of over 90%, and Methanomicrobia and Thermoplasmata were the dominant classes with total relative abundances of 84.69%~99.67%. At the level of genus, Methanoculleus occupied a high proportion in all landfill layers with a varying range of 38.16%~64.46%, and the variation of its proportion was not significantly correlated with the change of organic matters, which indicated that the hydrogen-utilizing methanogen was widely distributed in landfills and was less affected by the degree of waste degradation. The relative abundance of Methanomassiliicoccus decreased from 50% in the surface layer to 20% in the bottom layer, and it was significantly positively correlated with organic matters (r=0.95, p < 0.05), which indicated that the distribution of methyl group-utilizing methanogen was greatly affected by the degree of organic matter degradation. Methanosarcina and Methanothrix, which produce methane by catabolizing acetic acid, also played an important role in landfills, but their relative abundances were lower than that of Methanoculleus. The proportion of Methanosarcina increased gradually from the surface layer to the bottom layer, and it was strongly negatively correlated with the change of organic matters (r=-0.96, p < 0.05), while Methanothrix occupied a high proportion in the lower middle layers, and it was not significantly correlated with the change of organic matters. The difference was mainly due to the differences in the affinity of acetate between the two genera. The succession of methanogen community structure at landfill depth reflected the response of different types of methanogen to the degradation products and stabilization degree of waste.
Keywords: landfillarchaeamethanogenwaste degradationvertical distribution
1 引言(Introduction)卫生填埋是城市生活垃圾处理的主要方法之一(Vaverková et al., 2019).2018年我国生活垃圾填埋处理量达到1.17×108 t, 且长期以来填埋处理所占比重在50%以上(国家统计局, 2019).厌氧填埋场中垃圾的降解主要包括好氧分解阶段、好氧至厌氧的过渡阶段、酸发酵阶段、产甲烷阶段及填埋场稳定阶段(黄耀民等, 2019).垃圾填埋场中有机废物的降解是各种微生物协同作用的结果, 在水解菌群、产氢产乙酸菌群、产甲烷菌群等微生物作用下完成复杂有机物的矿化/腐殖化过程(杨虹等, 2002; 马琳, 2012; 王晋等, 2011; Tian et al., 2017).
古细菌在厌氧环境中广泛分布, 且能够耐受高温、高盐、高压等极端环境, 在地球碳、氮、硫等元素循环中起重要作用(邓霏, 2018).填埋场属于特殊的富有机质厌氧环境, 有机物的厌氧发酵产物, 如乙酸、H2/CO2和甲酸盐、甲基类有机物为产甲烷古菌的生长繁殖提供了所需物质和能量; 产甲烷菌是催化有机物厌氧分解的最后一环, 是影响填埋场稳定化进程的关键微生物(单丽伟等, 2003).国内外研究人员对填埋场渗滤液及模拟填埋反应器中的古菌群落结构进行了研究, 发现Methanomicrobiales、Methanosarcinales和Methanobacteriales为优势古菌(Bareither et al., 2003; Li et al., 2009;Song et al., 2015a), 相关研究也发现Methanobacteriales、Methanomicrobiales和Methanosarcinales在渗滤液中占有优势(Calli et al., 2006; Laloui-Carpentier et al., 2006; Dong et al., 2015).但实际填埋场废物种类较多, 有机质降解产物种类复杂, 模拟研究难以全面反映填埋场垂直方向上古菌群落的演替规律; 且渗滤液中微生物与垃圾中微生物组成差异较大, 无法全面反映垃圾降解过程中古菌的种类和丰度变化; 实际填埋场时间维度长, 更能真实反映垃圾降解过程中古菌的群落结构演替变化及古菌对垃圾稳定化的贡献.
基于此, 本文采用高通量测序技术研究青岛市小涧西垃圾填埋场垂直方向上古菌的群落结构组成及分布特征, 以及其对垃圾降解程度的响应特征, 以期为全面了解古细菌(尤其是不同营养型产甲烷菌)在填埋场稳定化中的作用提供理论依据.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 垃圾样品采集垃圾样品取自青岛市小涧西卫生填埋场(一期工程), 该填埋场于2003年投入使用, 占地面积65.88 hm2, 填埋库区面积为26.88 hm2(长560 m、宽480 m), 填埋场设计标高为45 m, 设计库容为710万m3, 2018年底封场, 堆体实际高度达56 m, 并形成5个平台, 填埋垃圾总量约为1400万t.现场钻井选取8个点位, 自第5~第2平台依次垂直向下钻井, 垂直深度上每隔3 m采集一个垃圾样品.第5平台样品采集深度为3、6、9、12 m, 第4平台样品采集深度为15、18、21、24 m, 第3平台样品采集深度为27、30、33、36 m, 第2平台样品采集深度为39、42、45 m.将第5~第2平台分别命名为A、B、C、D, 对应的填埋深度依次为3~12、15~24、27~36和39~45 m, 对应的填埋时间分别为0~1、1~3、3~6和6~9年.为了确保样品的代表性, 在剔除金属、石块、塑料等大块垃圾后, 将同一深度上不同采样点的垃圾样品充分混合后, 按照四分法取大约500 g样品在自密封塑料袋中储存, 一部分样品于4 ℃保存用于样品理化性质分析, 一部分样品于-80 ℃保存供后续DNA提取.钻井点位布设如图 1所示.
图 1(Fig. 1)
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| 图 1 填埋场采样点位 Fig. 1Sampling sites in landfill |
2.2 DNA提取、PCR扩增及高通量测序称取湿垃圾样品10 g, 与无菌去离子水按1:1比例混合, 置于摇床120 r·min-1连续振荡1 h使垃圾充分浸提, 之后通过高速离心(8000 r·min-1)去上清液; 称取约1.0 g泥状样品提取DNA(MoBio Power Soil? DNA Isolation kit), 采用超微量分光光度计检测DNA样品的浓度和质量, 确保样品DNA的A260/A280值介于1.8~2.0, A260 /A230值接近2.0.古菌PCR扩增采用巢氏PCR, 第一轮引物为340F(CCCTAYGGGGYGCASCAG)和1000R(GGCCAT GCACYWCYTCTC), 第二轮使用第一轮PCR产物进行扩增, 扩增区域为V3~V4, 选用引物为349F(GYGCASCAGKCGMGAAW)和806R(GGACTACV SGGGTATCTAAT).两轮PCR扩增程序为：94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性30 s, 45 ℃退火20 s, 65 ℃延伸30 s, 5个循环; 94 ℃变性20 s, 55 ℃退火20 s, 72 ℃延伸30 s, 20个循环; 最后72 ℃延伸5 min.高通量测序平台为Illumina Miseq 2×300 bp测序平台(上海生工生物工程股份有限公司).
2.3 分析方法与数据处理垃圾样品的pH值和电导率(EC)分别采用玻璃电极法(LYT1239—1999)和电极法(HJ 802—2016)测定, 凯氏氮(TKN)、有效磷(AP)和有机质(OM)分别采用硫酸汞催化消解法(CJ/T3018.7—1993)、碳酸氢钠浸提-钼锑抗分光光度法(HJ 704—2014)和灼烧法(GB/T 212—2008)测定.利用Vegan软件对高通量数据进行分类操作单元(OTU)分析并绘制样本聚类树图, 并基于该软件分析样本的Beta多样性, 利用mothur软件分析样本的Alpha多样性, 包括覆盖度(Coverage)、多样性指数(Shannon)、辛普森指数(Simpson)、均匀度指数(ACE)和丰富度指数(Chao1).利用R语言对样本物种分类学进行统计, 并基于R语言的冗余分析(RDA)解析古细菌群落与填埋环境理化因子的关系.填埋垃圾理化性质与微生物相对丰度的相关性采用SPSS 22.0软件进行双变量相关分析.
3 结果与讨论(Results and discussion)3.1 填埋场古菌OTU和多样性垂直分布特征3.1.1 OTU垂直分布特征在97%相似水平上对样本序列进行OTU聚类分析, 垂直深度上不同样本间的聚类树图和韦恩(VENN)图反映了古菌群落组成的相似性和差异性.如图 2a和2b所示, A平台样本OTU与其他平台样本OTU处于不同分支, 说明浅层与深层垃圾中的古菌群落存在明显差异.对比不同深度上样本的聚类情况, 相同平台上不同深度的样本亲缘关系较近, 但B平台不同深度的样本与其他平台样本呈现明显交叉现象, 如15 m处样本与A平台关系较近, 18 m处样本与第4平台关系较近.这可能是因为垃圾异质性强, 且填埋层内含水率、温度、氧化还原环境存在一定差异, 造成同一平台垃圾的降解程度存在差异.
图 2(Fig. 2)
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| 图 2 基于OTU的不同深度(a)、平台(b)样本聚类树图及不同平台样本OTU分布VENN图(c) (同一颜色的树枝表示样品来自同一平台, 树枝长度代表样本间的距离) Fig. 2Hierarchical clustering of OTU in waste samples at different depths(a) and platforms(b) and the VENN diagram of OTU at different platforms(c)(Branches of the same color represent samples from the same platform, and the length of the branches represents the distance between samples) |
VENN图(图 2c)结果表明, A、B、C、D平台所包含的古菌OTU数分别为1718、2374、3076和1759, 即填埋场表层所含的古菌种类最少, 填埋深度27~36 m处的古菌所含OTU数是上层的1.8倍, 而随着垃圾填埋龄的增加, 古菌OTU数呈现降低的现象.在两两共有的OTU数量中, A、B平台共有的OTU数为1022(25.0%), B、C平台共有的OTU数为1569(28.8%), C、D平台共有的OTU数为1274(26.3%).0~45 m的填埋深度共有的OTU数目为523, 表明某些古菌一直参与垃圾的降解, 而各平台OTU的差异也反映了古菌的种类随垃圾稳定化进程呈演替变化.
3.1.2 多样性垂直分布特征垂直深度上垃圾样本中古菌群落Alpha多样性指数如图 3所示.Alpha多样性反映了古菌群落的丰富度和多样性.Chao1和ACE指数常用来估算群落丰度, 其数值越大, 表明物种总数越多.填埋场古菌的丰度随着填埋深度增加呈现出先增高后降低的趋势, 填埋深度为3~12 m处的古菌丰度最低, 而在27~36 m处的古菌丰度最高.Shannon指数越大, Simpson指数越小, 则群落多样性越高.随着填埋深度的增加, 填埋场古菌多样性呈现出先升高后降低的趋势, 并在27~36 m处群落多样性最高.
图 3(Fig. 3)
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| 图 3 不同平台垃圾样本的古菌群落丰度和多样性 Fig. 3Abundance and diversity of archaea communities in different landfill platforms |
Alpha多样性指数表明, 不同平台填埋垃圾中古菌的丰度和多样性的大小均为C>B>D>A, 表层垃圾的古菌丰度和多样性都显著低于其他填埋深度的垃圾, 表明填埋龄0~1年和6~9年垃圾层内古菌丰度和多样性低于1~3年和3~6年垃圾.由于古菌大多数为严格厌氧和兼性厌氧菌, 填埋场表层垃圾中残存的氧气不适宜古菌的生长繁殖; 另一方面, 表层垃圾填埋时间较短, 垃圾尚未完全进入产甲烷阶段, 导致表层垃圾中古菌的丰度和多样性显著低于其他填埋深度.填埋龄较长(6~9年)的垃圾稳定化程度较高, 大部分有机物在水解酸化菌、产甲烷菌的作用下降解, 填埋层内产甲烷微生物的丰度和多样性也随之降低.填埋场长期的降解可能会使得老龄垃圾中产甲烷菌多样性低于低龄垃圾(刘洪杰等, 2017).
不同填埋深度的样本间的β-多样性利用非度量多维尺度(NMDS)来表示, 如图 4所示.与其他填埋龄数据相比, A平台所属的4个深度点的位置较其他点位偏离散, 表明短期填埋龄垃圾古菌群落结构差异性较大, B、C和D平台的古菌群落组成较为聚集, 说明这3个平台对应的不同填埋深度上的古菌群落组成具有较高相似性.
图 4(Fig. 4)
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| 图 4 不同平台古菌群落的非度量多维尺度分析 (图中数据代表不同采样深度(m)样品) Fig. 4NMDS analysis of archaea communities at different platforms |
3.2 填埋场古菌菌落结构组成垂直分布特征3.2.1 门和纲水平上古菌群落结构填埋场古菌群落结构在门和纲水平上的垂直分布特征如图 5所示.垃圾样品共检测到5种门水平上的古菌, 分别为Euryarcharota(广古菌门)、Crenarchaeota(泉古菌门)、Thaumarchaeota(奇古菌门)、Woesearchaeota(乌斯古菌门)和Pacearchaeota(佩斯古菌门)(图 5a).Euryarcharota在各填埋深度上占绝对优势, 相对丰度为90.79%~99.96%, Crenarchaeota的相对丰度为0.03%~8.32%.填埋垃圾中这两种菌门的比例占总古菌门的98%以上, 在渗滤液中也有类似发现(Huang et al., 2003).
图 5(Fig. 5)
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| 图 5 不同填埋深度上古菌在门(a)和纲(b)水平上的物种组成 Fig. 5Composition of archaea on phylum(a) and class(b) levels at different depths |
Euryarcharota主要包括Methanomicrobia(甲烷微菌纲, 27.64%~94.99%)、Thermoplasmata(热原体纲, 4.68%~61.2%)、Methanobacteria(甲烷杆菌纲, 0.06%~13.67%)及Halobacteria(嗜盐菌纲, 0.01%~ 0.51%)(图 5b).其中, Methanomicrobia除在表层中所占比重略低外(27.64%~37.47%), 在其他填埋层中所占比例为52.37%~94.99%.Thermoplasmata在3~15 m范围内所占比重高达32.48%~61.18%, 随着填埋深度的增加, 比例降低至4.68%~26.70%.Methanobacteria在3 m样品中所占比例(13.67%)远高于其他深度, Halobacteria主要分布于填埋场表层样品中.这些菌纲随填埋深度的变化反映了参与垃圾降解的产甲烷菌的种类也随垃圾降解程度的变化而演变.Crenarchaeota属于极端嗜热、嗜酸菌, 能够利用还原性无机物, 如H2和还原性硫, 该填埋场中泉古菌门较为单一, 主要是分布在24~39 m深度上的Thermoprotei(热变形菌纲, 5.25%~9.68%), 参与填埋场硫的循环.Thaumarchaeota几乎包括了所有的氨氧化古菌, 在该填埋场33 m深度样品中占比约为1%, 表明随着垃圾有机质不断降解, 厌氧氨氧化古菌可能通过3-羟基丙酸/4-羟基丁酸途径进行自养生长或利用有机碳异养生长, 促进填埋层中碳、氮循环过程(陈烨等, 2017).
3.2.2 目水平上古菌群落结构填埋场古菌群落结构在目水平上的垂直分布特征如图 6所示.不同深度上古菌主要归属为4个目, 分别是Methanomicrobiales (甲烷微菌目)、Methanomassiliicoccales (马赛球菌目)、Methanosarcinales (甲烷八叠球菌目)和Methanobacteriales (甲烷杆菌目).产甲烷菌是一类严格厌氧的古菌, 根据底物利用类型, 产甲烷途径可分为3类：H2/CO2还原产CH4途径、乙酸裂解产CH4途径和甲基营养途径.Methanomicrobiales和Methanobacteriales中几乎所有的菌种都能够利用H2/CO2途径产甲烷, 部分也利用甲酸产甲烷.Methanosarcinales主要由甲基型产甲烷菌构成, 利用含甲基的化合物如乙醇、甲胺等, 是代谢多样性较高的甲烷菌群(方晓瑜等, 2015).Methanomassiliicoccales是近年被新发现的一类产甲烷菌, 属于Thermoplasmata的一个分支, 与一般的专性甲基型产甲烷古菌不同, 其只有在外源H2存在条件下才能利用甲基类物质(张坚超等, 2015; 段昌海等, 2019).
图 6(Fig. 6)
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| 图 6 不同深度(a)及平台(b)目水平上古菌分布 (Others为样品中相对丰度＜0.1%的古菌目) Fig. 6Composition of archaea on order level at different depths (a) and platforms(b)(Others includes archaea with a relative abundance of less than 0.1% in samples) |
Methanomassiliicoccales在第5平台所占比例远高于其他平台, 尤其是6 m处垃圾样本中所占比例高达61.18%, 这主要是因为垃圾填埋初期的产H2高峰早于产乙酸高峰, 水解阶段产生的高浓度H2和甲基化合物为Methanomassiliicoccales提供了充足底物.随着填埋深度的增加, 氢营养性产甲烷菌Methanomicrobiales含量显著增加并占据优势地位, 比例在41.77%~67.73%范围内变化; 且Methanosarcinales比例也有明显提高, 在第3和第2平台所占比重也高于第5平台.这些结果表明随着垃圾的降解, 甲基营养型产甲烷途径作用逐渐变弱, 乙酸裂解产甲烷途径的作用逐渐增强, 而H2/CO2还原产CH4途径在整个填埋层中均有较高比例的分布.相关研究表明, Methanomicrobiale和Methanobacteriales在填埋场渗滤液中为优势菌目, 且氢营养型产甲烷菌占很大比例(Huang et al., 2003; Krishnamurthi et al., 2013; Song et al., 2015b).刘洪杰(2017)在模拟垃圾填埋柱古菌群落随垃圾稳定化进程中发现Methanomicrobiale和Methanosarcinales为优势产甲烷菌目, 且Methanomicrobiale所占比例在产甲烷阶段高于Methanosarcinales, 这与本研究中氢营养型产甲烷菌占有较大比例相吻合.此外, 该填埋场检测到一类在之前研究中未发现的优势菌目, 即Methanomassiliicoccales, 这可能是因为实际填埋场中垃圾种类和有机物代谢途径比模拟填埋场更丰富.
此外, 该填埋场中泉古菌门主要包括Thermoprotei(热变形菌纲)中的Desulfurococcales(脱硫球菌目)和Thermoproteales(热变形菌目), 但二者在泉古菌门中所占比例较低, 分别为0~25.89%(主要分布于15~45 m范围)和0~1.20%(主要集中于30~36 m范围).奇古菌门主要包括Nitrosopumilales和Nitrososphaerales, 其中, Nitrosopumilales在奇古菌门中所占比例整体较低, 为0~15.36%, 主要分布在表层3~15 m范围内, 而Nitrososphaerales在Thaumarchaeota中占绝对优势, 为84.02%~100.00%.
3.2.3 属水平上古菌群落结构填埋场古菌群落结构在属水平上的垂直分布特征如图 7所示.Methanoculleus(甲烷囊菌属)、Methanomassiliicoccus(马赛球菌属)、Methanosarcina(甲烷八叠球菌属)和Methanothrix(甲烷丝菌属)为代表性菌属.随着填埋深度的增加, Methanoculleus的相对丰度由表层的0.35%增至中层的91.04%, 而后降低至底层的53.31%;Methanomassiliicoccus的相对丰度在6 m处略微增加随后缓慢降低, Methanosarcina相对丰度在6~12 m深度波动较大, 随后维持在10%左右, Methanothrix相对丰度在3~21 m深度几乎为0, 在33 m处高达21.35%.此外, 填埋层内还发现Methanofollis(甲烷泡菌属, 0.08%~3.67%)、Methanothermobacter(甲烷热杆菌属, 0~13.07%)、Nitrososphaera(亚硝化球菌属, 0~0.58%)及未分类菌属(0.08%~8.45%)等.
图 7(Fig. 7)
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| 图 7 不同深度(a)及平台(b)属水平上古菌分布 (Others为样品中相对丰度＜0.1%的古菌属) Fig. 7Composition of archaea on genus level at different depths(a) and platforms(b) (Others include archaea with a relative abundance were less than 0.1% in samples) |
如图 7b所示, Methanoculleus在各平台所占比例均很高, 在38.16%~64.46%范围内变化, Methanomassiliicoccus自第5平台的50.23%降至第2平台的约20%.Methanosarcina自第5平台至第2平台所占比重逐渐升高, Methanothrix在第3平台也有较高的丰度, 且第5平台中该比例显著低于其他平台.已知的产甲烷古菌中只有两个属能利用乙酸, 即Methanosarcina和Methanothrix.Methanosarcina的代谢途径具有多样性, 在乙酸浓度足够高的条件具有较的高生长速度, 但对乙酸亲和力低; Methanothrix(以前称为Methanosaeta)是一种专性乙酸裂解产甲烷菌属(Jetten et al., 1992), 不能直接利用H2或甲酸盐作为电子供体还原CO2, 其对乙酸有高亲和力, 但生长速度较低.此外, Methanothrix也可通过Geobacter菌种的种间电子转移(DIET)作用获取电子还原CO2产CH4(Huser et al., 1982).大多数垃圾填埋场的群落研究中发现了Methanoculleus、Methanosarcina和Methanothrix的存在(Krishnamurthi et al., 2013; 刘洪杰, 2017), 且Methanoculleus在各填埋深度均具有十分可观的占比, 表明这些菌属在填埋场垃圾分解中具有重要作用.在垃圾降解过程中, 大约78%的CH4通过乙酸裂解产生, 22%的CH4通过CO2/H2产生, CO2还原为甲烷为大部分乙酸产生甲烷创造了必要条件, 这两条途径是相互关联的.尽管乙酸发酵产甲烷途径占优势, 但填埋层中氢营养型产甲烷菌所占比例相对较高.相关研究也发现, 乙酸营养型产甲烷菌以乙酸为唯一碳源培养时, 在厌氧活性污泥中仍检测到大量嗜氢产甲烷菌(张玉鹏, 2014).
3.3 环境因子对古菌群落的影响3.3.1 垃圾理化性质填埋场内pH随深度的变化呈现微弱变化趋势, 平台平均pH自第5平台到第3平台由7.32增至7.89, 呈缓慢上升的趋势.EC随深度变化较小, 平均EC为2.32~2.57 mS·cm-1.AP自第5平台至第2平台呈现升高趋势, 平均含量由260 mg·kg-1增至498 mg·kg-1.OM呈现明显的降低趋势, 平均含量自第5平台的43.77%降低至第2平台的24.09%.TKN整体呈降低趋势, 自第5平台的7.08 g·kg-1降低至第3平台的4.47 g·kg-1, 但第2平台的平均TKN为4.80 g·kg-1, 略高于第3平台, 这主要由垃圾降解的不均匀性造成.该填埋场垃圾目前仍处于不稳定阶段, 且垃圾降解程度随填埋深度/平台呈现较大差异性.
表 1(Table 1)
| 表 1 不同平台垃圾样本理化性质 Table 1 Physicochemical properties waste samples at different platforms | ||||||||||||||||||||||||||||||
表 1 不同平台垃圾样本理化性质 Table 1 Physicochemical properties waste samples at different platforms
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3.3.2 产甲烷菌属与垃圾降解程度响应特征各平台垃圾理化性质与属水平古菌相对丰度的相关性如表 2所示.Methanoculleus在各深度上均有较高比例的分布, 与有机质相关性不显著, 说明该菌属的相对丰度受垃圾降解程度影响较小.Methanomassiliicoccus与有机质呈显著正相关, 相关系数为0.95(p < 0.05), 表明其分布受有机质含量影响较大.Methanosarcina和Methanothrix与pH呈显著正相关, 表明其在弱碱性环境中有较高的相对丰度, 这与填埋层中乙酸等挥发性有机酸在乙酸营养型产甲烷微生物作用下不断降解, pH逐渐升高的变化规律相一致.Methanosarcina与有机质呈显著负相关, 相关系数为-0.96(p < 0.05), 表明其丰度受垃圾有机质影响较大, 即Methanosarcina的产甲烷过程受底物浓度影响较大; 而Methanothrix与有机质相关性不显著, 表明Methanothrix的产甲烷过程受底物浓度影响较小.此外, Methanofollis和Methanobacterium与有机质均无显著相关性, Methanothermobacter、Methanosphaera与有机质呈显著正相关, 而Methanospirillum、Methanolinea与有机质呈显著负相关, 这些菌属多属于氢营养型产甲烷菌, 部分菌属受有机质影响较大, 而部分菌属受有机质影响较小, 进一步表明氢营养型产甲烷菌在填埋场的分布广泛性.
表 2(Table 2)
| 表 2 属水平各菌属与环境因子相关性分析 Table 2 Correlation analysis of archaea community and environmental factors at genus level | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 2 属水平各菌属与环境因子相关性分析 Table 2 Correlation analysis of archaea community and environmental factors at genus level
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属水平上古菌群落结构与垃圾理化性质的RDA分析见图 8.填埋深度为3、18和33 m的垃圾样本离原点较远且呈离散分布, 表明这3个填埋深度的古菌与其他深度相比存在较强的差异性, 其他填埋深度的样本相互聚集, 分布在原点附近, 表明它们之间有较强的依附关系, 即这些样本中古菌群落结构受垃圾理化性质变化的影响较小, 非度量多维尺度分析也印证了这个结论.垃圾理化性质对古菌群落结构影响程度排序为OM>TKN>pH, 进一步表明了垃圾中有机质降解程度对古菌群落结构的影响.
图 8(Fig. 8)
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| 图 8 属水平上古菌群落和垃圾理化性质的RDA分析 Fig. 8RDA analysis based on archaea community on genus level and waste physicochemical properties |
4 结论(Conclusions)1) 生活垃圾填埋场中有机质和凯氏氮含量随填埋深度增加呈降低趋势, 而pH呈微弱升高趋势.填埋场表层与中下层垃圾中的古菌群落组成存在着明显差异, 其中, 中下层的古菌群落组成具有较高相似性.在垂直方向上, 表层垃圾中古菌群落的丰度和多样性显著低于其他填埋深度的垃圾, 且随着填埋深度的增加, 古菌群落的丰度和多样性呈现出先升高后降低的趋势, 并在中下层(27~36 m)达到最高.
2) 填埋场中, Euryarcharota为优势菌门, Methanomicrobia和Thermoplasmata为优势菌纲.属水平上, Methanoculleus在各平台所占比例均很高, 在38%~65%范围变化, Methanomassiliicoccus自第5平台至第2平台由近50%突降至20%左右.Methanosarcina自第5平台至第2平台所占比重逐渐升高, Methanothrix在第3平台也有较高的丰度, 且第5平台中该比例显著低于其他平台.
3) 氢营养型产甲烷菌在垃圾中广泛分布, 且受垃圾降解程度影响较小, 甲基营养型产甲烷菌的分布受有机质降解产物影响较大, 乙酸裂解型产甲烷菌的相对丰度整体低于氢营养型产甲烷菌, 其中, Methanosarcina与有机质呈显著负相关; 而Methanothrix与有机质相关性不显著.垃圾理化性质对古菌群落结构影响程度为OM>TKN>pH, 进一步表明垃圾中有机质降解程度会显著影响古菌群落结构演替.
致谢:感谢青岛康恒再生能源有限公司和青岛固体废弃物处置有限责任公司对本项目现场采样工作的支持.
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