, Asmaa HusseinAli, 刘丹
西南交通大学地球科学与环境工程学院, 成都 611756
收稿日期: 2020-05-17; 修回日期: 2020-06-15; 录用日期: 2020-06-16
基金项目: 四川省重大科技专项（No.19ZDZX0009）
作者简介: 刘庆梅(1991-), 女, E-mail:1042372236@qq.com
通讯作者（责任作者）: 刘丹, E-mail:dliu@swjtu.edu.cn
摘要：通过对比不同氧气条件下矿化垃圾修复石油污染土壤的效果、降解产物、生态毒性、酶活性和微生物群落，分析了氧气条件对矿化垃圾修复石油污染土壤的影响.结果表明，添加矿化垃圾在厌氧、好氧和厌氧-好氧3种氧气条件下对微生物修复石油污染土壤都有较好的强化效果.修复的最佳氧气条件为好氧，好氧修复后土壤总石油烃（TPH）去除率最高，土壤生态毒性最小.厌氧-好氧试验的TPH去除率和土壤生态毒性介于厌氧和好氧试验之间.好氧条件更利于小分子石油类污染物的降解，修复后链烷烃、烯烃、芳香烃和芳香烃衍生物的去除率最高，新增污染物主要为环烷烃、含卤有机物和含氮杂环有机物.而厌氧条件更利于大分子石油类污染物的降解，修复后环烷烃、环烷烃衍生物和含氮杂环有机物的去除率最高，新增污染物主要为支链烷烃、环烷烃和含氧环状有机物.好氧条件下土壤微生物总活性更高，而厌氧条件下土壤微生物多样性更高.纲水平上，厌氧和好氧条件下土壤优势细菌都为放线菌纲、β-变形菌纲和γ-变形菌纲，优势真菌都为粪壳菌纲.但在属水平上优势菌差异很大，好氧条件下的石油烃降解菌更多，而厌氧条件下的石油烃衍生物降解菌更多.
关键词：矿化垃圾石油污染土壤氧气条件微生物修复微生物
Effects of oxygen condition on bioremediation of petroleum-contaminated soil using aged refuse
LIU Qingmei
, Asmaa Hussein Ali, LIU DanFaculty of Geosciences and Environmental Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 611756
Received 17 May 2020; received in revised from 15 June 2020; accepted 16 June 2020
Abstract: The effects of oxygen condition on petroleum-contaminated soil bioremediation using aged refuse were investigated by comparing remediating effectiveness, degradation products, ecotoxicity, enzyme activities and microbial communities in three treatments under different oxygen conditions. The results demonstrated that aged refuse addition enhanced the bioremediation effectiveness of petroleum-contaminated soil under all three oxygen conditions compared with the control treatment (natural attenuation). Aerobic treatment showed the highest total petroleum hydrocarbon (TPH) removal rate but the lowest toxicity, indicating its highest effectiveness; anaerobic treatment had the lowest TPH removal rate and the highest toxicity while anaerobic-aerobic treatment showed medium level of removal rate and toxicity. Aerobic condition favored the biodegradation of small molecular petroleum pollutants. The removal rates of alkanes, alkenes, aromatic hydrocarbons and aromatic hydrocarbon derivatives were the highest and the added pollutants after remediation were mainly cyclanes, halogenated and nitrogen heterocyclic organic matter. In contrast, anaerobic condition favored the biodegradation of high molecular petroleum pollutants. The removal rates of cyclanes, cycloalkane derivatives and nitrogen heterocyclic organic matter were the highest and the added pollutants after remediation were mainly branched alkanes, cyclanes and oxygenated cyclic organic matter. Aerobic treatment had higher total microbial activity than anaerobic treatment, while in contrast anaerobic treatment had higher soil microbial diversity. At class level, the dominant bacteria were Actinobacteria, β-Proteobacteria and γ-Proteobacteria, and the dominant fungi were Sordariomycetes in both treatments. In contrast, at genus level, the dominant bacteria were different between the two treatments: aerobic treatment had more petroleum hydrocarbon degrading bacteria, while anaerobic treatment had more petroleum hydrocarbon derivative degrading bacteria.
Keywords: aged refusepetroleum-contaminated soiloxygen conditionsbioremediationmicroorganism
1 引言(Introduction)石油开采、储存、运输等生产过程及泄漏事故造成的土壤污染日趋严重.生物修复因具有比物化修复法更经济、彻底、对环境友好等优势正成为石油污染土壤修复的主流手段, 但生物修复仍存在自然降解效果差、修复周期长、难以修复高浓度石油污染土壤等缺点(Al-Hawash et al., 2018).通过添加外源菌剂、表面活性剂、人工通风等措施可以强化生物修复的效果, 但成本较高；此外, 由于石油类污染物的生物降解同时受多种物理、化学和生物因素的影响(Varjani et al., 2017; Mahmoud et al., 2019), 只采用一种强化措施很难获得良好的修复效果, 而同时采取多种强化措施又会增加生物修复的成本.因此, 进一步提高生物修复效果、扩大生物修复应用范围、降低生物修复成本成为国内外****普遍关注的问题.矿化垃圾具有较高的孔隙度和保水性, 富含有机质和营养元素, 还具有较高的微生物量和多样性(赵由才等, 2006), 而且矿化垃圾本身是一种废物, 埋深浅、存量大、方便开采利用(于淼等, 2017).在课题组之前的研究中(Liu et al., 2018)发现, 添加矿化垃圾是一种高效且经济的强化石油污染土壤微生物修复的措施, 矿化垃圾修复石油污染土壤的机理包括生物刺激和生物添加.然而, 目前有关氧气条件对矿化垃圾修复石油污染土壤效果的影响及机理还不清楚.
好氧条件和厌氧条件下, 微生物都能降解石油类污染物, 但降解途径不同.在好氧环境中, 氧分子可直接作为电子受体.但在厌氧环境中, 环境中的硝酸根、硫酸根和碳酸根为电子受体, 或者通过微生物的酶催化水分子, 将水分子引入一些发生脱氢作用的部位(唐景春, 2015).电子受体的缺乏常常成为生物降解石油类污染物的重要限制因素, 因此, 需要进行补充以提高微生物修复效果(Al-Hawash et al., 2018).理论上讲, 在好氧条件下, 添加矿化垃圾能通过增加土壤孔隙度, 增加土壤的氧气含量和传导速度(Liu et al., 2018), 进而增加好氧降解的电子受体.在厌氧条件下, 添加富含硝酸根、硫酸根和碳酸根的矿化垃圾(王东梅, 2015), 也能增加厌氧降解的电子受体.鉴于在不同氧气条件下, 微生物对污染物的降解机理和效果不同, 厌氧-好氧续批式处理对很多有机物都有更好的降解效果(Jayapal et al., 2018).因此, 本研究通过对比厌氧、好氧和厌氧-好氧3种氧气条件下矿化垃圾对石油污染土壤的修复效果, 以揭示氧气条件对矿化垃圾修复石油污染土壤的影响机理.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 试验材料试验用清洁土壤为未受石油污染的农田土壤的表层土(0~20 cm), 采集地点为四川省江油市东安乡(31°44′N, 104°44′E).土壤自然风干后, 过孔径2 mm筛, 混和均匀后装袋待用.预处理后的清洁土壤质地为沙壤土, 其中, 粘粒(< 0.002 mm)占比为66.75%, 粉粒(0.02~0.002 mm)占比为21.86%, 砂粒(2~0.02 mm)占比为11.39%.土壤渗透系数为2.25×10-4 cm · s-1, 电导率为118.65 μS · cm-1.试验用石油取自中国石油集团川庆钻探工程有限公司的钻井井口, 其族组分组成为69.41%的饱和烃、3.27%的芳香烃和27.32%的极性组分, 不含沥青组分.石油污染土壤的配置方法为：将预处理后的清洁土壤均匀混入一定质量石油, 用砂石搅拌器混匀, 翻动风干4 d去除易挥发石油组分后备用.矿化垃圾取自封场的宜宾城市生活垃圾卫生填埋场, 填埋龄8年.剔除矿化垃圾中的金属、塑料、玻璃等杂物后过孔径10 mm筛, 盛装于聚乙烯袋中待用.矿化垃圾的特性见参考文献(Liu et al., 2018).
2.2 指标测定方法总石油烃含量(TPH)和石油组分的测定采用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)；荧光二乙酸酯(FDA)水解酶的测定方法为荧光素比色法；微生物多样性和群落组成的测定采用高通量测序法.这些指标的具体测定方法参照文献(Liu et al., 2018).pH的测定采用电极法(NY/T1377—2007)；总氮的测定采用修正的凯氏法, 有效氮和有效磷的测定分别采用碱解扩散法和碳酸氢钠浸提-钼锑抗分光光度法(刘凤枝等, 2015)；土壤生态毒性通过种子发芽试验的发芽率表征, 详细方法见文献(Weihang et al., 2016).
2.3 试验设计修复试验在实验室内进行, 在25 ℃条件下修复112 d.好氧试验的容器为1 L的透明塑料桶, 高14 cm, 直径为11 cm.厌氧试验容器为相同尺寸的厌氧发酵罐.厌氧-好氧试验的容器在修复的前56 d与厌氧试验相同, 修复的后56 d与好氧试验相同.3组试验的土壤都为250 g(干重) 50 mg · g-1石油污染土壤与250 g(干重)矿化垃圾的混合物.修复试验开始时将各试验土壤含水率调整为15%, 好氧修复过程中每天通过重量法保持土壤含水率为15%, 每2 d翻耕一次.厌氧修复过程中除采样外不做任何干扰.每个试验设3个平行试验.每14 d通过五点采样法采混合土样15 g用于指标分析, 修复前和修复第0 d的土壤样品分析包含添加的矿化垃圾.
2.4 数据处理文中数据的整理和统计学分析分别采用Excel 2019和SPSS 20软件；试验结果绘图采用Origin 9软件；采用单因素方差分析法(One-Way ANOVA)分析不同处理之间的差异显著性, p＜0.05时认为处理之间差异显著.
3 结果与讨论(Results and discussion)3.1 氧气条件对土壤TPH降解的影响不同氧气条件下TPH在土壤中的残余量和去除率的变化趋势如图 1所示.结果显示, 3组试验对微生物修复石油污染土壤都有较好的强化效果, TPH的去除率都远大于石油污染土壤的自然衰减试验(TPH去除率22.40%)(Liu et al., 2018).好氧修复试验的土壤TPH去除效果最好(85.56%), 其次为厌氧-好氧修复试验(78.46%), 厌氧修复试验的TPH去除效果最差, 为77.28%.好氧处理的最终TPH去除率与其它两组处理之间有差异显著(p＜0.05), 而厌氧处理和厌氧-好氧处理的最终TPH去除率无显著差异(p＞0.05).整体来说, 3种氧气条件下TPH的去除速率在修复的前28 d最快.好氧修复试验中, TPH的去除率在修复70 d后增加十分缓慢, 基本保持不变.厌氧修复实验中, TPH的去除率在修复84 d后趋于稳定.厌氧-好氧修复试验在由厌氧条件改变为好氧条件后的14 d内, TPH的去除率快速增加了9.23%, 随后也趋于稳定.
图 1(Fig. 1)
 |
| 图 1 不同氧气条件下矿化垃圾对土壤TPH的去除效果 (误差棒表示标准差(n=3), 下同；不同字母表示同一时间不同处理之间差异显著(p＜0.05)) Fig. 1Removal effect of TPH in soil by using aged refuse under different oxygen conditions |
尽管3种修复试验都大大减少了土壤中石油类污染物的种类和含量, 但不同氧气条件修复试验去除的污染物种类和去除效果有明显差异(图 2).厌氧试验对低分子石油类污染物的去除效果明显低于好氧试验, 而对高分子石油类污染物的去除效果要优于好氧试验.通常高分子石油类污染物的生物可利用性较差, 相应的生态毒性也比低分子石油类污染物小(Khan et al., 2018).厌氧-好氧试验综合了这两种修复过程, 原设想厌氧-好氧试验对土壤中的低分子和高分子石油类污染物都能有较好的去除效果, 然而实际修复试验的结果并非如此.厌氧-好氧修复试验对TPH的去除率虽然略高于厌氧试验, 却低于好氧试验.对低分子和高分子石油类污染物的降解效果也都处于两者之间.这可归因于厌氧-好氧修复试验会大幅降低土壤中营养元素的含量(表 2), 从而降低了土壤石油降解菌的数量和活性(Varjani et al., 2017).其次, 经过56 d的厌氧修复试验后, 除石油类污染物外, 土壤中的其他有机物含量也大大降低, 进而降低了石油降解菌的生长繁殖和代谢活性.另外, 降解环境中的石油类物质含量应有一个适当的范围.很多有机物虽然在中等浓度下容易被微生物降解, 但在低浓度时却并不容易被降解.因为当污染物以低浓度出现时, 由于缺乏酶的诱导, 低浓度会成为生物降解的限制因子(祝威, 2010).
图 2(Fig. 2)
 |
| 图 2 不同氧气条件下土壤修复前后石油类污染物的气相色谱图 Fig. 2Gas chromatogram of petroleum contaminants in soil samples before and after treatments under different oxygen conditions |
表 1(Table 1)
| 表 1 基于GC-MS分析的修复后土壤石油类污染物的去除率 Table 1 The removal rate of petroleum contaminants in soil samples after remediation based on GC-MS analysis | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 1 基于GC-MS分析的修复后土壤石油类污染物的去除率 Table 1 The removal rate of petroleum contaminants in soil samples after remediation based on GC-MS analysis
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 2(Table 2)
| 表 2 修复前后土壤理化性质 Table 2 Physicochemical properties of soil samples before and after remediation | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 2 修复前后土壤理化性质 Table 2 Physicochemical properties of soil samples before and after remediation
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
修复前后土壤石油族组分的相对丰度见图 3, 基于GC-MS分析的修复后土壤石油类污染物的去除率见表 1.结果表明, 修复前土壤石油类污染物以链烷烃为主, 石油族组分的相对丰度排序为：链烷烃(81.28%)>石油衍生物(11.37%)>芳香烃(3.67%)>环烷烃(2.72%)>烯烃(0.96%).好氧修复对链烷烃、烯烃、芳香烃和芳香烃衍生物的去除效果最好, 芳香烃和烯烃的去除率达到了100%, 其次为厌氧-好氧修复, 厌氧修复效果最差.但厌氧修复对分子量较大的环烷烃、环烷烃衍生物和含氮杂环衍生物的降解转化效果最好, 优于好氧修复.厌氧-好氧修复试验对石油类污染物的去除率基本介于厌氧试验和好氧试验之间.修复后, 好氧试验土壤中石油类污染物以石油烃衍生物为主, 而厌氧试验和厌氧-好氧试验土壤中仍以链烷烃为主.好氧试验降解过程中新增污染物主要为环烷烃、含卤有机物和含氮杂环有机物；厌氧试验降解过程中新增污染物主要为支链烷烃、环烷烃和含氧环状有机物；厌氧-好氧试验降解过程中新增污染物最少, 主要为含氧环状有机物.在石油类污染物中, 芳香烃的毒性最大, 多具有较大的毒性和致癌性, 其次为烯烃, 链烷烃和高分子石油烃衍生物的生态毒性很小.低分子石油类污染物因具有较高的生物可利用性, 其生态毒性往往大于高分子石油类污染物(Khan et al., 2018b).所以总体而言, 好氧降解产物的生态毒性低于厌氧降解产物.
图 3(Fig. 3)
 |
| 图 3 不同氧气条件下土壤修复前后石油族组分的相对丰度 Fig. 3Relative abundance of petroleum group components in soil samples before and after treatments under different oxygen conditions |
3.2 氧气条件对土壤理化性质的影响表 2为修复前后3组试验土壤的理化性质.结果显示, 修复后3组试验土壤的pH值都升高, 且都与修复前土壤pH值呈差异显著(p＜0.05), 为微碱性, 其中, 厌氧试验土壤pH值最低.营养元素方面, 修复后厌氧和好氧试验土壤的总氮含量略微下降, 厌氧-好氧试验土壤的总氮含量大幅降低, 这是因为厌氧-好氧条件有利于土壤微生物脱氮(郑平等, 1997).修复后3组试验土壤的有效氮和有效磷含量都下降, 其中, 厌氧-好氧试验的有效氮含量降幅最大, 厌氧试验的有效氮含量降幅最小, 3组试验土壤的有效磷含量都下降了50%左右, 3组试验之间的有效磷含量无显著差异(p＞0.05).营养元素含量太低会制约土壤石油类污染物的生物降解(Varjani et al., 2017).修复后3组试验土壤的有机质含量都大幅下降, 其中, 好氧条件下的有机质含量最低.过低的有机质含量也会降低土壤石油类污染物的降解速率(Azambuja et al., 2017).
3.3 氧气条件对种子发芽率的影响表 3为修复前后3组试验土壤的种子发芽率.由于添加矿化垃圾已大幅降低了石油污染土壤的生态毒性, 污染土壤对小麦种子的发芽率没有表现出抑制作用(Liu et al., 2018).本研究挑选了对石油类污染物更敏感的翅碱蓬和黑麦草种子进行发芽试验来表征石油污染土壤的生态毒性.结果显示, 修复后3组试验土壤的生态毒性都大幅改善, 其中, 好氧试验的土壤生态毒性最低, 厌氧试验的土壤生态毒性最高.这是因为好氧试验的TPH最终去除率最高, 且降解产物主要为生态毒性较低的高分子石油类污染物；而厌氧试验的TPH最终去除率最低, 降解产物中生态毒性较高的低分子石油类污染物含量也最高.
表 3(Table 3)
| 表 3 修复前后种子发芽率 Table 3 Seed germinate rates before and after remediation | ||||||||||||||||||||||||
表 3 修复前后种子发芽率 Table 3 Seed germinate rates before and after remediation
| ||||||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||||||
3.4 氧气条件对土壤FDA水解酶活性的影响FDA水解酶活性是很多胞外酶和胞内酶的总活性, 如酯酶、脂肪酶和蛋白酶等非专一性酶(Adam et al., 2001).因此, FDA的水解速率常被用来表征土壤有机物的转化、土壤微生物量和土壤微生物的总活性.不同氧气条件修复试验过程中土壤FDA水解酶活性随修复时间的变化如图 4所示.总体来说, 在修复的前28 d, 3组试验的FDA水解酶活性都快速升高, 并在第28 d达到最高值, 随后FDA水解酶活性波动下降直到修复结束.在TPH浓度快速降低的前70 d, 好氧修复试验的FDA水解酶活性高于厌氧修复试验, 说明这期间好氧修复试验的微生物代谢活性要高于厌氧修复试验, 这与其他****的研究结果一致(祝威, 2010).因此, 这期间好氧试验的TPH生物降解效果优于厌氧试验.在70 d后, 厌氧修复试验的FDA水解酶活性又快速增加, 可能由于厌氧降解将大分子的有机物转化为易生物降解的小分子有机物后, 刺激了微生物的代谢活动, 相应的厌氧试验的TPH去除率也明显提高.修复前56 d, 厌氧-好氧修复试验的FDA水解酶活性与厌氧修复试验无显著差异(p＞0.05), 这与TPH的降解效果一致.在厌氧条件转化为好氧条件后, 酶活性开始增加并超过了其它两组修复试验的酶活性, 但不久也急剧下降直到修复结束.修复后期3组修复试验的FDA水解酶活性都较低, 导致3组试验的TPH去除率都趋于稳定.这可能是由于营养元素含量的限制, 厌氧-好氧修复试验的FDA水解酶活性最低, 与其它两组试验之间差异显著(p＜0.05).
图 4(Fig. 4)
 |
| 图 4 不同氧气条件下修复过程中土壤FDA水解酶活性的动态变化 (不同字母表示同一时间不同处理之间差异显著(p＜0.05)) Fig. 4Changes in FDA hydrolytic activities in contaminated soil samples under different oxygen conditions during bioremediation |
3.5 氧气条件对土壤微生物的影响图 5为不同氧气条件修复试验前、中、后期试验土壤样品的微生物α多样性指数.在细菌方面, 总体来说, 厌氧条件下土壤微生物的多样性比好氧条件下更高.修复前期石油污染土壤的微生物多样性很高, 这是因为矿化垃圾的细菌多样性很高(Liu et al., 2018), 矿化垃圾的添加丰富了石油污染土壤的微生物种类.在修复第28 d, 3组修复试验的微生物多样性都有所降低, 原因可能是石油类污染物的生物毒性抑制了部分微生物的生长, 只有能够适应环境的石油降解菌成为优势菌.好氧修复试验的微生物多样性低于其它两组修复试验.在修复结束后厌氧试验和厌氧-好氧试验的微生物多样性都有所增加, 而好氧修复试验的微生物多样性却进一步将降低.可能因为修复后土壤石油类污染物生态毒性降低, 厌氧试验和厌氧-好氧试验中易降解有机物含量要高于好氧试验.好氧修复试验后土壤有机物主要为高分子多环或杂环有机物, 能作为微生物碳源的易降解有机物含量太低.真菌微生物多样性基本与细菌多样性变化保持一致, 但在好氧修复试验后, 真菌微生物多样性反而变高.这是因为好氧修复后土壤石油类污染物以难降解的高分子有机物为主, 而很多真菌比细菌更易降解难降解有机物(Kadri et al., 2017).
图 5(Fig. 5)
 |
| 图 5 不同氧气条件试验土壤的微生物α多样性指数 (不同小写字母表示第28 d不同处理之间差异显著(p＜0.05)；不同大写字母表示第112 d不同处理之间差异显著(p＜0.05)) Fig. 5Microbial α diversity indices of treatment samples under different oxygen conditions |
研究表明, 在未受石油污染的土壤中, 石油降解菌占比一般只占微生物群落的1%, 而受污染土壤中石油降解菌的占比和数量明显上升, 石油降解菌的相对占比超过90%(Elsavage et al., 1989).纲水平上不同氧气条件修复试验土壤样品的微生物群落结构如图 6所示.在细菌方面, 修复前土壤细菌以变形菌门(Proteobacteria)为主, 变形菌门总占比为44.62%, 其中, β-变形菌纲占比最高(23.83%), 放线菌纲(Actinobacteria)、α-变形菌纲和γ-变形菌纲的相对丰度也较高.在修复第28 d, 3组修复试验中放线菌纲的占比都大大增加, γ-变形菌纲和β-变形菌纲的占比仍然较高.这说明放线菌纲、β-变形菌纲和γ-变形菌纲不管在厌氧还是好氧条件下, 都是石油类污染物降解的优势菌.但放线菌纲和γ-变形菌纲在好氧修复试验中较其它两组试验更高一些.很多****的研究也证明了石油污染土壤中的优势细菌都为放线菌和变形菌, 但基本都是在好氧生物修复中(Meeboon et al., 2017; Azambuja et al., 2017).
图 6(Fig. 6)
 |
| 图 6 不同氧气条件下修复试验土壤样品的细菌和真菌群落水平图 (纲水平, “Others”为相对占比较低和未定名的微生物) Fig. 6Dominant bacteria and fungi at class level in treatment samples under different oxygen conditions |
由表 4可知, 在属水平上, 好氧试验和厌氧试验的土壤群落结构差异巨大.好氧条件下, 土壤优势细菌为石油烃降解菌, 如诺卡式菌属、类诺卡式菌属、藤黄色单胞菌属等, 主要降解链烷烃、芳香烃和环烷烃等石油烃类污染物.而厌氧条件下的土壤优势细菌为石油烃衍生物降解菌, 如红游动菌属、贪噬菌属、厌氧粘细菌属等, 主要降解含卤有机物、含氮有机物、芳香烃衍生物和杂环衍生物等.这也导致修复后好氧试验土壤污染物以石油烃衍生物为主, 而厌氧试验以石油烃(链烷烃)为主.由于好氧试验的细菌多样性低于厌氧试验, 好氧试验的优势菌属种类少于厌氧试验, 好氧细菌中诺卡式菌属和类诺卡式菌属占比都超过了10%, 而厌氧细菌中没有占比超过10%的优势菌属.未鉴定到属的好氧细菌占比为28.74%, 未鉴定到属的厌氧细菌占比高达51.91%, 这说明目前对石油降解菌尤其是厌氧石油降解菌的研究还不够多.在修复结束后, β-变形菌和γ-变形菌在厌氧修复试验中的占比仍然最高, 但放线菌的占比大大降低, 而α-变形菌、厌氧绳菌纲(Anaerolineae)和纤维粘网菌纲(Cytophagia)的占比增大.厌氧绳菌在厌氧条件下具有降解碳水化合和其他细胞材料(如氨基酸)的作用, 是一种代表性的产氢产乙酸菌(Margesin et al., 2007).好氧修复试验中的放线菌和γ-变形菌的相对丰度进一步增加, 其它变形菌纲的占比大大降低.厌氧-好氧修复试验中放线菌纲、β-变形菌纲和γ-变形菌纲都有所减少, α-变形菌纲、酸微菌纲(Acidimicrobiia)和浮霉菌纲(Planctomycetia)占比增大.δ-变形菌纲占比大于其它试验, 这是因为厌氧修复试验中的石油类污染物的厌氧降解多与硫循环的过程耦合, 而δ-变形菌纲大多参与硫酸盐还原过程(Moretto et al., 2005).
表 4(Table 4)
| 表 4 各优势细菌属降解石油类污染物的研究现状 Table 4 Research status of the biodegradation of petroleum pollutants by dominant bacterium | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 4 各优势细菌属降解石油类污染物的研究现状 Table 4 Research status of the biodegradation of petroleum pollutants by dominant bacterium
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
在真菌方面, 由于试验土壤真菌多样性较低, 所以土壤真菌中的优势菌比较单一, 尤其是厌氧试验土壤.粪壳菌纲(Sordariomycetes)在所有土壤样品中的占比都最高, 属于绝对优势菌, 尤其在修复第28 d的土壤和修复后的厌氧试验土壤中.散囊菌纲(Eurotiomycetes)在修复前试验土壤、修复后的好氧试验和厌氧-好氧修复试验土壤中的占比也很高.这两类真菌中的多种真菌都被报道过可以降解石油类污染物(Zafra et al., 2014).修复第28 d, 好氧和厌氧条件下土壤优势真菌属都为柄孢壳属(Zopfiella)和假霉样真菌属(Pseudallescheria).虽然真菌也能降解土壤石油类污染物, 但由于土壤真菌的数量较少, 约为土壤微生物总量的1%, 土壤中石油类污染物主要被细菌降解(Liu et al., 2018).
4 结论(Conclusions)1) 在厌氧、好氧和厌氧-好氧3种氧气条件下, 添加矿化垃圾对微生物修复石油污染土壤都有显著的促进作用.其中, 好氧修复后TPH的去除率最高(85.56%), 土壤生态毒性最小.厌氧修复后TPH去除率最低(77.28%), 且土壤生态毒性最大.由于营养元素匮乏等修复条件的限制, 修复后厌氧-好氧试验的TPH去除率(78.46%)和土壤生态毒性介于厌氧条件和好氧条件之间.
2) 好氧条件下, 小分子石油类污染物的降解效果最好, 链烷烃、烯烃、芳香烃和芳香烃衍生物的去除率最高, 修复后土壤环烷烃、含卤有机物和含氮杂环有机物含量增加.而厌氧条件下, 大分子石油类污染物的降解效果最好, 环烷烃、环烷烃衍生物和含氮杂环有机物的去除率最高, 修复后土壤支链烷烃、环烷烃和含氧环状有机物含量增加.
3) 好氧条件下土壤微生物总活性最高, 厌氧条件下土壤微生物多样性最高.
4) 好氧条件下优势细菌属主要为石油降解菌；而厌氧条件下优势细菌属主要为石油烃衍生物降解菌.
参考文献
| Adam G, Duncan H. 2001. Development of a sensitive and rapid method for the measurement of total microbial activity using fluorescein diacetate (FDA) in a range of soils[J]. Soil Biology & Biochemistry, 33(7): 943-951. |
| Al-Hawash A B, Dragh M A, Li S, et al. 2018. Principles of microbial degradation of petroleum hydrocarbons in the environment[J]. The Egyptian Journal of Aquatic Research, 44(2): 71-76. DOI:10.1016/j.ejar.2018.06.001 |
| Azambuja A O D, Bücker F, Quadros P D D, et al. 2017. Microbial community composition in Brazilian stored diesel fuel of varying sulfur content, using high-throughput sequencing[J]. Fuel, 189: 340-349. DOI:10.1016/j.fuel.2016.10.108 |
| Bers K, Leroy B, Breugelmans P, et al. 2011. A novel hydrolase identified by genomic-proteomic analysis of phenylurea herbicide mineralization by Variovorax sp.strain SRS16[J]. Appl Environ Microbiol, 77(24): 8754-8764. DOI:10.1128/AEM.06162-11 |
| Elsavage R E, Sexstone A J. 1989. Biodegradation of a dilute waste oil emulsion applied to soil[J]. Journal of Industrial Microbiology, 4(4): 289-298. DOI:10.1007/BF01577352 |
| Feng S, Lin X, Tong Y, et al. 2018. Biodesulfurization of sulfide wastewater for elemental sulfur recovery by isolated Halothiobacillus neapolitanus in an internal airlift loop reactor[J]. Bioresource Technology, 264: 244-252. DOI:10.1016/j.biortech.2018.05.079 |
| 华苟根, 郭坚华. 2003. 红球菌属的分类及应用研究进展[J]. 微生物学通报, 30(4): 107-111. DOI:10.3969/j.issn.0253-2654.2003.04.027 |
| Heider J, Boll M, Breese K, et al. 1998. Differential induction of enzymes involved in anaerobic metabolism of aromatic compounds in the denitrifying bacterium Thauera aromatica[J]. Archives of Microbiology, 170(2): 120-131. DOI:10.1007/s002030050623 |
| Jayapal M, Jagadeesan H, Shanmugam M, et al. 2018. Sequential anaerobic-aerobic treatment using plant microbe integrated system for degradation of azo dyes and their aromatic amines by-products[J]. Journal of Hazardous Materials, 354(15): 231-243. |
| 姬广海. 2011. 溶杆菌属及其在植物病害防治中的研究进展[J]. 云南农业大学学报, 26(1): 124-130. DOI:10.3969/j.issn.1004-390X(n).2011.01.022 |
| Kadri T, Rouissi T, Brar S K, et al. 2017. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) by fungal enzymes:A review[J]. Journal of Environmental Sciences, 29(1): 52-74. |
| Khan M A I, Biswas B, Smith E, et al. 2018. Toxicity assessment of fresh and weathered petroleum hydrocarbons in contaminated soil- a review[J]. Chemosphere, 212(12): 755-767. |
| Kim S J, Ahn J H, Weon H Y, et al. 2016. Lysobacter rhizosphaerae sp.nov., isolated from rhizosphere of tomato[J]. International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology, 67(5): 1102-1106. |
| Li Y Q, Liu H F, Tian Z L, et al. 2008. Diesel pollution biodegradation:synergetic effect of mycobacterium and filamentous fungi[J]. Biomedical & Environmental Sciences, 21(3): 181-187. |
| 刘凤枝, 李玉浸. 2015. 土壤监测分析技术[M]. 北京: 化学工业出版社, 519-534. |
| 刘君.2008.苯并芘污染土壤的微生物效应及其降解菌特性的研究[D].呼和浩特: 内蒙古大学 |
| Liu Q, Li Q, Wang N, et al. 2018. Bioremediation of petroleum-contaminated soil using aged refuse from landfills[J]. Waste Management, 77(7): 576-585. |
| 马聪, 秦丹, 孙倩, 等. 2015. 耐盐类固醇激素降解菌交替赤杆菌MH-B5的降解特性、降解途径及其固定化[J]. 环境科学, 36(12): 329-336. |
| 马晓丹, 高灵芳, 谭文博, 等. 2015. 一株异养脱硫反硝化菌株的筛选及其生物脱硫脱氮特性研究[J]. 微生物学通报, 42(5): 853-857. |
| Mahmoud G A E, Bagy M M K. 2019. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons[J]. Microbial Action on Hydrocarbons, 9(2): 299-320. |
| Margesin R, H?¤Mmerle M, Tscherko D. 2007. Microbial activity and community composition during bioremediation of diesel-oil-contaminated soil:effects of hydrocarbon concentration, fertilizers, and incubation time[J]. Microbial Ecology, 53(2): 259-269. DOI:10.1007/s00248-006-9136-7 |
| Meeboon N, Leewis M C, Kaewsuwan S, et al. 2017. Changes in bacterial diversity associated with bioremediation of used lubricating oil in tropical soils[J]. Archives of Microbiology, 199(6): 839-851. DOI:10.1007/s00203-017-1356-3 |
| Moretto L M, Silvestri S, Ugo P, et al. 2005. Polycyclic aromatic hydrocarbons degradation by composting in a soot-contaminated alkaline soil[J]. Journal of Hazardous Materials, 126(1): 141-148. |
| Nalin R, Simonet P, Vogel T M, et al. 1999. Rhodanobacter lindaniclasticus gen.nov., sp.nov., a lindane-degrading bacterium[J]. Int J Syst Bacteriol, 49(1): 19-23. DOI:10.1099/00207713-49-1-19 |
| 乔能虎, 张静静, 刘德健, 等. 2017. 陶厄氏菌Thauera sp.K11对酚类化合物降解作用及途径研究[J]. 生物技术通报, 10: 184-190. |
| Sanford R A, Cole J R, Tiedje J M. 2002. Characterization and description of Anaeromyxobacter dehalogenans gen.nov., sp.nov., an aryl-halorespiring facultative anaerobic Myxobacterium[J]. Applied & Environmental Microbiology, 68(2): 893-900. |
| Seo J S, Keum Y S, Li Q X. 2009. Bacterial degradation of aromatic compounds[J]. International Journal of Environmental Research & Public Health, 6(1): 278-309. |
| Shen W, Zhu N, Cui J, et al. 2016. Ecotoxicity monitoring and bioindicator screening of oil-contaminated soil during bioremediation[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 124(2): 120-128. |
| 沈晓莉, 王健鑫, 陈小龙, 等. 2009. 一株对硝基苯胺降解菌Microbacterium sp.PNA8的分离鉴定及其降解条件研究[J]. 微生物学通报, 36(10): 1496-1500. |
| 宋朝霞, 张颖, 堵国成, 等. 2006. 一株产聚乙烯醇降解酶的紫色杆菌的发酵条件研究[J]. 高校化学工程学报, 20(5): 769-774. DOI:10.3321/j.issn:1003-9015.2006.05.018 |
| 孙勇, 张金兰, 刘鸿儒, 等. 2016. 紫色杆菌素及脱氧紫色杆菌素的基因毒性评价[J]. 食品科学, 526(9): 232-237. |
| 唐景春. 2015. 石油污染土壤生态修复技术与原理[M]. 北京: 科学出版社, 39-48. |
| Varjani S J, Upasani V N. 2017. A new look on factors affecting microbial degradation of petroleum hydrocarbon pollutants[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 120: 71-83. |
| 王宝山, 温成成, 孙秦川, 等. 2018. 石油烃类污染对青藏高原北麓河地区冻区土壤微生物多样性的影响[J]. 环境工程学报, 12(10): 207-218. |
| 王东梅.2015.渗滤液反渗透浓缩液回灌系统中盐分的控制研究[D].成都: 西南交通大学 |
| 于淼. 2017. 矿化垃圾治理技术的应用[J]. 再生资源与循环经济, 10(6): 34-36. DOI:10.3969/j.issn.1674-0912.2017.06.012 |
| Zafra G, Absalón á E, Cuevas M D C, et al. 2014. Isolation and selection of a highly tolerant microbial consortium with potential for PAH biodegradation from heavy crude oil-contaminated soils[J]. Water Air & Soil Pollution, 225(2): 126-136. |
| Zhang J, Zheng J W, Hang B J, et al. 2011. Rhodanobacter xiangquanii sp.nov., a novel anilofos-degrading bacterium isolated from a wastewater treating system[J]. Current Microbiology, 62(2): 645-649. DOI:10.1007/s00284-010-9757-4 |
| 张通, 吴琼, 刘柯澜, 等. 2009. 微杆菌对乌海高硫煤中有机硫脱除的研究[J]. 煤炭学报, (7): 957-960. DOI:10.3321/j.issn:0253-9993.2009.07.019 |
| 赵燕, 薛林贵, 李琳, 等. 2012. 丛毛单胞菌在环境污染物降解方面的研究进展[J]. 微生物学通报, 39(10): 1471-1478. |
| 赵由才, 柴晓利, 牛冬杰. 2006. 矿化垃圾基本特性研究[J]. 同济大学学报, (10): 86-90. |
| 郑平, 胡宝兰. 1997. 生物脱氮技术的研究进展[J]. 环境污染与防治, 19(4): 25-28. |
| 祝威. 2010. 石油污染土壤和油泥生物处理技术[M]. 北京: 中国石化出版社, 23-38. |
