植物天然产物作为内源性小分子参与了自身重要生理活动，例如调控植物自身的生长发育和抵御病虫害，同时也是治疗人类重大疾病的创新药物分子的主要来源。因此，解析植物天然产物的生物合成途径对于植物生物学、生态学研究和开发创新药物治疗人类重大疾病都具有重要意义。然而由于植物自身的特点（生长缓慢、基因组庞大），以及参与生物合成的基因往往不成簇分布的现象，植物天然生物合成研究方法有限，进展缓慢。在本文中，雷晓光课题组开发出一种基于天然生物合成中间体分子探针（Biosynthetic Intermediate Probes，BIPs）的靶标垂钓策略（如图1所示），并与合作者一起通过结合植物天然产物生物合成研究中的常规手段（活性导向蛋白分离以及转录组测序等方法），成功在桑树愈伤组织中鉴定出两个FAD依赖蛋白（MaMO和MaDA），其中MaDA被进一步证明为自然界中存在的首个催化分子间Diels-Alder反应的单功能酶。该基于“天然产物生物合成中间体分子探针”的化学生物学研究策略，为解析植物天然产物生物合成途径提供了新的研究思路。
图1.桑树中D-A类型天然产物可能的生物合成途径以及基于生物合成中间体探针的靶点垂钓
自1928年，德国化学家Otto Diels和他的学生Kurt Alder首次报道了Diels-Alder反应（简称DA反应）（Justus Liebigs Ann. Chem.1928,460, 98-122），他们就推测很多天然产物可以通过DA反应来构建，暗示了在自然界可能存在催化该反应的酶——Diels-Alder反应酶（Diels-Alderase）。由于DA反应是合成化学中构建C-C键最常用的方法之一，被广泛应用在天然产物和药物分子的合成中，因此，Otto Diels和Kurt Alder一起分享了1950年的诺贝尔化学奖。不过到目前为止，科学界发现的Diels-Alderase并不多，以催化分子内DA反应为主，能催化分子间DA反应的酶更是屈指可数，并且这有限几种分子间Diels-Alderase并不是只催化分子间DA反应，还催化其他化学反应。那么，自然界中是否存在“真正意义”的分子间DA反应酶？
在成功鉴定出MaDA后，作者进一步探索了其底物适应性，并对该酶促分子间Diels-Alder反应的机理进行了深入探讨。作者通过DFT计算证明了该非酶促的Diels-Alder反应是通过协同但不同步的反应机理进行的，随后通过对该酶促分子间Diels-Alder反应进行KIE实验，验证了该酶促反应过程是通过协同但不同步的反应机理进行的，这证明了MaDA是真正意义上的单功能分子间Diels-Alder反应酶。为了进一步探索MaDA的催化机制，雷晓光课题组成功解析了MaDA的晶体结构（2.3 ?），并在此基础上进行了分子对接以及定点突变实验。结果显示，F375、R443、F356、I259以及Y192对于维持MaDA的活性至关重要。同时，作者还发现氧化态的FAD对于MaDA的活性也非常重要，如图2所示。
图2.基于MaDA晶体结构的分子对接以及点突变实验揭示了MaDA与底物形成相互作用的关键位点
综上所述，研究者通过活性导向蛋白分离，基于生物合成中间体探针（BIPs）的靶点垂钓和转录组分析相结合的策略成功在桑树愈伤组织中鉴定了两个FAD依赖的蛋白——MaMO和MaDA。其中，MaDA为首例催化分子间[4+2]环化反应的单功能酶。作者通过DFT以及KIE实验证明了该酶促反应为协同但不同步的Diels-Alder反应，因此MaDA是首个从自然界中发现的、催化分子间反应的Diels-Alder反应酶，从而结束了学术界一直存在的“自然界是否有真正意义DA反应酶”的争论。作者还成功解析了MaDA的晶体结构，并初步阐明了底物和蛋白相互作用的机制。此外，MaDA有很好的底物宽泛性，利用MaDA实现了多种D-A类型天然产物的酶法合成。该酶法合成展现出普通化学方法难以实现的高效性与立体化学专一性，体现了MaDA在生物催化中的优势和特点，为发展酶催化合成方法来高效制备结构多样的功能有机分子开辟了新的研究方向。此外，本研究所提出的基于天然产物生物合成中间体分子探针（BIPs）靶点发现的化学生物学研究手段也会为阐明天然产物生物合成途径、发现新颖的生物合成酶提供新的研究方法与思路。最后，该类药用植物来源天然产物生物合成途径的解析也为后继合成途径重建，实现植物天然产物的微生物异源生物合成，并开展结构衍生化研究，提升功能活性铺平了道路。
在本工作中，雷晓光课题组高磊博士、戴均贵课题组苏聪博士、雷晓光课题组杜晓霞博士以及黄璐琦课题组王瑞杉博士为共同第一作者。雷晓光、戴均贵和黄璐琦为共同通讯作者。北京生命科学研究所的周宇博士和黄牛研究员，以及UCLA的Chen Shuming博士和K. N. Houk教授在计算模拟、DFT计算方面作出了重要贡献。此外，北京生命科学研究所的陈涉研究员，中国中医科学院的郭兰萍研究员，北海道大学的Oikawa教授、Minami副教授和刘成伟助理教授，以及帝京平成大学的Hano教授和Shimazaki教授也在质谱分析、转录组分析和酶活测试等方面提供了重要帮助。该工作得到国家自然科学基金、国家科技部重点研究发展计划、北京市“卓越青年科学家计划”、北京分子科学国家研究中心、北大-清华生命科学联合中心、天然药物活性物质与功能国家重点实验室等多个国家重大科研项目和研究机构的资助。高磊目前得到了北大-清华生命科学联合中心杰出博士后基金的资助。
