2020年4月27日，北京大学化学与分子工程学院贾桂芳该课题组在Nature子刊Nature Chemical Biology在线发表了题为“Antibody-free enzyme-assisted chemical approach for detection ofN⁶-methyladenosin”的研究论文，首次报道了利用FTO酶辅助实现了RNA修饰m⁶A的化学标记，并成功应用于全转录组m6A的高通量测序。

论文截图
随着首个RNA修饰N⁶-甲基腺嘌呤（m⁶A）的去修饰酶FTO的发现，RNA表观遗传学/表观转录组学开始兴起并成为表观遗传学新的研究热点。m⁶A作为首个被发现的可逆RNA修饰，广泛存在于mRNA，依赖修饰酶、去修饰酶和结合蛋白发挥调控功能。已发现m⁶A具有调控mRNA剪接、出核、稳定性和蛋白翻译等功能，可以参与发育、配子发生、细胞重编程、生物节律、疾病等多种生理和病理过程的功能调控。为了更好地研究m⁶A生物功能和临床病理研究，开发m⁶A高通量测序技术一直是研究的热点。
现有m⁶A测序技术主要依赖于m⁶A抗体富集技术，包括低分辨率的m⁶A-seq/MeRIP-seq和联用iCLIP或PAR-CLIP技术的高分辨率m⁶A测序技术miCLIP或PA-m⁶A-seq。抗体存在对特定RNA序列或结构的潜在非特异性结合，为了解决抗体方法的种种问题，研究者们做出了各种尝试，近期开发了两类无需抗体的m⁶A测序技术，一类为利用对特定甲基化序列（m⁶ACA）敏感的RNA核酸内切酶MazF辅助的测序方法（m⁶A-REF-seq or MAZTER-seq），此类方法只能检测16~25%的m⁶A位点；另一种是在细胞内表达融合m⁶A-binding domain（YTH）与胞嘧啶脱氨酶（APOBEC1）的融合蛋白实现的m⁶A测序（DART-seq），但该方法依赖于细胞转染效率且受限于体外样品的使用。
贾桂芳课题组一直致力于开发和利用核酸化学生物学技术研究RNA化学修饰在动植物中的生物功能研究。在本课题中，贾桂芳课题组巧妙地利用m⁶A的去甲基酶FTO蛋白作为催化剂，将mRNA上化学惰性的m⁶A转化为高反应活性的中间态产物N6-羟甲基腺嘌呤（hm⁶A），然后利用二硫苏糖醇（DTT）的巯基与hm⁶A发生亚胺1,2加成反应，将不稳定的hm⁶A转化为更稳定的巯基加成产物dm⁶A。dm⁶A上的自由巯基可以与甲烷硫代磺酸（methanethiosulfonate，MTSEA）快速反应，实现在mRNA上m⁶A的位置标记生物素Biotin，最终可被链霉亲和素珠捕获，从而富集含有m⁶A修饰的RNA片段供后续高通量测序使用。此方法被命名为m⁶A-SEAL（FTO-assistedm6A selective chemical labelingmethod）（见下图）。

m⁶A-SEAL测序流程图
他们将m⁶A-SEAL分别应用于人HEK293T细胞和水稻的polyA+RNA上，实现全转录组m⁶A位点检测。通过该课题组之前开发的基于qPCR的m⁶A单位点检测方法SELECT验证了多个m⁶A位点，证明m⁶A-SEAL作为化学共价交联技术，要比基于抗体的方法或DART-seq具有更高的可靠性和灵敏度。
FTO除m⁶A外，还对RNA5’帽位置的N6,2'-O-二甲基腺嘌呤(capm⁶A_m）具有催化活性，能将其催化为hm⁶A_m。为了验证m⁶A-SEAL测序方法是否还会同时检测cap m⁶A_m，他们通过体外酶活性实验和标记实验发现目前m⁶A-SEAL方法中使用的FTO氧化反应条件只能特异性将m⁶A反应成hm⁶A，通过优化FTO氧化反应条件可以实现m⁶A-SEAL只针对cap m⁶A_m的标记和测序。
总之，该项研究首次利用FTO酶辅助实现了RNA修饰m⁶A化学标记和高通量测序。m⁶A-SEAL具有高灵敏度和高特异性的特点，可以应用于少量mRNA样品。未来他们将继续对m⁶A-SEAL进行优化和改造，以实现单碱基分辨率。由于FTO可以氧化催化RNA的cap m⁶A_m和DNA的N⁶-甲基脱氧腺嘌呤（6mA），未来m⁶A-SEAL通过优化有望应用于这些化学修饰的测序；同时该方法除了可以在m⁶A上标记biotin用于富集，还可以标记荧光素，有潜力应用于m⁶A的成像。
贾桂芳实验室已毕业的博士研究生王烨为论文的第一作者，已毕业的博士研究生肖雨、博士后喻琼和本科生董舜卿为共同作者，贾桂芳研究员为通讯作者。该研究工作得到了国家自然科学基金、科技部重点研发计划、生物有机与分子工程教育部重点实验室、北京分子科学国家研究中心及上海药物所新药研究国家重点实验室开放课题等经费的支持。