最近，工学院生物医学工程系陈匡时课题组基于分子信标（MB）与CRISPR/dCas9系统成功研制出一种名为CRISPR/dual-FRET MB的新型活细胞基因成像技术。该研究成果已发表于Nucleic Acids Research（《核酸研究》）（IF = 11.147），题目为“CRISPR/dual-FRET molecular beacon for sensitive live-cell imaging of non-repetitive genomic loci”。

目前，在活细胞中成像基因组主要借助荧光蛋白实现。但是荧光蛋白具有亮度低、光稳定性低等缺点，需要给标记单一基因组位点标记多个荧光蛋白才可实现成像。然而，过度的荧光标记可能会对基因组位点的运动造成影响，因此，目前荧光蛋白方法在成像单基因组位点上的能力有限。许多研究已经表明，有机染料具有比荧光蛋白更高的信号强度与光稳定性，因此，基于有机染料的标记方法有望提高对单基因组位点的成像能力。
陈匡时课题组在先前的研究中已经证实有机染料在活细胞中标记基因组位点的可行性。所采取的手段是将CRISPR sgRNA进行改造，使其能够与一种名为分子信标（MB）的寡核苷酸探针互补（CRISPR/MB: Wu X. et al, Nucleic Acids Res. 2018; 46, e80）。由于sgRNA具有高度可改造性，陈匡时课题组最新的工作进一步改造了sgRNA，使其能够与一对可发生荧光共振能量转移（FRET）的MB互补，构建出CRISPR/dual-FRET MB（图1）。由于只有当两个MB同时互补于同一个sgRNA时FRET信号才能产生，该方法能够更好地区分来自基因组位点的信号与游离MB所造成的背景。实验证明，CRISPR/dual-FRET MB通过三个sgRNA即可在普通宽场显微镜下成像单基因组位点（图2A），并且能区分不同基因组位点（MUC4, MUC1, IGR）的运动（图2B）。值得一提的是，CRISPR/dual-FRET MB 是首个被报道的、仅需3个sgRNA 就能在宽场显微镜下成像单基因组位点（非重复序列）的技术。此外，CRISPR/dual-FRET MB的分子量比现有最灵敏的CRISPR 标记技术（基于荧光蛋白）小6倍以上，因此可能对被标记位点的生物学功能造成较小的影响。CRISPR/dual-FRET MB的应用有望帮助研究者对染色质高级结构的时空动态变化进行更深入细致的阐述。

图1.CRISPR/dual-FRET MB的工作原理

图2. 利用CRISPR/dual-FRET MB在细胞中检测单基因组位点。A) CRISPR/dual-FRET MB通过3个sgRNA在宽场显微镜下成像单基因组位点（MUC4）。CRISPR/dual-FRET MB比CRISPR/MB具有更高的信噪比。B) CRISPR/dual-FRET MB可区分不同基因组位点（MUC4, MUC1, IGR）的运动
该工作的第一作者为工学院2017级博士生毛诗琦。工学院2019级博士生应亚宸、生命科学学院2015级博士生吴小天和PKU/GT/Emory联合培养项目博士生Christopher Krueger为工作的顺利完成作出重要贡献。通讯作者为工学院陈匡时特聘研究员。此项工作得到了国家重点研发计划和国家自然科学基金的支持。