如何诱导获得功能成熟的细胞并在体外保持其功能性是再生医学的关键瓶颈。研究团队致力于在体外获得大量功能性细胞。在个体发育过程中，多种发育信号精确调控，分化产生功能各异的细胞并长期稳定地维持其生理功能。然而，这些功能细胞一旦离开体内微环境便会迅速去分化并失去功能。此外,由于缺乏适当的培养条件与微环境，体外源于干细胞诱导分化所获得的功能细胞，很难真正成熟并长期维持其功能，是再生医学研究和应用中长期面临的挑战。过去几十年里，人们尝试了改变培养材料、共培养及三维培养等多种方法，但始终未能建立一个简单高效且稳定的功能细胞体外培养体系。为解决这一问题，邓宏魁课题组组以体外培养过程中快速失去功能的人原代肝细胞为研究对象，筛选到五种化学小分子组合（5 compounds，5C）并利用它们在体外成功实现了肝细胞功能的长期维持。在超过一个月的培养过程中，5C组合抑制了肝细胞的去分化，细胞整体基因表达谱与体内肝细胞高度相似，并长期维持了白蛋白分泌、尿素合成、药物代谢等肝细胞功能。
人原代肝细胞在五个化学小分子的协同作用下，能够在体外长期维持功能。这些长期维持功能的人肝细胞在药物研发方面具有广泛的应用价值；另一方面，它们可以支持乙肝病毒（HBV）完整的病毒复制周期，包括持续的产生共价闭合环状DNA（cccDNA），这为抗乙肝病毒药物提供了理想的高通量筛选模型
肝细胞在体外药物代谢及药物研发方面具有重要的实用价值，然而长期以来功能维持条件的缺失极大限制了肝细胞的应用。在邓宏魁课题组新建立的5C培养体系中，体外培养的肝细胞能合成与体内水平相似的药物代谢酶，并具有长期维持药物代谢的能力，极大拓展了其在药物代谢、药物相互作用和药物毒性等方面的应用。与此同时，研究团队基于5C培养条件，成功建立了乙型肝炎病毒感染模型：持续高水平表达乙肝表面抗原、e抗原、合成乙肝病毒DNA等感染指标，尤其是能够长期稳定产生乙肝病毒复制必需的cccDNA。这一模型的建立，对于乙肝病毒的深入研究与药物研发具有重要意义。我国约有1.2亿人携带乙肝病毒，目前仍无有效的治愈方法。因为乙肝病毒侵入肝细胞后,形成了一种很难被清除的病毒复制模板cccDNA，目前还没有针对这个病毒复制关键靶点的药物。相形之下，丙型肝炎病毒的发现虽然晚于乙肝病毒，但基于有效的体外病毒感染模型已成功筛选并获得治愈丙肝的药物。5C培养条件下的肝细胞支持乙肝病毒的高效感染，并能够长期产生cccDNA，可作为理想的药物筛选模型，为治愈乙型肝炎带来希望。
相比于传统遗传学方法，化学小分子能够实现对多个信号通路靶点的精细调控。过去几年，邓宏魁课题组在化学小分子调控细胞命运方面取得一系列突破性进展：诱导体细胞重编程为多潜能干细胞(CiPS细胞）；诱导皮肤成纤维细胞为功能神经元细胞(CiN）；建立了具备全能性功能特征的多潜能干细胞(EPS细胞)。他们利用化学小分子实现了体外肝细胞功能的长期维持。这项工作表明化学小分子在精细调控细胞命运和功能上的优越性，这一方法也为其它类型细胞体外功能的长期维持提供了新途径。
邓宏魁、卢实春和袁正宏为该论文的共同通讯作者，向晨罡博士、杜媛媛博士与孟高帆博士为该论文的共同第一作者。该工作获得北大-清华生命科学联合中心、国家重点研发计划、国家自然科学基金等支持。
专家点评
闻玉梅（中国工程院院士、复旦大学上海医学院教授，病毒学家，长期从事乙型肝炎病毒持续性感染机理及对策相关研究）
由邓宏魁、卢实春、袁正宏作为共同通讯作者发表于《科学》（Science）杂志的论文:“体外长期维持原代肝细胞功能”,是我国****研究乙肝、丙肝以及其它肝脏疾病机理的一项重大突破。作者们通过用FSK、SB431542、DAPT、IWP2及LDN193189等五种化合物，成功实现了在体外将人肝细胞延长培养至四周。用此技术体外培养的肝细胞，不仅保持了肝细胞的生理功能，最有意义的是，这些在体外维持数周的肝细胞可成功地被乙肝病毒感染，表达HBsAg与HBeAg。通过对比，发现乙肝病毒与丙肝病毒感染过程有较大不同。这一研究最重要的价值是细胞被乙肝病毒感染后，可以完成整个病毒复制周期，包括产生共价闭合环状DNA（cccDNA）；而cccDNA正是目前乙肝病毒难以被清除、疾病难以被治愈的关键。通过这一平台，人们将可更深入提出解决cccDNA的策略。作者们还在这一平台上对现有临床实用的抗乙肝病毒核苷类药物与干扰素进行考核，证实了核苷类药物可抑制经细胞培养的乙肝病毒，经干扰素处理后细胞可上调干扰素激活的基因控制乙肝病毒。用此建立的较长期的人肝细胞体外培养平台，不仅将为研究乙肝治愈推进一大步，还提供了创新性研发抗肝炎病毒药物的重要工具。
孙序序（上海交通大学基础医学院研究员，长期从事肝脏疾病相关研究）
肝脏是体内重要器官，负责代谢、解毒、造血凝血、免疫等功能。肝细胞是占肝脏80-90%的肝实质细胞，是肝脏功能的主要承担者。原代肝细胞分离和体外培养为模拟肝脏疾病和分子机制研究提供了重要方法和材料。但是新鲜分离得到的原代肝细胞体外培养只能维持10-14天，过程中肝细胞功能会快速丧失，随后变成纤维样间质细胞，最后发生细胞凋亡。这对于体外操作细胞并精确模拟体内疾病和分子机制研究带来困难。因此，如何保持肝细胞在体外长期培养过程中性状稳定并与体内功能一致，是肝脏研究领域长期未解决的问题和难题。
最近一期Science报道北京大学邓宏魁教授研究组等发现利用五种小分子化合物组合处理实现在体外长期培养肝细胞时稳定保持其功能的新方法。该研究首先从比较新鲜分离的人原代肝细胞与培养24小时后的肝细胞转录表达谱入手，发现体外培养24小时后肝细胞基因表达即发生变化，有15个主要的肝功能相关基因被下调达10倍。同时TGF-信号通路被上调，提示原代肝细胞体外培养24小时即触发启动上皮-间质转化程序，推动细胞命运改变，正常肝细胞功能走向丧失。通过随后加入TGF-小分子抑制剂SB431542可以保持一定的上皮细胞性状，但仍不能阻止肝功能相关基因表达被下调，提示仍存在其它负向调控肝细胞稳定的信号。研究组继续通过小分子药物筛选，最终发现在体外培养液中加入五种化合物组合：FSK、SB43、DAPT、IWP2和LDN193189，可以很好地延长培养时间至四周，在此期间并有效保持肝细胞极性性状和肝功能相关基因的稳定表达。这五种化合物分别为cAMP激动剂、TGF-抑制剂、Notch抑制剂、Wnt抑制剂和BMP抑制剂，这些信号通路主要涉及肝细胞细胞转化、增殖等过程，而抑制剂的加入可能模拟体内微环境中所释放信号的综合效应，达到维持肝细胞稳态的作用。
这种化合物组合稳定的体外培养原代肝细胞可以用来进一步进行体外肝脏功能及机制研究。作者首先验证了肝细胞药物的解毒功能，发现肝细胞解毒特异酶CytochromeP450家族成员都保持了与新鲜肝细胞同等的药物代谢活性。
除此之外，研究组发现这些延长培养的肝细胞持续稳定表达乙肝病毒HBV受体蛋白NTCP，提示其可作为研究HBV感染的体外模型。HBV感染是我国肝炎和肝癌发生的主要原因，但是由于HBV感染具有严格的种属特异性，使得包括小鼠在内的动物模型并不能感染人HBV，这是长期以来人HBV病毒感染基础研究的障碍。该研究中，作者通过利用HBV感染证明这些稳定培养的肝细胞可以准确模拟体内HBV感染进程。除此之外，西方人群中较常见的丙肝病毒HCV感染也可以在这些细胞中有效进行，并且当用抗HCV病毒药物daclatasvir处理时，肝细胞可以对药物做出反应。
该项研究首次发现了五种小分子化合物组合应用可以有效延长原代肝细胞体外培养时间并保持其生物学功能稳定，在时间上和功能上均保证了其作为体外模拟病毒感染模型的可行性。这对于探索病毒感染机制具有重要意义，也将为大规模抗病毒药物筛选提供新方法。未来这项体外延长培养的肝细胞是否可应用于其它肝脏疾病体外模拟、干预和基因操作等分子研究，值得进一步探索。
原文链接：专家点评Science | 小分子，大作为：邓宏魁/卢实春/袁正宏合作团队突破人肝细胞体外长期培养瓶颈
