前期工作中,山东大学孙金鹏教授与中国科学院生物物理研究所王江云教授研究团队针对受体与arrestin相互作用的磷酸化编码机制展开了一系列的研究工作,发现了GPCR磷酸化编码机制,创新性的提出了受体磷酸化的"笛子模型"理论(Nat Commun6, 8202 (2015)。基于"笛子模型"的理论基础,该合作团队进一步揭示了GPCR 磷酸化编码别构调控SH3 domain 蛋白的多聚脯氨酸码头分选机制(Nat Chem Biol 14, 876-886 (2018))。最近该合作团队结合晶体学、DeSiPher和BRET 等多种技术手段,检测了GPCR单个磷酸化位点缺陷可引起arrestin 远端功能结构域产生不同的构象变化,并发现了其与arrestin生物学功能的相关性(Nat Commun12, 2396 (2021))。
为捕获GPCR 调控下游蛋白arrestin 的构象状态分布,王江云研究团队和山东大学基础医学院孙金鹏教授研究团队、清华大学陈春来教授研究团队通力合作,经过多年的努力,于2021年5月31日在《Chemical Science》在线发表了题为"Single-molecule FRET and conformational analysis of β-arrestin-1 through genetic code expansion and Se-Click reaction"的研究论文,本研究团队利用基因密码扩展技术选择特异性的将非天然氨基酸SeF插入到arrestin的特定位点,然后将荧光染料Bodipy593 特异性标记到SeF,从而实现将 Bodipy593 在arrestin 上的定点标记作为受体,同时本研究团队在arrestin 的特异位点插入了CCPGCC 用以标记FlAsH-EDT2来作为供体,借助清华大学TRIF 荧光显微镜平台,通过点击反应进行单分子FRET 检测磷酸化GPCR 调控arrestin的不同构象状态分布。

Se-Click 和smFRET检测磷酸化GPCR 调控arrestin 构象变化及状态分布
该方法创新性的利用基因密码子扩展技术将非天然氨基酸SeF整合到arrestin的特定位点,通过取代反应实现了高效率、特异性标记Bodipy593,标记后的SeF-Bodipy593相比较Bodipy593出现了47 nm 的红移,更能降低信号的背景噪音。相比传统的Cy3-Cy5标记方法,避免了arrestin 蛋白中的所有Cysteine 突变, SeF-Bodipy593和FlAsH 以更短的linker 实现了染料对蛋白的特异性标记,更容易精准的检测出arrestin 在激活前后微小的构象变化及其状态分布。
中国科学院天津工业生物技术研究所助理研究员韩明杰、山东大学基础医学院博士研究生贺庆涛和清华大学博士杨梦铱为本论文共同第一作者,王江云研究员、孙金鹏教授和陈春来教授为本论文共同通讯作者。
该项工作得到了科技部重点研发计划、国家****科学基金和国家自然科学基金等多项基金的资助与支持。
文章链接: https://doi.org/10.1039/D1SC02653D
(供稿:王江云研究组)
