猪既是重要的家畜，也是重要的实验动物，在基础研究、人类疾病模型、异种器官移植等领域用途广泛。针对家畜胚胎上胚层多能干细胞建系困难，传代次数短，难以承受多次基因编辑操作等国际难题, 中国农业大学韩建永团队联合四川农业大学、中国科学院动物研究所、中国科学院北京基因研究所、东北农业大学等单位，以猪为模式生物，开展了联合科技攻关，取得家畜胚胎干细胞领域的重大突破。
研究人员从早期胚胎多能性发育调控分子机制入手，攻克猪早期胚胎单细胞分离技术, 首次绘制了猪胚胎第0-14天（完整的附植前阶段）高质量单细胞转录组图谱, 解析了猪上胚层多能性状态 (初始态、中间态和激发态) 变化及调控的分子机制；基于单细胞数据, 创制了猪原肠化前上胚层多能干细胞 (pgEpiSCs) 培养体系, 成功建立15株细胞系, 细胞维持上胚层多能性状态, 具有典型干细胞特征, 最长传代次数超过260代，是目前世界上已报道传代次数最多的大动物干细胞系；对pgEpiSCs进行了Hi-C, ChIP-seq, ATAC-seq等多组学联合分析，从三维基因组层面发现pgEpiSCs具有较强的组织分化能力, 鉴定了75个在pgEpiSCs中具有重要功能的转录因子, 为后续猪多能干细胞调控机制研究奠定了重要基础；通过对pgEpiSCs进行3次不同方式基因编辑，包括随机插入、CRISPR/Cas9介导的定点插入以及单碱基编辑器介导的碱基C到T置换, 并以经过三次基因编辑的干细胞系为供体细胞, 通过核移植技术，获得来源于pgEpiSCs、出生存活的基因编辑克隆猪（图2），解决了家畜干细胞难以承受长周期、多次基因编辑的国际难题。
图1 稳定的猪胚胎原肠化前上胚层干细胞系 (pgEpiSCs) 建立及其特征分析
图2 体外稳定传代的猪上胚层干细胞（左）及经过1次（右上）和3次（右下）基因编辑干细胞克隆猪
该成果具有广阔的应用前景：
一是在生命科学基础研究领域，作为一种全新的、稳定的猪胚胎多能干细胞系，pgEpiSCs成功建系开创了家畜多能干细胞研究的新方向。与小鼠相比，猪的胚胎发育和人类更加相似, 猪的胚胎干细胞是研究人类胚胎发育更为理想的细胞模型。通过猪、人、小鼠等不同物种的多能干细胞比较，能够发现干细胞多能性维持的物种间差异性和统一性, 为异种器官移植等再生医学研究提供理论依据。
二是在细胞培养肉领域，pgEpiSCs可作为未来细胞培养等基于细胞的功能性产品的种子细胞。目前细胞培养肉研制的种子细胞多为肌肉和脂肪细胞的祖细胞, 并不具有长期传代增殖能力，成为体外大规模生产细胞培养肉的技术瓶颈。pgEpiSCs能够在体外长期稳定传代, 通过体外大规模培养, 获得大量初始细胞, 再通过定向诱导分化获得肌肉细胞和脂肪细胞，可以解决“种子细胞”传代时间短等细胞培养肉的技术难题。
三是在医学模式动物研究领域，pgEpiSCs与基因编辑结合, 可用于构建人类疾病模型或抗病猪模型。传统的基于体细胞基因编辑和克隆的技术囿于体细胞难以耐受多次基因编辑, 难以同时获得多基因编辑克隆家畜, 通常需要采用重复性克隆（re-cloning）和重新分离成纤维细胞, 达到多基因编辑的目的，周期短，效率低。实验证实猪上胚层多能干细胞对基因编辑有很好的耐受性，至少可以耐受三次连续的基因编辑, 这将大大缩短获得多基因编辑克隆猪的时间和成本。
四是在家畜优良品种培育领域，pgEpiSCs通过定向诱导分化为精子和卵母细胞可以实现干细胞育种。胚胎干细胞可以在体外诱导完成配子发育的整个过程, 形成有功能的精子或卵母细胞。将干细胞与基因组测序和基因组选择等技术结合, 再通过体外生殖细胞诱导和体外受精, 获得子代胚胎, 结合基因组选择技术，可以在实验室中完成优良家畜胚胎的批量生产和精准选择，实现家畜干细胞育种，可显著缩短世代间隔和提高选择强度, 快速获得30~40倍的遗传增益,实现重要经济性状的快速遗传改良。
该研究受到国家重点研发计划（2016YFA0100202）、高层次人才计划等项目资助, 中国农业大学生物学院博士生郅明雷、张金颖, 四川农业大学唐茜子教授, 中国农业大学动物科技学院高帅副教授, 中国科学院动物研究所余大为博士为本文共同第一作者, 中国农业大学生物学院韩建永教授, 四川农业大学李明洲教授, 中国科学院北京基因组研究所郑彩宏博士, 东北农业大学刘忠华教授为本文的共同通讯作者。云南农业大学魏红江教授和中国科学院动物研究所周琪研究员为资深作者。
全文链接：https://www.nature.com/articles/s41422-021-00592-9
供稿：生物学院
供图：生物学院
编辑：马文哲
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